Generazione di cellule staminali mesenchimali dal tessuto del cordone ombelicale umano e loro differenziazione nel lignaggio muscolare scheletrico
Summary
Descriviamo un protocollo per l’isolamento delle cellule staminali mesenchimali dal tessuto del cordone ombelicale umano e la loro differenziazione nel lignaggio muscolare scheletrico.
Abstract
L’esplorazione del potenziale terapeutico delle cellule staminali mesenchimali dipende dalla facilità di isolamento, dalla potenza verso la differenziazione e dall’affidabilità e dalla robustezza della fonte. Descriviamo qui un protocollo graduale per l’isolamento delle cellule staminali mesenchimali dal tessuto del cordone ombelicale umano (uMSCs), la loro immunofenotipizzazione e la propagazione di tali colture su diversi passaggi. In questa procedura, la vitalità degli uMSC è elevata perché non vi è alcuna digestione enzimatica. Inoltre, la rimozione dei vasi sanguigni, comprese le arterie del cordone ombelicale e la vena, assicura che non vi sia contaminazione delle cellule di origine endoteliale. Utilizzando la citometria a flusso, le uMSC all’isolamento sono CD45−CD34−, indicando un’assenza di cellule dalla linea ematopoietica. È importante sottolineare che esprimono marcatori di superficie chiave, CD105, CD90 e CD73. Al momento della creazione di colture, questo documento descrive un metodo efficace per indurre la differenziazione in queste uMSC nel lignaggio del muscolo scheletrico. Un’analisi dettagliata della progressione miogenica nelle uMSC differenziate rivela che le uMSC esprimono Pax7, un marker per i progenitori miogeni nelle fasi iniziali della differenziazione, seguito dall’espressione di MyoD e Myf5 e, infine, un marcatore di differenziazione terminale, la catena pesante della miosina (MyHC).
Introduction
Il cordone ombelicale umano è stato accreditato per possedere un robusto serbatoio di cellule staminali mesenchimali, che sono attualmente in fase di esplorazione per terapie rigenerative a causa dei loro robusti tassi di proliferazione e differenziazione, proprietà immunomodulatorie e capacità di generare cellule da tutti e tre gli strati germinali1. Il tessuto del cordone ombelicale è costituito da più compartimenti come il sangue del cordone ombelicale, il subendotelio della vena ombelicale e la gelatina di Wharton (WJ), che di per sé comprende tre regioni indistinte: la zona perivascolare, la zona intervascolare e il sub-amnione o il rivestimento del cordone (CL)2. Mentre gli uMSC possono essere isolati da tutte queste diverse regioni ed esprimere ampiamente i marcatori MSC chiave, non c’è chiarezza sul fatto che questi compartimenti contengano la stessa popolazione di uMSC o mostrino differenze nelle loro potenze di differenziazione3. Pertanto, i protocolli per l’isolamento delle uMSC richiedono una maggiore precisione nella loro modalità e regione di isolamento, la robusta caratterizzazione dei potenziali di differenziazione e, infine, un’analisi comparativa da diversi compartimenti del cavo.
In questo contesto, pochi studi hanno dimostrato differenze nei potenziali proliferativi e differenziativi uMSC tra le diverse parti del cavo. Di queste, le analisi comparative tra uMSC isolate dalle regioni CL e WJ hanno rivelato un maggiore potenziale proliferativo nelle UMSC derivate da CL 3,4. In uno studio separato, le uMSC derivate da WJ hanno ottenuto risultati migliori nei saggi di proliferazione rispetto alle cellule perivascolari (HUCPV)5. Nell’esaminare le differenze tra le uMSC derivate dal sangue cordonale e le uMSC derivate dal tessuto cordonale prive di contaminazione vascolare, è stata riportata un’espressione differenziale dei marcatori MSC chiave tra i due compartimenti, nonché un aumento dei tassi di proliferazione nelle uMSC derivate dal tessuto cordonale6.
Dei numerosi studi che esaminano i potenziali di differenziazione delle uMSC principalmente nei tessuti del lignaggio mesodermico come i lignaggi osteogenici, adipogenici e condrogeni, pochissimi hanno fornito protocolli dettagliati per la differenziazione miogenica e la successiva caratterizzazione, nonché analisi comparative tra vari compartimenti del cordone ombelicale. In questo contesto, abbiamo sviluppato un robusto protocollo di differenziazione muscolare e osservato che le uMSC derivate dal tessuto cordonale mostrano capacità di differenziazione miogenica superiori rispetto al sangue del cordone ombelicale6. Qui, un protocollo graduale è dettagliato per l’isolamento delle uMSC dall’intero tessuto cordonale privo di cellule associate alla vascolarizzazione, alla loro caratterizzazione e alla loro differenziazione nel lignaggio miogenico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Passaggi critici
Un passaggio critico in questo protocollo è la raccolta del tessuto in condizioni asettiche, dal momento della consegna al mantenimento di colture sterili, per l’intera durata della propagazione. Durante la raccolta del cavo, è essenziale che il cavo non tocchi alcuna superficie non sterilizzata e venga tamponato esternamente con etanolo al 70% prima della raccolta in tubi contenenti PBS integrati con antibiotici. È importante limitare il tempo tra la raccolta del cordone e l’elabo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il signor Ojas Tikoo per il loro aiuto con le riprese e la produzione video. Riconosciamo anche l’aiuto ricevuto dal personale GARBH-Ini (Interdisciplinary Group on Advanced Research and Birth Outcome-DBT India), infermieri e funzionari di ricerca senior presso il Gurugram Civil Hospital e il Dr. Pallavi Kshetrapal per l’aiuto con la logistica. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni concesse a Suchitra Gopinath dal Dipartimento di Biotecnologie, India (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).
Materials
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) | HiMedia | A001A-50mL | |
| Anti-GAPDH antibody | Sigma Aldrich | G8795 | |
| Anti-MyHC antibody (My32) | Novus Biologicals | NBP2-50401AF647 | |
| Anti-MyoD antibody (5.8A) | Novus Biologicals | NB100-56511 | |
| Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) | Novus Biologicals | NBP2-34616AF594 | |
| Anti-Pax7 antibody | DSHB | DSHB-C1-576 | |
| APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 559869 | |
| Collagen Type 1 | Merck | C8919 | |
| D (+) Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Dexamethasone | SIGMA | D4902 | |
| FACSCanto II or FACSAria III | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum, qualified Brazil | GIBCO | 10270106 | not to be heat-inactivated |
| FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 | BD Biosciences | 551146 | |
| FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 | BD Biosciences | 557153 | |
| FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 | BD Biosciences | 557508 | |
| FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 | BD Biosciences | 555821 | |
| FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 | BD Biosciences | 555482 | |
| FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 | BD Biosciences | 560840 | |
| FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 555595 | |
| FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 | BD Biosciences | 557348 | |
| FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555786 | |
| FlowJo software | BD Biosciences | ||
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1264 | |
| Horse serum | HiMedia | RM1239 | |
| Hydrocortisone | Merck | H4001 | |
| Laminin | Merck | L2020 | |
| MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides | Hyclone | SH30568.FS | Basal medium for uMSCs |
| PE Mouse anti-human CD105 clone 266 | BD Biosciences | 560839 | |
| PE Mouse anti-human CD44 clone 515 | BD Biosciences | 550989 | |
| PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 | BD Biosciences | 555617 | |
| PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555787 | |
| PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 | BD Biosciences | 561258 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 | HiMedia | M1866 | |
| Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | HiMedia | TCL049-100mL |
References
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