יצירת תאי גזע מזנכימליים מרקמת חבל הטבור האנושית והתמיינותם לשושלת שרירי השלד
Summary
אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תאי גזע מזנכימליים מרקמת חבל הטבור האנושית והתמיינותם לשושלת שרירי השלד.
Abstract
חקר הפוטנציאל הטיפולי של תאי גזע מזנכימליים מותנה בקלות הבידוד, בעוצמה לקראת התמיינות ובאמינות ובחוסן של המקור. אנו מתארים כאן פרוטוקול מדורג לבידוד תאי גזע מזנכימליים מרקמת חבל הטבור האנושית (uMSCs), האימונופנוטיפ שלהם והתפשטות תרביות כאלה על פני מספר מעברים. בהליך זה, הכדאיות של uMSCs היא גבוהה כי אין עיכול אנזימטי. יתר על כן, הסרת כלי הדם, כולל עורקי חבל הטבור והווריד, מבטיחה כי אין זיהום של תאים ממוצא אנדותל. באמצעות ציטומטריה של זרימה, uMSCs בעת הבידוד הם CD45−CD34−, מה שמעיד על היעדר תאים מהשושלת ההמטופוייטית. חשוב לציין שהם מבטאים סמני פני שטח מרכזיים, CD105, CD90 ו-CD73. עם הקמתן של תרביות, מאמר זה מתאר שיטה יעילה להשראת התמיינות ב-uMSCs אלה לשושלת שרירי השלד. ניתוח מפורט של התקדמות מיוגנית ב- uMSCs מובחנים מגלה כי uMSCs מבטאים את Pax7, סמן לאבות מיוגניים בשלבים הראשונים של התמיינות, ואחריו הביטוי של MyoD ו- Myf5, ולבסוף, סמן התמיינות מסוף, שרשרת כבדה של מיוזין (MyHC).
Introduction
חבל הטבור האנושי נזקף לזכותו כבעל מאגר חזק של תאי גזע מזנכימליים, הנחקרים כיום לטיפולים רגנרטיביים בשל שיעורי ההתרבות וההתמיינות החזקים שלהם, התכונות האימונומודולטוריות והיכולת לייצר תאים מכל שלוש שכבות הנבט1. רקמת חבל הטבור מורכבת ממספר תאים כגון דם טבורי, תת-האנדותל של וריד הטבור, והג’לי של וורטון (WJ), אשר כשלעצמו מקיף שלושה אזורים לא ברורים – האזור הפריווסקולרי, האזור הבין-וסקולרי, ותת-האניון או בטנת החבל (CL)2. בעוד שניתן לבודד uMSCs מכל האזורים השונים הללו ולבטא באופן רחב סמני MSC מרכזיים, אין בהירות אם תאים אלה מכילים את אותה אוכלוסייה של uMSCs או מציגים הבדלים בעוצמת ההבחנה שלהם3. לפיכך, פרוטוקולים לבידוד של uMSCs דורשים דיוק רב יותר במצבם ובאזור הבידוד שלהם, אפיון חזק של פוטנציאל ההבחנה, ולבסוף, ניתוח השוואתי מתאים שונים של הכבל.
בהקשר זה, מעטים המחקרים שהדגימו הבדלים בפוטנציאלים המתרבים וההבחנתיים של uMSC בין חלקים שונים של הכבל. מתוכם, ניתוחים השוואתיים בין uMSCs שבודדו מאזורי CL ו-WJ חשפו פוטנציאל התפשטות גדול יותר ב-uMSCs שמקורם ב-CL 3,4. במחקר נפרד, uMSCs שמקורם ב-WJ הציגו ביצועים טובים יותר במבחני התפשטות בהשוואה לתאים פריווסקולריים (HUCPV)5. בבחינת ההבדלים בין uMSCs שמקורם בדם טבורי לבין uMSCs שמקורם ברקמת כבל ללא זיהום כלי דם, דווח על ביטוי דיפרנציאלי של סמני MSC מרכזיים בין שני התאים, כמו גם על שיעורי שגשוג מוגברים ב-uMSCs6 שמקורם ברקמת כבל.
מבין מספר המחקרים שבחנו את פוטנציאל ההתמיינות של uMSCs בעיקר לרקמות של שושלת המזודרם כגון שושלות אוסטאוגניות, אדיפוגניות וכונדרוגניות, מעטים מאוד סיפקו פרוטוקולים מפורטים להבחנה מיוגנית ולאפיון שלאחר מכן, כמו גם ניתוחים השוואתיים בין תאי חוטים שונים. בהקשר זה, פיתחנו פרוטוקול התמיינות שרירים חזק וראינו כי uMSCs שמקורם ברקמת כבל מפגינים יכולות התמיינות מיוגניות מעולות בהשוואה לדם טבורי6. כאן מפורט פרוטוקול שלבים לבידוד של uMSCs מכל רקמת הכבל נטולת תאים הקשורים לכלי הדם, לאפיון שלהם ולהתמיינותם לשושלת המיוגנית.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלבים קריטיים
שלב קריטי בפרוטוקול זה הוא איסוף רקמות בתנאים אספטיים, מרגע המסירה ועד לתחזוקת תרביות סטריליות, לכל משך ההתפשטות. במהלך איסוף הכבלים, חיוני שהכבל לא ייגע בשום משטח שאינו מעוקר והוא מתפתל חיצונית עם 70% אתנול לפני האיסוף בצינורות המכילים PBS בתוספת אנטיביוטיקה. חשוב ל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למר אוג’ס טיקו על עזרתם בצילומים ובהפקת וידאו. אנו מכירים גם בעזרה שקיבלנו מצוות GARBH-Ini (קבוצה בין-תחומית על מחקר מתקדם ותוצאת לידה -DBT הודו), אחיות וקציני מחקר בכירים בבית החולים האזרחי גורוגראם וד”ר פאלאווי קשטרפאל לעזרה בלוגיסטיקה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים שהוענקו לסוצ’יטרה גופינאת מהמחלקה לביוטכנולוגיה, הודו (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).
Materials
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) | HiMedia | A001A-50mL | |
| Anti-GAPDH antibody | Sigma Aldrich | G8795 | |
| Anti-MyHC antibody (My32) | Novus Biologicals | NBP2-50401AF647 | |
| Anti-MyoD antibody (5.8A) | Novus Biologicals | NB100-56511 | |
| Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) | Novus Biologicals | NBP2-34616AF594 | |
| Anti-Pax7 antibody | DSHB | DSHB-C1-576 | |
| APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 559869 | |
| Collagen Type 1 | Merck | C8919 | |
| D (+) Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Dexamethasone | SIGMA | D4902 | |
| FACSCanto II or FACSAria III | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum, qualified Brazil | GIBCO | 10270106 | not to be heat-inactivated |
| FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 | BD Biosciences | 551146 | |
| FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 | BD Biosciences | 557153 | |
| FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 | BD Biosciences | 557508 | |
| FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 | BD Biosciences | 555821 | |
| FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 | BD Biosciences | 555482 | |
| FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 | BD Biosciences | 560840 | |
| FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 555595 | |
| FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 | BD Biosciences | 557348 | |
| FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555786 | |
| FlowJo software | BD Biosciences | ||
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1264 | |
| Horse serum | HiMedia | RM1239 | |
| Hydrocortisone | Merck | H4001 | |
| Laminin | Merck | L2020 | |
| MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides | Hyclone | SH30568.FS | Basal medium for uMSCs |
| PE Mouse anti-human CD105 clone 266 | BD Biosciences | 560839 | |
| PE Mouse anti-human CD44 clone 515 | BD Biosciences | 550989 | |
| PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 | BD Biosciences | 555617 | |
| PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555787 | |
| PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 | BD Biosciences | 561258 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 | HiMedia | M1866 | |
| Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | HiMedia | TCL049-100mL |
References
- Kuroda, Y., et al. Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).
- Troyer, D. L., Weiss, M. L. Wharton’s jelly-derived cells are a primitive stromal cell population. Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).
- Karahuseyinoglu, S., et al. Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys. Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).
- Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane. Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).
- Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
- Mishra, S., et al. Umbilical cord tissue is a robust source for mesenchymal stem cells with enhanced myogenic differentiation potential compared to cord blood. Scientific Reports. 10 (1), 18978 (2020).
- Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
- Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton’s Jelly of umbilical cord. Methods in Cell Biology. 86, 101-119 (2008).
- Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 462-471 (2006).
- Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton’s jelly. BioMed Research International. 2013, 428726 (2013).
- Ishige, I., et al. Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton’s jelly explants of human umbilical cord. International Journal of Hematology. 90 (2), 261-269 (2009).
- Chal, J., et al. Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy. Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).
