Schrotflinten-Lipidomik von Nagetiergewebe

Obwohl Fortschritte bei MS eine Vielzahl von Methoden zur genauen Überwachung vieler Lipidspezies hervorgebracht haben, zeigte das bisherige Lipidprofiling verschiedener Säugetiergewebe keine konsistenten Ergebnisse, so dass die besonderen gewebespezifischen Funktionen von Lipiden unklar bleiben. Im Vergleich zur Proteinfunktionsanalyse, für die robustere Ansätze zur Verfügung stehen, um die Expression bestimmter Verbindungen auszuschalten, kann die Mehrheit der Lipide nicht selektiv ausgeschaltet oder im Gewebe überexprimiert werden, was die funktionelle Bewertung von Lipiden erschwert. Die fortgeschrittene Profilierung von Gewebelipidomkonzentrationen kann einen alternativen Ansatz bieten, um Zusammenhänge zwischen zirkulierenden Lipiden und menschlichen Krankheiten zu identifizieren.

Bei der Evaluierung umfassender Lipidomik-Methoden, die in der Lage sind, das endogene Lipidprofil jedes Mausgewebes qualitativ und quantitativ abzudecken, haben wir der Shotgun-Lipidomics-Methode den Vorzug gegeben. Im Allgemeinen sind zwei gegensätzliche Arten der Probenanalyse möglich: entweder ein völlig ungezieltes Screening von Lipiden mittels flüssigchromatographischer (LC)-basierter Trennung mit weiterer massenspektrometrischer Detektion, um die Gesamtlipidkomplexität der Probe aufzudecken, oder gezielte Ansätze, die meist eine sehr genaue Quantifizierung spezifischer Lipide von Interesse ermöglichen. Im Gegensatz dazu ist das starke Merkmal des vorgestellten Shotgun-Lipidomics-Workflows die schnelle und umfassende Abdeckung von Hunderten von endogenen Lipiden aus vordefinierten Lipidklassen, die immer noch in einer robusten semi-quantitativen Weise durchgeführt werden können.

Die Ionisationseffizienzen verschiedener Lipidklassen sind strukturabhängig und können in Abhängigkeit von den verschiedenen experimentellen Ionisationsbedingungen drastisch variieren. Im Gegensatz zu LC-basierten Trennverfahren minimiert die Schrotflintenanalyse diese Unterschiede durch die direkte gleichzeitige Infusion des gesamten Lipidextrakts unter den gleichen Ionisationsbedingungen in das MS-Gerät. Die Verwendung von isotopenmarkierten Lipidanaloga oder strukturell ähnlichen nicht-endogenen Standards ermöglicht die semi-Quantifizierung aller Lipidklassen. Die Shotgun-Lipidomik bietet eine geringe Variabilität zwischen und innerhalb des Laufs während der MS-Analyse. Infolgedessen erzeugt diese Methode niedrigere Variationskoeffizienten²¹ als ungezielte Flüssigchromatographie-basierte Methoden, die mehrere Standards für eine angemessene Quantifizierung erfordern. Wichtig ist, dass, obwohl in der aktuellen Methode keine externe Kalibrierkurve verwendet wird, die Methode immer noch als vollständig quantitativ^{angesehen wird 32}.

Für die Quantifizierung der meisten Lipide ist ein markierter interner Standard (oder ein nicht markierter Standard, der nicht endogen exprimiert wird) pro Lipidklasse ausreichend. Nur wenige Publikationen berichten über eine partielle Methodenvalidierung für eine Shotgun-Lipidomics-Methode. Zum Beispiel wurden in Gryzbek et ^al.17 und Surma et ^al.21 umgekehrte Kalibrierkurven unter Verwendung interner Standards und einer festen Menge an Probenmatrix erstellt. Die Linearität wurde durch die lineare Regression der logarithmisch transformierten Lipidmengen und ihrer Intensitäten bewertet und als R² bzw. Steigung angegeben. Die Nachweisgrenze (LOD) und die Bestimmungsgrenze (LOQ) wurden durch gewichtete lineare Regression auf der Grundlage eines Signal-Rausch-Verhältnisses von 3 für LOD und 10 für LOQ bestimmt. Für die meisten Lipidklassen wurde die LOQ zwischen 2-9,8 pmol für Fettgewebe und 0,05-5 μM im Plasma definiert. In beiden Fällen wurden nicht-endogene interne Einzelstandards pro Klasse verwendet, um Schätzungen für alle Lipide in der Klasse abzuleiten. In dieser Arbeit stellen wir jedoch aufgrund mehrerer Bedenken keine LOD/LOQ zur Verfügung: Die endogene Matrix ist nicht verbindungsfrei und die Surrogatmatrix für Gewebe ist nicht verfügbar – damit ist die Spitze kleiner bekannter Mengen von Standards nicht möglich. Wir führen keinen klassischen gezielten Quantifizierungsansatz mit der Verwendung einer Kalibrierkurvenreihe einer bestimmten Verbindung durch, die durch ihren identischen isotopenmarkierten Standard normiert wird, da es keine reinen Standards gibt und die Verfügbarkeit isotopenmarkierter Lipide sehr begrenzt ist. Orbitrap-Detektoren führen automatisch die Umwandlung des transienten Signals durch, indem sie eine Fourier-Transformation anwenden, und ein Teil des Signals ist bereits substituiert – infolgedessen ist der untere Konzentrationsbereich nur linear bis zu einem minimalen Signal, unterhalb dessen das Molekül nicht mehr nachweisbar ist. Die Signal-Rausch-Werte der Xcalibur-Software hängen vom m/z-Verhältnis des Moleküls ab. Infolgedessen haben die Verbindungen jeder Lipidklasse, die unterschiedliche Kombinationen von Fettsäuren enthalten, unterschiedliche Rauschwerte. Darüber hinaus sind die LOQ/LOQ-Werte eng mit der Art der Matrix verbunden, und wenn die Quantifizierung des Lipidoms in verschiedenen Nagetiergeweben durchgeführt wird, sollte dies durch die Bewertung der LOQs für jeden Gewebetyp einzeln widergespiegelt werden.

Tatsächlich bietet die Methode einen hohen linearen dynamischen Quantifizierungsbereich von bis zu vier Größenordnungen³³ und eine sehr gute Sensitivität, um die wichtigsten endogenen Strukturlipide abzudecken, was durch technische Verbesserungen bei der MS-Erfassung³² weiter erhöht werden kann. Die Variationskoeffizienten der mittleren Lipidkonzentrationen lagen meist unter 15 %, was bedeutet, dass die Shotgun-Lipidomik den Anforderungen der Food and Drug Administration (FDA) als Methode entspricht, die für Studien zur Guten Laborpraxis (GLP) und zur Guten Klinischen Praxis (GCLP) in Betracht gezogen werden^{muss 34}.

Es muss jedoch beachtet werden, dass einige Lipidklassen aufgrund ihrer unterschiedlichen Polarität viel stärker durch den Beitrag spezifischer konjugierter FAs beeinflusst werden. Dies führt zu einer Verzerrung der Intensitätsantwort in äquimolaren Gemischen, die ein breites Spektrum konjugierter FAs enthalten, was zu einer Quantifizierungsverzerrung führt, wie von Koivusalo et ^al.35 für Phospholipidklassen hervorgehoben. Bemerkenswert ist, dass diese Autoren Daten für eine breite Palette von FAs von 24 bis 48 Kettenlängen präsentierten, die wahrscheinlich nicht die Situation in einer echten biologischen Probe widerspiegeln. Die Reaktion für mehrfach ungesättigte Spezies war 40% höher als für vollständig gesättigte Spezies, aber dieser Effekt wurde nur für höhere Konzentrationen beobachtet. Wenn das Gemisch progressiv verdünnt wurde, nahm der Effekt der Ungesättigtheit allmählich ab und verschwand praktisch bei 0,1 pmol/μl pro Spezies. Darüber hinaus wurden alle Messungen an Ionenfallen- und Dreifach-Quadrupol-Instrumenten und nicht an Q-Exactive-Geräten durchgeführt.

Ein weiterer Vorteil des vorgestellten Workflows ist seine technische Flexibilität, die eine Anpassung an spezifische Projektanforderungen ermöglicht. Zum Beispiel kann jedes Lipidextraktionsprotokoll – wie die modifizierten Bligh- und Dyer-36-, Methyl-tert-butylether-37- oder Butanol-Methanol-38-Methoden – zur Herstellung eines Gesamtlipidextrakts vor der MS-Analyse verwendet werden. Die Haupteinschränkung der Chloroform-Methanol-Extraktion besteht darin, dass die untere Phase die Lipidfraktion enthält, was die Routinearbeit und insbesondere die Automatisierung erschwert. Darüber hinaus muss die Toxizität von Chloroform berücksichtigt werden. Die Tert-Butylether-Extraktion wird häufig für die Lipidanalyse von Plasmaproben³⁷ verwendet, und eine automatisierte Version wurde vorgeschlagen²¹. In diesem Fall haben wir uns für die BUME-Methode entschieden, da sie eine noch bessere Wiederfindung für die mit Spikes dotierten PG-, PI-, PA- und PS-Lipidklassen³⁸, einen geringeren Lösungsmittelverbrauch und die Möglichkeit der Automatisierung³⁹ bietet, während die Gesamtkonzentrationen, die für die mit allen drei Methoden extrahierten Gewebeproben quantifiziert wurden, vergleichbar waren. Während die Probenextraktion in der aktuellen Arbeit manuell durchgeführt wurde, ist es auch möglich, reproduzierbare und präzise Ergebnisse aus großen Probensätzen durch automatisierte Probenvorbereitung und Lipidextraktion in einem 96-Well-Format^40,41 zu erhalten. Dies ermöglicht die Implementierung von Lipidomik-Analysen in groß angelegten klinischen und toxikologischen Studien.

In der aktuellen Arbeit haben wir die MS-Erfassung von positiven und negativen Moden getrennt ohne Polaritätswechsel durchgeführt, wie von Schuhmann et ^al.42 beschrieben. Die Stabilität des Nanomate-Signals ist im negativen Modus für eine etwas weniger konzentrierte Lösung besser als im positiven Modus. Zusätzlich haben wir ein vollständig rückverfolgbares Verfahren mit einer Konverter-Software von .raw Dateien zu mzML entwickelt, das die in der LipidXplorer-Software anzugebenden Werte bereitstellt – damit sind keine manuellen Auflösungssteilheitsberechnungen erforderlich. Wir haben auch verschiedene Substitutionen für die Rauscheinstellung vorgenommen, da im positiven Modus der Rauschpegel der Spektren höher ist als im negativen Modus. Alle Schritte wurden für rückführbare Hochdurchsatz-Routineanalysen optimiert.

Zur Identifizierung kann die Shotgun-Lipidomics-Analyse das einzigartige Verhalten verschiedener Lipidklassen ausnutzen, die einzigartige Addukte in verschiedenen Polaritätsmodi bilden. Bei diesem Verfahren können PC- und PE-Spezies mit der gleichen Molekülmasse, die sich im positiven Ionisationsmodus überlappen, im negativen Ionisationsmodus vollständig getrennt werden, da PC Acetat- oder Formiat-Addukte bildet und PE in einer deprotonierten Form ionisiert wird. Darüber hinaus ist eine (partielle) strukturelle Dekonvolution für das Verfahren möglich, wobei nicht nur die Summenformel, sondern auch die Fettsäurestruktur verwendet wird. Zum Beispiel funktioniert die FA-Identifizierung auf der Ebene des Gesamtkohlenstoffs und der Gesamtungesättigtheitszahl für alle Phospholipide, DAGs, TAGs und Lysophospholipide. Die Bottom-up-Quantifizierung jeder isomeren Form kann teilweise für einige der Phospholipidklassen⁴³ durchgeführt werden, ist jedoch für DAGs und TAGs aufgrund der ungleichen Signalantwort verschiedener FAs in den MS2-Spektren viel komplexer.

Es ist auch wichtig zu betonen, dass geeignete Qualitätskontrollverfahren eingeführt werden müssen, die vollständig auf die jüngsten Initiativen in diesem Bereich abgestimmt^{sind 44}. Um eine ordnungsgemäße Rückverfolgbarkeit und Reproduzierbarkeit der Daten zwischen und innerhalb des Labors zu gewährleisten, wurden eine Reihe von Schritten unternommen, wie z. B. die ordnungsgemäße Randomisierung der Proben für alle Analyseschritte, die Arbeit mit vom Lieferanten zertifizierten Standardmischungen, die Einbeziehung von Qualitätskontrollproben, Verfahren zur Überprüfung der Chargenannahme oder -ablehnung und die Erstellung einer internen Datenbank, um die QC-Leistung langfristig zu verfolgen. Im Einklang mit diesen Initiativen steht auch die Notwendigkeit einer standardisierten Methode zur Verbesserung der Probenstabilität. Im Allgemeinen wird die Mehrheit der Strukturlipide nicht von der Lipidoxidation beeinflusst, was für Oxilipine, oxidierte Lipide und mehrfach ungesättigte Fettsäuren relevanter ist, die daher viel empfindlicher auf Lager- und Handhabungsbedingungen reagieren. Die korrekte Beurteilung der Probenstabilität ist jedoch nach wie vor eine technisch anspruchsvolle Aufgabe.

Dieses Protokoll hat jedoch eine Einschränkung, wenn es darum geht, submolekulare Konzentrationen von Verbindungen zu bestimmen. Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass es keine Trennung des Gesamtextrakts gibt, werden alle Isoformen von Lipiden mit der gleichen Molekülmasse, aber unterschiedlichen Fettsäurezusammensetzungen in der MS-Analyse zusammengeführt. Für die meisten Klassen ist es möglich, eine partielle Entfaltung der Struktur zu erreichen, indem die Fragmentierungsverhältnisse der verbleibenden Fettsäurefragmente in MS2 verwendet werden. Die unabhängige Quantifizierung jeder Isoform bleibt jedoch eine besonders herausfordernde Aufgabe, da das Fragmentierungsverhalten verschiedener Isoformen sehr unterschiedlich ist und reine chemische Standards nicht in ausreichender Vielfalt zur Verfügung stehen, um die Kompensationswerte zu definieren. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass der ESI-Prozess unweigerlich Artefakte erzeugt, was zur künstlichen Erzeugung von Peaks für einige Lipide wie DAGs, Pas und FAs führt, was zu einer fehlerhaften Quantifizierung führen kann.

Als nächstes fassen wir die kritischsten Teile des Protokolls basierend auf unseren Erfahrungen zusammen. Der erste hängt mit der Tatsache zusammen, dass jeder Mausgewebetyp ein einzigartiges Lipidprofil hat, sowohl in Bezug auf die Lipidmenge als auch auf die Klassenverhältnisse. Dabei müssen die Ausgangsmengen des Gewebes bezogen auf den Gesamtproteingehalt vor der Extraktion sorgfältig bestimmt werden, um das MS-Signal nicht zu sättigen und den dynamischen Quantifizierungsbereich nicht durch Lipidaggregation bei hohen Konzentrationen³³ zu verlassen oder – im entgegengesetzten Extrem – genügend MS-Signal bereitzustellen, um die wichtigsten Lipidverbindungen für jede Lipidklasse abzudecken.

Der zweite kritische Aspekt besteht darin, eine korrekte Ausrichtung der Position des Direktinfusions-Nanoquellen-Chipausgangs mit der Transferkapillare des Massenspektrometers sicherzustellen. In Anbetracht der Tatsache, dass die vollständige Kalibrierung des Massenspektrometers in beiden Modi wöchentlich durchgeführt wird, kann der Wechsel zwischen der Kalibrierungsquelle und dem Nanoquellen-Chip-Setup der Grund für eine dramatische Variabilität der Signalintensität aufgrund einer Fehlausrichtung während der Installation sein.

Ein weiterer kritischer Teil des Protokolls ist der sorgfältige Umgang mit dem internen Standardmix. Da dieses Gemisch eine erhebliche Menge an Dichlormethan enthält, sollte es nach dem Öffnen schnell verbraucht werden, um eine lange Lagerung und mehrfache Verwendung zu vermeiden, die zu Verdunstung und künstlichen Konzentrationsänderungen führen. Darüber hinaus ist eine konsistente Handhabung der Standardmischung nach der Entnahme aus der Lagerung bei −20 °C wichtig, da Temperaturunterschiede beim Pipettieren mit Luftkissenpipetten zu Volumeninkonsistenzen führen können. Eine Option wäre, Dichlormethan im Standard-Resuspensionspuffer durch reines Methanol zu ersetzen, was den Handhabungskomfort verbessern könnte, sich jedoch negativ auf die Löslichkeit einiger Lipidklassen auswirken und somit die Quantifizierungsgenauigkeit für diese Lipidklassen verringern könnte.

Der letzte kritische Teil ist die Datenverarbeitung. Der Datenverarbeitungs-Workflow kombiniert die Peak-by-Peak-Softwarekonvertierung vom .raw- in das .mzML-Format, die Anwendung von MS2-Scan-Mittelwertbildung und MS1- und MS2-Rauschfilterung sowie Peak-Picking und Datenkomprimierung. Alternativ kann die Software Proteowizard auch für die Datenkonvertierung verwendet werden, in diesem Fall müssen jedoch einige Einstellungen in LipidXplorer manuell vorgenommen werden. Die gesamte Komplexität der Schrotflinten-Lipidomik konzentriert sich insbesondere auf den Schritt der Entfaltung der MS1- und MS2-Spektren der Direkteinspritzung. Die Open-Source-Software LipidXplorer importiert die konvertierten Spektren aus dem mzML-Dateiformat basierend auf Massengenauigkeit, Massenauflösung und der Steigung ihrer Änderung mit zunehmendem m/z. Die Software führt mehrere einzelne MS- und MS/MS-Spektren zusammen, die innerhalb eines Analyselaufs aufgenommen wurden. Anschließend werden einzelne Peaks innerhalb verschiedener Stichprobenläufe ausgerichtet und in jedem Cluster von ausgerichteten Peaks ihre Massen durch ihre einzelne intensitätsgewichtete Durchschnittsmasse ersetzt, während ihre Häufigkeiten in jeder Datendatei unberührt bleiben. Repräsentative Massen von ausgerichteten Peak-Clustern und einzelnen Peak-Intensitäten werden in einer Master-Scan-Datenbank gespeichert. Die Master-Scan-Datenbank enthält alle MS1- und MS2-Spektren, die für alle Proben im Batch generiert wurden, und kann durch Abfragen, die in der MFQL (Molecular Fragmentation Query Language) geschrieben sind, zu Lipididentifikationen entfaltet werden.

Insgesamt umfasst die Methode die Identifizierung von DAG-, TAG- und SE-Lipiden auf der Grundlage des positiven Modus und PC-, PE-, PS-, PI-, PA-, PG-, SM-, LPC- und LPE-Lipiden auf der Grundlage des negativen Mode-Erwerbs. Während der Lipididentifizierung wird eine Isotopenkorrektur für MS1 und MS2 durchgeführt, und die angepassten Intensitäten werden in der .xlsx Ausgabedatei angegeben. Alternativ stehen mehrere andere Software zur Verfügung, um Schrotflintendaten zu verarbeiten, wie z. B. ALEX⁴⁵ und LipidHunter⁴⁶.

Fettsäuren – wichtige Bestandteile der Kern- und Zellmembran – werden in Form von Phospholipiden zur weiteren Umwandlung in bioaktive Moleküle gespeichert. Sie können durch Lysophospholipid-Acyltransferase-Enzyme über den Lands-Weg⁴⁷ in Lysophospholipide umgewandelt werden. Es ist beispielsweise bekannt, dass das LPCAT3-Enzym eine hohe Spezifität aufweist, um AA in Lysophosphatidylcholin und Lysophosphatidylserin-Zwischenprodukte einzubauen. Die relativ hohe Expression dieser Enzyme wurde in Entzündungszellen wie Alveolarmakrophagen und Bronchialepithelzellen^{berichtet 47}, was zur Freisetzung größerer relativer Anteile von AA-haltigen Phospholipiden in diesen Zellen führte. Nach ihrer Freisetzung aus Membranphospholipiden durch Phospholipase A2 wird die Umwandlung von PUFAs in verschiedene Arten von Lipidmediatoren jedoch durch viele Enzyme katalysiert⁴⁸. Darüber hinaus können diese PUFAs durch die Wirkung der Enzyme Cyclooxygenase (COX)-1 und COX-2⁴⁷ zum Substrat für die Produktion von entzündungsfördernden und entzündungshemmenden Prostaglandinen werden. Phospholipide sind eine der Quellen für Lipidmediatoren, die an bestimmten Stellen freigesetzt werden, an denen diese Mediatoren ihre biologischen Wirkungen nachweisen müssen.

Die Lunge ist ein komplexes Organ, das aus mehreren Zelltypen besteht, von denen jeder überlappende und Nischenrollen bei der Erleichterung einer normalen Lungenentwicklung und -funktion spielt. Es wurden nur wenige Studien durchgeführt, um verschiedene Zelltypen in der Maus oder der menschlichen Lunge (z. B. alveoläre Typ-2-Zellen) zu isolieren und zu profilieren49,50; Andere wichtige Lungenzelltypen wurden nicht charakterisiert. Eine weitere interessante Studie⁵¹ wurde durchgeführt, um Endothel-, Epithel-, Mesenchym- und gemischte Immunzellen in der Mauslunge zu isolieren und eine Lipidanalyse durchzuführen. Es wurde beobachtet, dass die Konzentration von PUFAs, die in PCO und PG eingebaut sind, in den Immunzellen angereichert war. In Anbetracht der Tatsache, dass CS eine Zunahme der Immunzellen in der Lunge (4-5-fach) induziert, wie durch bronchoalveoläre Lavage (BAL)⁵² beurteilt, könnten die in dieser Studie beobachteten Gesamtlipidveränderungen durch einen kumulativen Anstieg der Immunzellrekrutierung in der Mauslunge erklärt werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die beobachtete Verzerrung von einfach ungesättigten Fettsäuren und PUFAs, die in Phospholipiden eingebaut sind, den Überschuss bestimmter FAs in der Zelle widerspiegeln und/oder eine intrazelluläre Ressource von Oxilipin-Vorläufern darstellen kann, die unter oxidativem Stress und entzündlichen Bedingungen überproduziert werden. Zusätzliche Daten zu freiem EPA, DHA und anderen Oxilipinen sind jedoch unerlässlich, um diesen Punkt zu klären, und liegen außerhalb des Anwendungsbereichs der aktuellen Methode.