Fabbricazione di chip micro-patterned con spessore controllato per microscopia elettronica criogenica ad alta produttività

La microscopia elettronica criogenica (cryo-EM) è stata sviluppata per risolvere la struttura tridimensionale (3D) delle proteine nel loro stato nativo 1,2,3,4. La tecnica prevede il fissaggio di proteine in uno strato sottile (10-100 nm) di ghiaccio vitreo e l’acquisizione di immagini di proiezione di proteine orientate casualmente utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione (TEM), con il campione mantenuto a temperatura di azoto liquido. Migliaia o milioni di immagini di proiezione vengono acquisite e utilizzate per ricostruire una struttura 3D della proteina mediante algoritmi computazionali ^5,6. Per un’analisi di successo con crio-EM, la preparazione del criocampione è stata automatizzata congelando a immersione l’apparecchiatura che controlla le condizioni di blotting, l’umidità e la temperatura. La soluzione campione viene caricata su una griglia TEM con una membrana di carbonio bucato, successivamente cancellata per rimuovere la soluzione in eccesso, e quindi congelata a immersione con etano liquido per produrre ghiaccio sottile e vitreo ^1,5,6. Con i progressi nella crio-EM e l’automazione della preparazione del campione⁷, il cryo-EM è stato sempre più utilizzato per risolvere la struttura delle proteine, comprese le proteine dell’involucro per i virus e le proteine del canale ionico nella membrana cellulare ^8,9,10. La struttura delle proteine dell’involucro delle particelle virali patogene è importante per comprendere la patologia dell’infezione virale, nonché per sviluppare il sistema di diagnosi e i vaccini, ad esempio SARS-CoV-2¹¹, che ha causato la pandemia di COVID-19. Inoltre, le tecniche crio-EM sono state recentemente applicate alle scienze dei materiali, come per l’imaging di materiali sensibili al fascio utilizzati nelle batterie ^12,13,14 e nei sistemi catalitici ^14,15 e l’analisi della struttura dei materiali inorganici nello stato di soluzione¹⁶.

Nonostante i notevoli sviluppi nella crio-EM e nelle tecniche pertinenti, esistono limitazioni nella preparazione del criocampione, ostacolando l’analisi della struttura 3D ad alto rendimento. Preparare un film di ghiaccio vitreo con spessore ottimale è particolarmente importante per ottenere la struttura 3D di materiali biologici con risoluzione atomica. Il ghiaccio deve essere abbastanza sottile da ridurre al minimo il rumore di fondo degli elettroni dispersi dal ghiaccio e da vietare sovrapposizioni di biomolecole lungo il percorso del fascio di elettroni ^1,17. Tuttavia, se il ghiaccio è troppo sottile, può causare l’allineamento delle molecole proteiche negli orientamenti preferiti o la denaturazione 18,19,20. Pertanto, lo spessore del ghiaccio vitreo dovrebbe essere ottimizzato in base alle dimensioni del materiale di interesse. Inoltre, è in genere necessario un grande sforzo per la preparazione del campione e lo screening manuale dell’integrità del ghiaccio e delle proteine sulle griglie TEM preparate. Questo processo richiede molto tempo, il che ne ostacola l’efficienza per l’analisi della struttura 3D ad alto rendimento. Pertanto, i miglioramenti nell’affidabilità e nella riproducibilità della preparazione del campione crio-EM migliorerebbero l’utilizzo del crio-EM nella biologia strutturale e nella scoperta di farmaci commerciali, nonché per la scienza dei materiali.

Qui, introduciamo processi di microfabbricazione per la realizzazione di un chip micro-modellato con finestre di ossido di grafene (GO) progettate per crio-EM ad alto rendimento con spessore di ghiaccio controllato²¹. Il chip micro-modellato è stato fabbricato utilizzando tecniche di sistema microelettromeccanico (MEMS), che possono manipolare la struttura e le dimensioni del chip a seconda degli scopi di imaging. Il chip micro-modellato con finestre GO ha una struttura a micro pozzetto che può essere riempita con la soluzione campione e la profondità del microwell può essere regolata per controllare lo spessore del ghiaccio vitreo. La forte affinità di GO per le biomolecole aumenta la concentrazione di biomolecole per la visualizzazione, migliorando l’efficienza dell’analisi della struttura. Inoltre, il chip micro-modellato è composto da un telaio Si, che fornisce un’elevata stabilità meccanica per la griglia¹⁹, rendendolo ideale per la gestione del chip durante le procedure di preparazione del campione e l’imaging crio-EM. Pertanto, un chip micro-modellato con finestre GO fabbricate con tecniche MEMS fornisce affidabilità e riproducibilità della preparazione del campione crio-EM, che può consentire un’analisi della struttura efficiente e ad alto rendimento basata su cryo-EM.