التربية الجماعية والدراسات الجزيئية في حشرات آفات Tortricidae
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة تربية حشرات الآفات التورتسيد في المختبرات. يتم تحديد إجراءات التمييز بين جنس الحشرات واستخراج الأحماض النووية لتسلسل الإنتاجية العالية باستخدام آفتين ممزقتين.
Abstract
Tortricidae (Lepidoptera) ، المعروف باسم tortrix أو عث الأسطوانة الورقية ، يضم العديد من الآفات الزراعية والحرجية ، والتي تسبب خسائر زراعية خطيرة. لفهم بيولوجيا عث الآفات هذه ، كان هناك طلب كبير على التقنيات الأساسية. هنا ، يتم تطوير طرق للتربية الجماعية والملاحظات والدراسات الجزيئية باستخدام اثنين من تورتريكس الشاي ، Homona magnanima و Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae). تم تربية الحشرات على نطاق واسع مع نظام غذائي اصطناعي شرائح والحفاظ عليها عن طريق زواج الأقارب لأكثر من 100 جيل من خلال النظر في خصائصها البيولوجية. الحشرات لديها إزدواج الشكل الجنسي المختلفة. وبالتالي من الصعب التمييز بين الجنس خلال مراحل النمو ، والتي حالت دون إجراء فحوصات لاحقة. وأبرز هذا العمل أنه يمكن تحديد جنس يرقات التورتريسيدات من خلال مراقبة الخصيتين أو تلطيخ أورسين اللاكتيك – الخليك لتصور كروموسوم W الخاص بالإناث. علاوة على ذلك ، باستخدام طرق تحديد الجنس ، مكنت هذه الدراسة من استخراج الأحماض النووية من الأجنة المحددة جنسيا وتطبيقها نحو تسلسل الإنتاجية العالية. هذه النصائح قابلة للتطبيق على حشرات الآفات الأخرى وستسهل المزيد من الدراسات المورفولوجية والجينية.
Introduction
تمثل حشرات Lepidopteran أكثر من 10٪ من جميع الأنواع الحية الموصوفة1 ، وتسبب بعض أنواع الأنواع أضرارا جسيمة للنباتات وخسائر زراعية خطيرة 2,3. على الرغم من أن الدراسات الجزيئية والجينية قد تم تطويرها باستخدام الحشرات النموذجية مثل دودة القز Bombyx mori4,5 ، إلا أن حشرات الآفات لا تزال غير محققة ، ويرجع ذلك جزئيا إلى صعوبات تربية ومناولة 6,7. لذلك ، فإن الدراسات والتقنيات الأساسية ضرورية لفهم بيولوجيا حشرات الآفات غير النموذجية هذه.
يضم Tortricidae (Lepidoptera) ، المعروف باسم tortrix أو عث أسطوانة الأوراق ، العديد من الآفات الزراعية والحرجية8. من بين أنواع الحشرات ، فإن تورتريكس الشاي الشرقي Homona magnanima Diakonoff و tortrix الفاكهة الصيفية Adoxophyes honmai Yasuda هي آفات polyphagous خطيرة معروفة بإتلاف أشجار الشاي في شرق آسيا7. يضع النوعان مجموعات بيض مسطحة وبيضاوية تشبه المقياس (أو كتل البيض) تتكون من بيض رقيق وناعم وهش تغطيه إفرازات الأمهات. على الرغم من أن مراحل التكوين الجنيني حاسمة لتطور الحشرات وتحديد الجنس9 ، إلا أن هياكل البيض تمنع إجراء مزيد من التحليل من فهم بيولوجيا الحشرات. من المهم التغلب على الصعوبات لإجراء مزيد من الدراسة حول الآفات التي تبيض مثل هذه الكتلة البيضاء المعقدة.
هنا ، لفهم بيولوجيا tortricids ، تم تطوير طرق للتربية الجماعية ، والملاحظات ، والدراسات الجزيئية باستخدام A. honmai و H. magnanima. أولا ، تحافظ طرق التربية الجماعية على كل من tortricids على مدى 100 جيل عن طريق التنشئة. وقد سهل فصل البيض عن كتلة البيض المتسلسلة الشبيهة بالمقياس مراقبة التكوين الجنيني للتورتريسيدات باستخدام المذيبات القلوية والعضوية التي تم تطويرها سابقا من التقنيات المستخدمة في الذباب10. بالإضافة إلى ذلك ، أثبتت هذه الدراسة التمييز الجنسي للأجنة الصغيرة من خلال تطوير طرق تلطيخ الكروماتين الجنسي للإناث lepidopteran باستخدام orcein اللاكتيك الخليك11. من خلال الجمع بين هذه الطرق ، تم استخراج الأحماض النووية عالية الجودة والكمية من الأجنة المحددة للجنس ، والتي كان من الصعب تأسيسها6. تم استخدام الحمض النووي الريبي المستخرج لتسلسل الجيل التالي. بشكل جماعي ، تنطبق الطرق المعروضة هنا على حشرات lepidopteran الأخرى وأنواع الحشرات الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
يضم Tortricid العديد من الآفات الزراعية والحرجية. قدمت هذه الدراسة طرقا لتربية التورتريكس على مر الأجيال، ومراقبة التكوين الجنيني وجنس الحشرات، وإجراء التحليل الجزيئي باستخدام الأجنة الناضجة.
واحدة من العقبات التي تحول دون دراسة الحشرات الآفات هي إنشاء طرق التربية. على وجه ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون الاعتراف بالدعم المقدم من زمالات أبحاث الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) للعلماء الشباب [رقم المنحة 19J13123 و 21J00895].
Materials
| 1/2 ounce cup | FP CHUPA | CP070009 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010417/ |
| 1/2 ounce cup lid | FP CHUPA | CP070011 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether |
| 99.7% acetic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 36289 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument |
| Agilent RNA6000 nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG |
| benzalkonium chloride solution | Nihon Pharmaceutical Co., Ltd | No.4987123116046 | Sterilization; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html |
| Cotton | AOUME | 8-1611-02 | insect rearing; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1 |
| DAPI solution | Dojindo, Tokyo, Japan | 340-07971 | stainings; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/ |
| Disodium Hydrogenphosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html |
| dsDNA HS quantification kit | Invitrogen | Q33231 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230 |
| Econospin RNA II column | Epoch Life Science Inc. | EP-11201 | RNA extraction; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx |
| Ethanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Tetrasodium Salt Tetrahydrate (4NA) | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html |
| Glassine paper | HEIKO | 2100010 | insect rearing; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla& utm_medium=cpc&utm_source= Adw |
| heat block WSC-2620 PowerBLOCK | ATTO, Tokyo, Japan | 4002620 | incubation; https://www.attoeng.site/ |
| heptane | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html |
| INSECTA LF | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| ISOGENII | Nippon Gene | 311-07361 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html |
| isopropanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | nucleic acids extraction; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html |
| Lactic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html |
| methanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html |
| MSV-3500 vortex | Biosan | BS-010210-TAK | Voltex mixer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/ |
| Nano Photometer NP 80 | Implen | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/ |
| Natural pack wide | Inomata chemical | 1859 | insect rearing; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3%82%A4%E3%83%89 |
| NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7770S | Library preparation; https://www.nebj.jp/products/detail/2039 |
| orcein | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html |
| Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 160-16061 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html |
| Portable UV Black Light (4W, 365nm wavelength) | Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan | not shown | Insect collection; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328 |
| Potassium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen, MA, USA | P36965 | antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965 |
| Proteinase K Solution | Merck | 71049-4CN | DNA extraction; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049 |
| protein precipitation solution | Qiagen | 158912 | DNA extraction; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC |
| Qubit V4 | Invitrogen | Q33238 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238 |
| rifampicin | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html |
| RNA HS quantification kit | Invitrogen | Q32855 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852 |
| RNase solution | Nippon Gene | 313-01461 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html |
| Silk Mate 2S | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| Sodium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html |
| Sodium Dodecyl Sulfate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html |
| sodium hypochlorite aqueous solution | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | egg separation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html |
| Tetracycline Hydrochloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html |
| Tris-HCl | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html |
| ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977023 | RNA extraction; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015 |
References
- Gaston, K. J. The magnitude of global insect species richness. Conservation Biology. 5 (3), 283-296 (1991).
- Pogue, M. A world revision of the genus Spodoptera Guenée (Lepidoptera: Noctuidae). Memoirs of the American Entomological Society. 43, 1 (2002).
- Matsuura, H., Naito, A. Studies on the cold-hardiness and overwintering of Spodoptera litura F. (Lepidoptera: Noctuidae): VI. Possible overwintering areas predicted from meteorological data in Japan. Applied Entomology and Zoology. 32 (1), 167-177 (1997).
- Mita, K., et al. The construction of an EST database for Bombyx mori and its application. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 14121-14126 (2003).
- Kawamoto, M., et al. High-quality genome assembly of the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 107, 53-62 (2019).
- Fukui, T., et al. In vivo masculinizing function of the Ostrinia furnacalis Masculinizer gene. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (3), 1768-1772 (2018).
- Arai, H., Ishitsubo, Y., Nakai, M., Inoue, M. N. A simple method to disperse eggs from lepidopteran scale-like egg masses and to observe embryogenesis. Entomological Science. 25 (1), 12497 (2022).
- vander Geest, L. P., Evenhuis, H. H. . Tortricid pests: their biology, natural enemies and control. , (1991).
- Kiuchi, T., et al. A single female-specific piRNA is the primary determiner of sex in the silkworm. Nature. 509 (7502), 633-636 (2014).
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 40 (11), 792-804 (2010).
- Kageyama, D., Traut, W. Opposite sex-specific effects of Wolbachia and interference with the sex determination of its host Ostrinia scapulalis. Proceedings of the Royal Society B. 271 (1536), 251-258 (2004).
- Arai, H., Lin, S. R., Nakai, M., Kunimi, Y., Inoue, M. N. Closely related male-killing and nonmale-killing Wolbachia strains in the oriental tea tortrix Homona magnanima. Microbial Ecology. 79 (4), 1011-1020 (2020).
- Schalamun, M., et al. Harnessing the MinION: An example of how to establish long-read sequencing in a laboratory using challenging plant tissue from Eucalyptus pauciflora. Molecular Ecology Resources. 19 (1), 77-89 (2019).
- Winnebeck, E. C., Millar, C. D., Warman, G. R. Why does insect RNA look degraded. Journal of Insect Science. 10 (1), 159 (2010).
- Ivey, C. T., Carr, D. E., Eubanks, M. D. Effects of inbreeding in Mimulus guttatus on tolerance to herbivory in natural environments. Ecology. 85 (2), 567-574 (2004).
- Saccheri, I., et al. Inbreeding and extinction in a butterfly metapopulation. Nature. 392 (6675), 491-494 (1998).
- Crnokrak, P., Roff, D. A. Inbreeding depression in the wild. Heredity. 83 (3), 260-270 (1999).
- Keller, L. F., Waller, D. M. Inbreeding effects in wild populations. Trends in Ecology & Evolution. 17 (5), 230-241 (2002).
- Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell. Journal of Cell Science. 43 (1), 1-35 (1980).
- Sugimoto, T. N., Ishikawa, Y. A male-killing Wolbachia carries a feminizing factor and is associated with degradation of the sex-determining system of its host. Biology Letters. 8 (3), 412-415 (2012).
