Microscopía intravital de fluorescencia de campo ancho de la microcirculación pulmonar en la lesión pulmonar aguda experimental utilizando un sistema de imágenes estabilizado por vacío

La microscopía intravital (IVM) es una herramienta de imagen útil para visualizar y estudiar diversos procesos biofísicos in vivo. El pulmón es muy difícil de obtener imágenes in vivo debido a su ubicación cerrada, la naturaleza frágil de su tejido y los artefactos de movimiento inducidos por la respiración y los latidos del corazón ^1,2. Se han desarrollado varias configuraciones de microscopía intravital (IVM) para obtener imágenes en tiempo real de las interacciones leucocitarios-endoteliales en la microcirculación pulmonar para superar estos desafíos. Tales enfoques se basan en exponer quirúrgicamente y estabilizar el pulmón para obtener imágenes.

Los animales generalmente se preparan para la IVM pulmonar mediante procedimientos quirúrgicos. En primer lugar, los animales son intubados y ventilados, lo que permite la escisión quirúrgica de una ventana torácica y las intervenciones posteriores para estabilizar el pulmón para la obtención de imágenes. Una técnica consiste en pegar el parénquima en una cubierta de vidrio³, un procedimiento que corre el riesgo de un trauma físico significativo en el tejido fotografiado. Más avanzada es la utilización de un sistema de vacío para estabilizar el pulmón bajo una ventana de vidrio⁴. Esta configuración facilita la adherencia suelta de la superficie pulmonar a la cubierta a través de un vacío reversible extendido sobre una gran área local y expande el pulmón al tiempo que limita el movimiento en las dimensiones x, y y z⁴. El vacío se aplica uniformemente a través de un canal que rodea el área de imagen de la configuración y tira del tejido hacia una región cónica poco profunda frente al cobertor de grado de imagen⁴. A través de esta ventana de visualización, la microcirculación pulmonar se puede estudiar utilizando varias modalidades de imágenes ópticas.

La IVM pulmonar permite la obtención de imágenes cuantitativas de una multitud de parámetros microcirculatorios. Estos incluyen mediciones como la velocidad y longitud^de la pista de leucocitos 5, la velocidad del flujo de glóbulos rojos⁶ y la oxigenación⁷, las metástasis tumorales⁸, la distinción de las subpoblaciones de células inmunes ^9,10,11, la visualización de micropartículas¹², la dinámica alveolar ^13,14, la permeabilidad vascular¹⁵ y la función capilar ¹⁶ . El enfoque aquí está en el reclutamiento de leucocitos y la función capilar. El inicio del reclutamiento de leucocitos en la microcirculación pulmonar implica interacciones transitorias de rodadura e interacciones adhesivas firmes entre leucocitos y células endoteliales, las cuales se incrementan en condiciones inflamatorias^16,17. Típicamente, el laminado se cuantifica por el número de leucocitos que pasan por una línea de referencia definida por el operador, mientras que la adhesión se cuantifica por el número de leucocitos que están inmóviles en el endotelio¹⁶. La función capilar también puede verse afectada en estados inflamatorios, lo que a menudo resulta en una disminución de la perfusión. Esto se puede atribuir a varios factores, incluida una reducción de la deformabilidad de los glóbulos rojos¹⁸ y la expresión abigarrada de la NO sintasa inducible por las células endoteliales que resulta en una derivación patológica¹⁹. Por lo general, la longitud agregada de los capilares perfundidos por área se mide y se informa como densidad capilar funcional (FCD).

El estudio del reclutamiento de leucocitos en los pulmones en tiempo real requiere el etiquetado de objetivos biológicos con colorantes fluorescentes o anticuerpos marcados con fluorescentes²⁰. Alternativamente, varias cepas de ratones transgénicos como los ratones de la proteína fluorescente M-green lisozima (LysM-GFP) se pueden utilizar para obtener imágenes de subconjuntos específicos de células inmunes como los neutrófilos^21,22. Los leucocitos marcados con fluorescentes se pueden visualizar utilizando microscopía de fluorescencia de campo amplio, microscopía confocal o microscopía multifotónica. Estas técnicas logran el contraste mediante la utilización de longitudes de onda de excitación específicas y la detección de la fluorescencia emitida, al tiempo que bloquean la detección de la longitud de onda de excitación, destacando así el objeto etiquetado.

La investigación existente sobre la cuantificación del laminado de leucocitos, la adhesión y la densidad capilar funcional en el pulmón murino se ha basado principalmente en el análisis manual de video. Esto es posible gracias al software de código abierto como Fiji ^6,23, el software propietario como CapImage¹² o los sistemas de procesamiento de imágenes personalizados²⁴. Por el contrario, varias plataformas de software propietario (por ejemplo, NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) permiten la medición automatizada de una amplia gama de otros parámetros fisiológicos, incluidos muchos de los mencionados anteriormente aquí 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.

Se han realizado observaciones importantes con respecto a la patología de la lesión pulmonar aguda (ALI) y el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) utilizando la IVM pulmonar. El SDRA se caracteriza por una serie de procesos fisiopatológicos en el pulmón, incluyendo edema pulmonar y daño alveolar causado por la disfunción del endotelio y la barrera epitelial²⁵. Utilizando un modelo murino, se ha encontrado que la ALI inducida por sepsis se asocia con cambios perjudiciales significativos en el tráfico de células inmunes en el entorno pulmonar²⁶. Se encontró que los neutrófilos reclutados en los capilares de ratones con ALI inducida por sepsis impiden la microcirculación, lo que aumenta la hipoxia en ALI²⁶. Además, la IVM se ha utilizado para obtener información sobre el mecanismo subyacente de reparación después de la aparición del SDRA²⁷. La MIV pulmonar también ha sido una herramienta valiosa para comprender los cambios fisiopatológicos en diversas enfermedades pulmonares obstructivas. Por ejemplo, la visualización del transporte de moco en enfermedades como la fibrosis quística (FQ) y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) ha facilitado el estudio de tratamientos novedosos y existentes para el aclaramiento mucoso²⁸. También se ha analizado el tráfico de leucocitos en estas condiciones¹⁷.

Este protocolo amplía el enfoque descrito inicialmente por Lamm et ^al.29 para estudiar las interacciones leucocitarios-endoteliales mediante microscopía de fluorescencia convencional. Los procedimientos descritos emplean un sistema de imágenes pulmonares in vivo , que incluye una base metálica de 16,5 cm x 12,7 cm, un micromanipulador y una ventana de imágenes al vacío (Figura 1). El sistema está montado en una plataforma impresa en 3D de 20 cm x 23,5 cm (Archivo suplementario 1) para proporcionar una fijación segura para el tubo del ventilador y la almohadilla térmica. Este método ofrece imágenes reproducibles y cuantificables de la microcirculación pulmonar murina in vivo. Los aspectos importantes de la preparación quirúrgica, así como la utilización adecuada de un sistema de imágenes pulmonares estabilizadas al vacío se explican en detalle. Finalmente, se utiliza un modelo experimental de ALI para proporcionar imágenes representativas y análisis de la alteración del laminado de leucocitos, la adhesión leucocitaria y la perfusión capilar asociada con la inflamación. El uso de este protocolo debería facilitar otras investigaciones importantes sobre los cambios fisiopatológicos en la microcirculación pulmonar durante los estados de enfermedad aguda.