Mutant Metiyonin tRNA Sentetaz Fare Hattı Kullanılarak Hücre Tipi Özgül Protein Saflaştırma ve Kompleks Dokulardan Tanımlama
Summary
Bu protokol, mutant L274G-Metiyonin tRNA sentetazı (MetRS*) ifade eden bir fare çizgisi kullanılarak azidonorlösin (ANL) ile hücre tipine özgü protein etiketlemesinin nasıl gerçekleştirileceğini ve etiketli hücre tipine özgü proteinlerin izolasyonu için gerekli adımları açıklar. Canlı farelerde (1) içme suyu ve (2) intraperitoneal enjeksiyonlarla iki olası ANL uygulama yolunu özetliyoruz.
Abstract
Protein homeostazını in vivo olarak anlamak, hücrelerin hem fizyolojik hem de hastalık koşullarında nasıl çalıştığını bilmenin anahtarıdır. Mevcut protokol, protein etiketlemesini belirli hücresel popülasyonlara yönlendirmek için tasarlanmış bir fare hattı kullanarak yeni sentezlenmiş proteinlerin in vivo etiketlemesini ve ardından saflaştırılmasını açıklamaktadır. L274G-Metiyonin tRNA sentetazın (MetRS*) Cre rekombinaz ekspresyonu ile indüklenebilir bir çizgidir ve azidonorlösin (ANL) proteinlere dahil olmasını sağlar, aksi takdirde gerçekleşmeyecektir. Burada açıklanan yöntemi kullanarak, in vivo etiketli hücre tipine özgü proteomları saflaştırmak ve numune karmaşıklığının azaltılması nedeniyle protein içeriğindeki ince değişiklikleri tespit etmek mümkündür.
Introduction
Anormal protein homeostazı, protein sentezi ve bozunmasındaki dengesizlikten kaynaklanır. Çeşitli hastalıklar protein homeostazındaki değişikliklerle ilişkilidir. Bazı hastalıkların ayırt edici özelliği, farklı hücre altı yerlerde ve beyin bölgelerinde agregaların varlığıdır. Protein homeostazı sadece hastalıkta önemli değil, aynı zamanda normal organ ve hücresel fonksiyonda da önemli bir rol oynar1. Örneğin, protein sentezi, protein sentezini bloke eden kimyasal inhibitörlerin kullanımı ile belirlenen birçok nöronal plastisite 2,3 formu içingereklidir 4. Bununla birlikte, proteomun hangi hücre tiplerinde öğrenmeyi ve hafızayı desteklemek için değiştirildiği açık değildir, ne de her hücre tipindeki hangi spesifik proteinlerin sentezlerinde veya bozulmalarında arttığı veya azaldığı anlaşılmamıştır. Bu nedenle, protein homeostazının kapsamlı bir çalışması, spesifik hücre tiplerinden gelen proteomları ayırt etme yeteneğini gerektirir. Gerçekten de, çok hücreli bir ortamda meydana gelen hücresel süreçleri incelemek için hücre tipine özgü proteomların tanımlanması, proteomikte önemli bir engel olmuştur. Bu nedenle, hücre tipine özgü proteomları tanımlamak ve saflaştırmak için etkili bir yol olduğu kanıtlanmış biyo-ortogonal yöntemlerle birleştirilmiş MetRS* ekspresyonunu kullanarak bir teknik geliştirdik ve bu boşluğu doldurduk 5,6,7.
Mutant bir MetRS* (MetRS L274G) ekspresyonu, kanonik olmayan metiyonin analog ANL’nin karşılık gelen tRNA 8,9’a yüklenmesine ve daha sonra proteinlere dahil edilmesine izin verir. MetRS* ekspresyonu hücre tipine özgü bir promotör tarafından düzenlendiğinde, kanonik olmayan amino asit, proteinlere hücre seçici bir şekilde dahil edilecektir. ANL proteinlere dahil edildikten sonra, tıklama kimyası ile seçici olarak işlevselleştirilebilir ve daha sonra görüntüleme (FUNCAT) veya Batı İmmünoblot (BONCAT) ile görselleştirilebilir. Alternatif olarak, proteinler seçici olarak saflaştırılabilir ve kütle spektrometresi (MS) ile tanımlanabilir. Bu teknolojiyi kullanarak, Cre rekombinazının kontrolü altında MetRS* proteinini ifade eden bir fare çizgisi oluşturduk. Mevcut Cre-mouse hatlarının sayısının artması göz önüne alındığında, MetRS * sistemi, mevcut bir Cre-line’ın bulunduğu herhangi bir dokudan herhangi bir hücre tipini incelemek için herhangi bir alanda kullanılabilir. ANL ile protein etiketleme in vitro veya in vivo olarak mümkündür ve fare davranışını veya protein bütünlüğünü değiştirmez6. Etiketleme zaman aralığı, yeni sentezlenen proteinleri (daha kısa etiketleme süreleri) veya tüm proteomları (daha uzun etiketleme süreleri) etiketleyerek her araştırmacının bilimsel sorusuna uyarlanabilir. Bu tekniğin kullanımı, araştırmacının çalışmaya istekli olduğu tipteki hücrelerin sayısı ile sınırlıdır; dolayısıyla düşük sayılara veya düşük metabolik hıza sahip hücre tiplerinden protein izolasyonu bu yöntemle mümkün değildir. Sunulan yöntemin amacı, in vivo olarak etiketlenmiş hücre tipine özgü proteinleri / proteomları tanımlamaktır. Bu protokolde, canlı farelerde ANL ile hücre tipine özgü proteomların nasıl etiketleneceğini ve etiketli proteinlerin nasıl saflaştırılacağını açıklıyoruz. Saflaştırmadan sonra, proteinler rutin kütle spektrometresi protokolleri 5,10 ile tanımlanabilir. Bu yöntemde, proteinlerin belirli hücresel popülasyonlardan seçici saflaştırılmasıyla elde edilen numune karmaşıklığının azaltılması, deneycinin, örneğin çevresel değişikliklere yanıt olarak, proteomlardaki ince değişiklikleri tespit etmesini sağlar. Etiketlenmiş proteinlerin saflaştırılması, MS analizi veya etiketleme süresi dahil olmak üzere ~ 10 gün içinde elde edilebilir. Burada, fareleri ifade eden MetRS * ‘ye ANL uygulaması için iki yöntem tanımladık: (1) içme suyuna amino asit eklenmesi ve (2) intraperitoneal enjeksiyonlarla ANL’nin tanıtılması. ANL uygulaması için seçilen yöntemden bağımsız olarak, izolasyon ve saflaştırma adımları aynıdır (adım 2’den itibaren).
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokolün kritik yönleri şunlardır; negatif kontrollerin dahil edilmesi, yeterli biyolojik replikasyona sahip olması, ANL uygulama yolu, miktarı ve süresi, numunelerin alkilasyonu, alkin konsantrasyonu ve DST-alkinen kullanıldığında β-merkaptoetanol eliminasyonu.
Cre sürücüsü olmayan ANL etiketli hayvanlardan gelen negatif kontrol örneklerini dahil etmek önemlidir ve bu nedenle MetRS* ifadesi yoktur. Bu numuneler, ANL etiketli Cre-indüklenmiş MetRS* farelerden alınan numu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
B.A-C, İspanya Bilim ve İnovasyon Bakanlığı (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), Madrid Özerk Topluluğu (Atracción de Talento-2019T1 / BMD-14057) ve MICINN (PID2020-113270RA-I00) hibeleri tarafından finanse edilmektedir. R.A-P, Madrid Özerk Topluluğu (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057) tarafından finanse edilmektedir. E.M.S., Avrupa Araştırma Konseyi’nden (hibe 743216) bir İleri Araştırmacı ödülü olan Max Planck Society tarafından finanse edilmektedir, DFG CRC 1080: Nöral Homeostazın Moleküler ve Hücresel Mekanizmaları ve DFG CRC 902: RNA Tabanlı Düzenlemenin Moleküler İlkeleri. D.C Dieterich ve P. Landgraf’a teknik tavsiyeleri ve DST-Alkyne’nin sentezi için teşekkür ederiz. E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast ve MPI for Brain Research’ün hayvan tesisine mükemmel destekleri için teşekkür ederiz. Nex-Cre fare serisini paylaştığı için Sandra Goebbels’e teşekkür ederiz. Antonio G. Carroggio’ya İngilizce düzenleme konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. B.A-C. deneyler tasarladı, yürüttü ve analiz etti. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E. ve S. t. D. deneyler yaptı ve analiz etti. B.A-C ve E.M.S. deneyler tasarladı ve projeyi denetledi, B.A-C makaleyi yazdı. Tüm yazarlar makaleyi düzenledi.
Materials
| 12% Acrylamide gels | GenScript | SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12% | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood |
| ANL | Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11) | ||
| ANL-HCl | IrishBotech | HAA1625.0500 | |
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Biotin alkyne | Thermo, | B10185 | |
| Chicken antibody anti-GFP | Aves | 1020 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor | Roche | 4693132001 | Toxic; use a lab coat and gloves. |
| Copper (I) bromide | Sigma | 254185 | 99.999% (wt/wt) |
| Disulfide tag (DST)-alkyne | Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20 | ||
| DMSO | Sigma | 276855 | |
| Filters | Merk | SCGP00525 | |
| Iodo acetamide (IAA) | Sigma | I1149 | |
| IR anti chicken 800 | LI-COR | IRDye 800CW | Donkey anti-Chicken Secondary Antibody |
| IR anti rabit 680 | LI-COR | IRDye 680RD | Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody |
| Maltose | Sigma | M9171 | |
| Manual Mixer | BioSpec Products | 1083 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | 4259 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
| NeutrAvidin beads | Pierce | 29200 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 1620112 | |
| PBS 1X | Thermo | J62036.K2 | |
| PBS 1X pH 7.8 | Preparation described in reference number 5 | ||
| PD SpinTrap G-25 columns | GE Healthcare | Buffer exchange | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo, | 23225 | Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life. |
| Polyclonal rabbit anti-biotin antibody | Cell Signaling | 5597 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| SDS 10% | Sigma | 71736 | |
| SDS-PAGE Running buffer MOPS | GenScript | M00138 | |
| SYPRO Ruby stain | Sigma | S4942 | |
| Table automatic Vortexer | Eppendorf | Mixmate | |
| Triazole ligand | Sigma | 678937 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Water | Sigma | W4502 | Molecular biology grade |
References
- Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M. The regulation of synaptic protein turnover. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015).
- Sutton, M. A., Schuman, E. M. Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory. Cell. 127 (1), 49-58 (2006).
- Dorrbaum, A. R., Alvarez-Castelao, B., Nassim-Assir, B., Langer, J. D., Schuman, E. M. Proteome dynamics during homeostatic scaling in cultured neurons. Elife. 9, 52939 (2020).
- Flexner, J. B., Flexner, L. B., Stellar, E. Memory in mice as affected by intracerebral puromycin. Science. 141 (3575), 57-59 (1963).
- Alvarez-Castelao, B., Schanzenbacher, C. T., Langer, J. D., Schuman, E. M. Cell-type-specific metabolic labeling, detection and identification of nascent proteomes in vivo. Nature Protocols. 14 (2), 556-575 (2019).
- Alvarez-Castelao, B., et al. Cell-type-specific metabolic labeling of nascent proteomes in vivo. Nature Biotechnology. 35 (12), 1196-1201 (2017).
- Ngo, J. T., et al. Cell-selective metabolic labeling of proteins. Nature Chemical Biology. 5 (10), 715-717 (2009).
- Mahdavi, A., et al. Engineered aminoacyl-tRNA synthetase for cell-selective analysis of mammalian protein synthesis. Journal of the American Chemical Society. 138 (13), 4278-4281 (2016).
- Yuet, K. P., et al. Cell-specific proteomic analysis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (9), 2705-2710 (2015).
- Patel, V. J., et al. A comparison of labeling and label-free mass spectrometry-based proteomics approaches. Journal of Proteome Research. 8 (7), 3752-3759 (2009).
- Link, A. J., Vink, M. K., Tirrell, D. A. Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazo transfer. Nature Protocols. 2 (8), 1879-1883 (2007).
- Landgraf, P., Antileo, E. R., Schuman, E. M., Dieterich, D. C. BONCAT: Metabolic labeling, click chemistry, and affinity purification of newly synthesized proteomes. Methods in Molecular Biology. 1266, 199-215 (2015).
- Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Analysis of proteins by immunoblotting. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).
- Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).
- Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).
- Goebbels, S., et al. Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice. Genesis. 44 (12), 611-621 (2006).
- van Geel, R., Pruijn, G. J., van Delft, F. L., Boelens, W. C. Preventing thiol-yne addition improves the specificity of strain-promoted azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 23 (3), 392-398 (2012).
- O’Fagain, C. Lyophilization of proteins. Methods in Molecular Biology. 244, 309-321 (2004).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Elinger, D., Gabashvili, A., Levin, Y. Suspension trapping (S-Trap) is compatible with typical protein extraction buffers and detergents for bottom-up proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (3), 1441-1445 (2019).
- tom Dieck, S., et al. Direct visualization of newly synthesized target proteins in situ. Nature Methods. 12 (5), 411-414 (2015).
- McShane, E., et al. Kinetic analysis of protein stability reveals age-dependent degradation. Cell. 167 (3), 803-815 (2016).
- Calve, S., Witten, A. J., Ocken, A. R., Kinzer-Ursem, T. L. Incorporation of non-canonical amino acids into the developing murine proteome. Scientific Reports. 6, 32377 (2016).
- David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. Journal of Cell Biology. 197 (1), 45-57 (2012).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nature Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
- Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B., May, D. G. BioID: A screen for protein-protein interactions. Current Protocols in Protein Science. 91, 11-15 (2018).
