Summary

Organoïden van menselijke tand vestigen als een krachtig hulpmiddel voor mechanistisch onderzoek en regeneratieve therapie

Published: April 13, 2022
doi:

Summary

We presenteren een protocol om epitheliale organoïde culturen te ontwikkelen, uitgaande van menselijke tand. De organoïden zijn robuust uitbreidbaar en recapituleren de epitheelstamcellen van de tand, inclusief hun ameloblastdifferentiatiecapaciteit. Het unieke organoïde model biedt een veelbelovend hulpmiddel om de menselijke tandheelkundige (stamcel) biologie te bestuderen met perspectieven voor tandregeneratieve benaderingen.

Abstract

Tanden zijn van cruciaal belang in het leven, niet alleen voor voedselmasticatie en spraak, maar ook voor psychologisch welzijn. Kennis over de ontwikkeling en biologie van menselijke tanden is schaars. In het bijzonder is er niet veel bekend over de epitheelstamcellen van de tand en hun functie. We zijn erin geslaagd om een nieuw organoïde model te ontwikkelen dat vertrekt van menselijk tandweefsel (d.w.z. tandheelkundige follikel, geïsoleerd uit geëxtraheerde verstandskiezen). De organoïden zijn robuust en langdurig uitbreidbaar en recapituleren het voorgestelde menselijke tandepitheelstamcelcompartiment in termen van markerexpressie en functionele activiteit. In het bijzonder zijn de organoïden in staat om een ameloblastdifferentiatieproces te ontvouwen zoals dat in vivo optreedt tijdens amelogenese. Dit unieke organoïde model biedt een krachtig hulpmiddel om niet alleen de ontwikkeling van menselijke tanden te bestuderen, maar ook tandheelkundige pathologie, en kan de weg vrijmaken voor tandregeneratieve therapie. Het vervangen van verloren tanden door een biologische tand op basis van dit nieuwe organoïde model zou een aantrekkelijk alternatief kunnen zijn voor de huidige standaard implantatie van synthetische materialen.

Introduction

Tanden hebben een essentiële rol bij voedselmasticatie, spraak en psychologisch welzijn (zelfbeeld). De menselijke tand bestaat uit sterk gemineraliseerde weefsels met verschillende dichtheid en hardheid1. Tandglazuur, het hoofdbestanddeel van de tandkroon, is het hoogste gemineraliseerde weefsel in het menselijk lichaam. Tijdens de vorming van glazuur (amelogenese), wanneer tanden zich ontwikkelen, differentiëren tandheelkundige epitheelstamcellen (DESC’s) in glazuurvormende cellen (ameloblasten). Eenmaal gevormd, wordt het glazuur zelden gerepareerd of vernieuwd vanwege het apoptotische verlies van de ameloblasten bij het begin van tanduitbarsting1. Herstel van beschadigd glazuurweefsel, zoals veroorzaakt door trauma of bacteriële ziekte, wordt momenteel bereikt met behulp van synthetische materialen; deze hebben echter te kampen met belangrijke tekortkomingen zoals microlekage, inferieure osseo-integratie en verankering, eindige levensduur en gebrek aan volledig functionele reparatie2. Vandaar dat een robuuste en betrouwbare kweek van menselijke DESC’s met de capaciteit om ameloblasten te genereren en het potentieel om gemineraliseerd weefsel te produceren een belangrijke stap voorwaarts zou zijn op het gebied van tandheelkundige regeneratieve aard.

Kennis over humaan DESC-fenotype en biologische functie is schaars 3,4,5. Interessant is dat DESC’s van menselijke tanden zijn voorgesteld om te bestaan in de epitheelcelresten van Malassez (ERM), celclusters aanwezig in de tandheelkundige follikel (DF), die niet-gescheurde tanden omringt, en aanwezig blijft in het parodontale ligament rond de wortel zodra de tand uitbarst1. ERM-cellen die samen met tandpulp zijn gekweekt, blijken te differentiëren tot ameloblastachtige cellen en glazuurachtig weefsel te genereren6. Diepgaande studies naar de specifieke rol van ERM-cellen in glazuur (re-) generatie zijn echter beperkt vanwege het ontbreken van betrouwbare studiemodellen7. De huidige ERM in vitro kweeksystemen worden belemmerd door een beperkte levensduur en snel verlies van fenotype in de 2D-omstandigheden die standaard worden gebruikt 8,9,10,11,12. Daarom is een handelbaar in vitro systeem om menselijke DESC’s getrouw uit te breiden, te bestuderen en te differentiëren sterk nodig.

In het afgelopen decennium is een krachtige techniek om epitheelstamcellen in vitro te laten groeien met succes toegepast op verschillende soorten (menselijke) epitheelweefsels om hun biologie en ziekte 13,14,15,16 te bestuderen. Deze technologie stelt de weefselepitheelstamcellen in staat om zichzelf te ontwikkelen tot 3D-celconstructies (d.w.z. organoïden) wanneer ze worden gezaaid in een extracellulaire matrix (ECM) -nabootsende steiger (meestal Matrigel) en gekweekt in een gedefinieerd medium dat de stamcelnichesignalering en / of embryogenese van het weefsel repliceert. Typische groeifactoren die nodig zijn voor organoïde ontwikkeling zijn epidermale groeifactor (EGF) en vleugelloze MMTV-integratieplaats (WNT) activators 14,15,16. De resulterende organoïden worden gekenmerkt door blijvende trouw bij het nabootsen van de oorspronkelijke epitheelstamcellen van het weefsel, evenals een hoge uitbreidbaarheid met behoud van hun fenotype en functionele eigenschappen, waardoor de vaak beperkte beschikbaarheid van primair menselijk weefsel zoals verkregen uit de kliniek wordt overwonnen. Om organoïden vast te stellen, is isolatie van de epitheelstamcellen uit het heterogene weefsel (d.w.z. bestaande uit andere celtypen zoals mesenchymale cellen) voorafgaand aan het kweken niet vereist, omdat mesenchymale cellen zich niet hechten aan of gedijen in de ECM, wat uiteindelijk resulteert in zuiver epitheliale organoïden 13,16,17,18,19 . Deze veelbelovende en veelzijdige technologie heeft geleid tot de ontwikkeling van vele organoïde modellen uit verschillende menselijke epitheelweefsels. Menselijke tand-afgeleide organoïden, waardevol voor diepgaande studie van tandontwikkeling, regeneratie en ziekte, waren echter nog niet vastgesteld20,21. We zijn er onlangs in geslaagd om zo’n nieuw organoïde model te ontwikkelen op basis van DF-weefsel uit derde kiezen (verstandskiezen) die zijn geëxtraheerd bij adolescente patiënten19.

Hier beschrijven we het protocol om epitheliale organoïde culturen te ontwikkelen uit de volwassen menselijke tand (d.w.z. uit de DF van derde kiezen) (figuur 1A). De resulterende organoïden drukken ERM-geassocieerde stengelheidsmarkers uit terwijl ze op lange termijn uitbreidbaar zijn. Intrigerend genoeg is, in tegenstelling tot de meeste andere organoïde modellen, het typisch benodigde EFG overbodig voor robuuste organoïde ontwikkeling en groei. Interessant is dat de stamheidsorganoïden ameloblastdifferentiatie-eigenschappen vertonen, waardoor ERM / DESC-kenmerken en -processen in vivo worden nagebootst. Het nieuwe en unieke organoïde model dat hier wordt beschreven, maakt het mogelijk om DESC-biologie, plasticiteit en differentiatiecapaciteit te verkennen en opent de deur voor het zetten van de eerste stappen in de richting van tandregeneratieve benaderingen.

Protocol

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Ethische Commissie Onderzoek UZ/KU Leuven (13/0104U). Geëxtraheerde derde kiezen (verstandskiezen) werden verkregen na geïnformeerde toestemming van de patiënten. 1. Voorbereidingen Prewarm een 48-well kweekplaat gedurende 15-20 uur in een 1,9% CO2-incubator bij 37 °C. Vloeibaar maken van een Matrigel aliquot (groeifactor-gereduceerd; fenol roodvrij; verder aangeduid als keldermembraanmat…

Representative Results

Ontwikkeling van tandorganoïdenWe bieden een gedetailleerd protocol om organoïde culturen vast te stellen uit menselijk DF-weefsel dat is verkregen na extractie van verstandskiezen (figuur 1A). Geïsoleerde DF wordt enzymatisch en mechanisch gedissocieerd. De verkregen cellen worden gekweekt binnen BMM in media die empirisch zijn gedefinieerd voor optimale organoïde ontwikkeling en groei (tandorganoïde medium; TOM)19. <p class="jove_conten…

Discussion

Dit protocol beschrijft de efficiënte en reproduceerbare generatie van organoïden vanaf de menselijke tand. Voor zover wij weten, is dit de eerste methodologie voor het vaststellen van de huidige (epitheliale) organoïden, uitgaande van menselijk tandweefsel. De organoïden zijn langdurig uitbreidbaar en vertonen een tandepitheelstamfenotype, waarbij DESC’s worden gedupliceerd die eerder in het ERM-compartiment van de DF7 zijn gemeld. Bovendien repliceren de organoïden functionele DESC/ERM-kenm…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We zijn alle medewerkers van de Orale en Maxillofaciale Chirurgie (MKA) van UZ Leuven, alsook de patiënten, dankbaar voor hun onschatbare hulp bij het verzamelen van vers geëxtraheerde derde kiezen. We willen ook Dr. Reinhilde Jacobs en Dr. Elisabeth Tijskens bedanken voor hun hulp bij de monsterverzameling. Dit werk werd ondersteund door subsidies van KU Leuven (BOF) en FWO-Vlaanderen (G061819N). L.H. is een FWO Ph.D. Fellow (1S84718N).

Materials

1.5 mL Microcentrifuge tube Eppendorf 30120.086
15 mL Centrifuge tube Corning 430052
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M-6250
48-well flat bottom plates Corning 3548
50 mL Centrifuge tube Corning 430290
A83-01 Sigma-Aldrich SML0788
Agarose Lonza 50004
Albumin Bovine (cell culture grade) Serva 47330.03
AMELX antibody Santa Cruz sc-365284
Amphotericin B Gibco 15200018
B27 (without vitamin A) Gibco 12587-010
Cassette VWR 7202191
Catalase from bovine liver Sigma-Aldrich C100
CD44 antibody Abcam ab34485
Cell strainer, 40 µm Falcon 352340
Cholera Toxin Sigma-Aldrich C8052
Citric acid Sigma-Aldrich C0759
CK14 antibody Thermo Fisher Scientific MA5-11599
Collagenase IV Gibco 17104-019
Cover glass VWR 6310146
Cryobox Thermo Scientific 5100-0001
Cryovial Thermo Fisher Scientific 375353
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Dispase II Sigma-Aldrich D4693
DMEM 1:1 F12 without Fe Invitrogen 074-90715A
DMEM powder high glucose Gibco 52100039
Dnase Sigma-Aldrich D5025-15KU
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663 – 10ML
Embedding workstation, 220 to 240 Vac Thermo Fisher Scientific 12587976
Ethanol absolute, ≥99.8% (EtOH) Fisher Chemical E/0650DF/15
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
FGF10 Peprotech 100-26
FGF2 (= basic FGF) R&D Systems 234-FSE-025
FGF8 Peprotech AF-100-25
GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit Sigma-Aldrich RTN350-1KT Includes 1% β-mercaptoethanol dissolved in lysis buffer
Glass Pasteur pipette Niko Mechanisms 170-40050
Glycine VWR 101194M
HEPES Sigma-Aldrich H4034
IGF-1 PeproTech 100-11
InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI) Sigma-Aldrich 688001
Insulin from bovine pancreas Sigma-Aldrich I6634
ITGA6 antibody Sigma-Aldrich HPA012696
L-Glutamine Gibco 25030024
Matrigel (growth factor-reduced; phenol red-free) Corning 15505739
Microscope slide Thermo Fisher Scientific J1800AMNZ
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 μm Millipore SLGV033R
Minimum essential medium eagle (αMEM) Sigma-Aldrich M4526
mouse IgG (Alexa 555) secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-31570
N2 Gibco 17502-048
N-acetyl L-cysteine Sigma-Aldrich A7250
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636
Noggin PeproTech 120-10C
P63 antibody Abcam ab124762
Pap Pen Sigma-Aldrich Z377821-1EA Marking pen
Paraformaldehyde (PFA), 16% Merck 8.18715
Penicillin G sodium salt Sigma-Aldrich P3032
Penicillin-streptomycin (Pen/Strep) Gibco 15140-122
Petri dish Corning 353002
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010-015
Pipette (P20, P200, P1000) Eppendorf or others 2231300006
Plastic transfer pipette (3.5 mL) Sarstedt 86.1171.001
Rabbit IgG (Alexa 488) secondary antibody Thermo Fisher Scientific A21206
RSPO1 PeproTech 120-38
SB202190 (p38i) Biotechne (Tocris) 1264
Scalpel (surgical blade) Swann-Morton 207
SHH R&D Systems 464-SH-200
Silicone molds (Heating block) VWR 720-1918
Sodium Chloride (NaCl) BDH 102415K
Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) Merck 106329
Sodium-pyruvate (C3H3NaO3) Sigma-Aldrich P-5280
SOX2 antibody Abcam ab92494
StepOnePlus Thermo Fisher Scientific Real-Time PCR System
Stericup-GP, 0.22 µm Millipore SCGPU02RE
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm Millipore SCGP00525
Sterile 1000 μL pipette tips with filter Greiner 740288
Sterile 20 μL pipette tips with filter Greiner 774288
Sterile 200 μL pipette tips with and without filter Greiner 739288
Sterile H2O Fresenius B230531
Streptomycin sulfate salt Sigma-Aldrich S6501
Superscript III first-strand synthesis supermix Invitrogen 11752-050 Reverse transcription kit
Tissue processor Thermo Scientific 12505356
Transferrin Serva 36760.01
Triton X-100 Sigma T8787-50ML
TrypLE express Gibco 12605-010
Vectashield mounting medium+DAPI Labconsult NV H-1200 Antifade mounting medium with DAPI
WNT3a Biotechne (Tocris) 5036-WN-500
Xylenes, 99%, for biochemistry and histology VWR 2,89,75,325

References

  1. Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development (Cambridge). 147 (2), (2020).
  2. Arrow, P. Dental enamel defects, caries experience and oral health-related quality of life: a cohort study. Australian Dental Journal. 62 (2), 165-172 (2017).
  3. Mitsiadis, T. A., Orsini, G., Jimenez-Rojo, L., Zavan, B., Bressan, E. Dental Stem Cells for Tooth Regeneration. Dental Stem Cells: Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. , (2016).
  4. Mitsiadis, T. A., Orsini, G. Editorial: a new era in dentistry: stem cell-based approaches for tooth and periodontal tissue regeneration. Frontiers in Physiology. 7, 357 (2016).
  5. Miran, S., Mitsiadis, T. A., Pagella, P. Innovative dental stem cell-based research approaches: the future of dentistry. Stem Cells International. 2016, 7231038 (2016).
  6. Shinmura, Y., Tsuchiya, S., Hata, K. I., Honda, M. J. Quiescent epithelial cell rests of malassez can differentiate into ameloblast-like cells. Journal of Cellular Physiology. 217 (3), 728-738 (2008).
  7. Davis, E. M. A review of the epithelial cell rests of Malassez on the bicentennial of their description. Journal of Veterinary Dentistry. 35 (4), 290-298 (2018).
  8. Athanassiou-Papaefthymiou, M., Papagerakis, P., Papagerakis, S. Isolation and characterization of human adult epithelial stem cells from the periodontal ligament. Journal of Dental Research. 94 (11), 1591-1600 (2015).
  9. Kim, G. -. H., et al. Differentiation and establishment of dental epithelial-like stem cells derived from human ESCs and iPSCs. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-16 (2020).
  10. Nam, H., et al. Establishment of Hertwig’s epithelial root sheath/ epithelial rests of malassez cell line from human periodontium. Molecules and Cells. 37 (7), 562-567 (2014).
  11. Nam, H., et al. Expression profile of the stem cell markers in human hertwig’s epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells. Molecules and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).
  12. Tsunematsu, T., et al. Human odontogenic epithelial cells derived from epithelial rests of Malassez possess stem cell properties. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1063-1075 (2016).
  13. Artegiani, B., Clevers, H. Use and application of 3D-organoid technology. Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).
  14. Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
  15. Cox, B., et al. Organoids from pituitary as a novel research model toward pituitary stem cell exploration. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
  16. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  17. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development (Cambridge). 144 (10), 1775-1786 (2017).
  18. Schutgens, F., Clevers, H. Human organoids: tools for understanding biology and treating diseases). Annual Review of Pathology. 15, 211-234 (2020).
  19. Hemeryck, L., et al. Organoids from human tooth showing epithelial stemness phenotype and differentiation potential. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (3), 153 (2022).
  20. Gao, X., Wu, Y., Liao, L., Tian, W. Oral organoids: progress and challenges. Journal of Dental Research. 100 (5), 454-463 (2021).
  21. Binder, M., et al. Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation. Scientific Reports. 10 (1), 4963 (2020).
  22. Xiong, J., Mrozik, K., Gronthos, S., Bartold, P. M. Epithelial cell rests of malassez contain unique stem cell populations capable of undergoing epithelial-mesenchymal transition. Stem Cells and Development. 21 (11), 2012-2025 (2012).
  23. Luan, X., Ito, Y., Diekwisch, T. G. H. Evolution and development of Hertwig’s epithelial root sheath. Developmental Dynamics. 235 (5), 1167-1180 (2006).
  24. Fukumoto, S., et al. New insights into the functions of enamel matrices in calcified tissues. Japanese Dental Science Review. 50 (2), 47-54 (2014).
  25. Consolaro, A., Consolaro, M. F. M. O. ERM functions, EGF and orthodontic movement or Why doesn’t orthodontic movement cause alveolodental ankylosis. Dental Press Journal of Orthodontics. 15 (2), 24-32 (2010).
  26. Guajardo, G., et al. Immunohistochemical localization of epidermal growth factor in cat paradental tissues during tooth movement. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 118 (2), 210-219 (2000).
  27. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  28. Gonçalves, J., Sasso-Cerri, E., Cerri, P. Cell death and quantitative reduction of rests of Malassez according to age. Journal of Periodontal Research. 43 (4), 478-481 (2008).
  29. Kim, J., Koo, B. -. K., Knoblich, J. A. Human organoids: Model systems for human biology and medicine. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
  30. Razmi, M. T., Narang, T., Handa, S. ADULT (acro-dermato-ungual-lacrimal-tooth) syndrome: a case report from India. Indian Dermatology Online Journal. 9 (3), 194 (2018).
  31. . Future Health Biobank Available from: https://futurehealthbiobank.com/ch-en/ (2022)
  32. Schreurs, R. R. C. E., Baumdick, M. E., Drewniak, A., Bunders, M. J. In vitro co-culture of human intestinal organoids and lamina propria-derived CD4+ T cells. STAR Protocols. 2 (2), 100519 (2021).
  33. Fiorini, E., Veghini, L., Corbo, V. Modeling cell communication in cancer with organoids: Making the complex simple. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 166 (2020).
  34. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  35. Zhang, Y., et al. Polyisocyanide hydrogels as a tunable platform for mammary gland organoid formation. Advanced Science. 7 (18), 2001797 (2020).
  36. Mollaki, V. Ethical challenges in organoid use. BioTech. 10 (3), 12 (2021).

Play Video

Cite This Article
Hemeryck, L., Lambrichts, I., Bronckaers, A., Vankelecom, H. Establishing Organoids from Human Tooth as a Powerful Tool Toward Mechanistic Research and Regenerative Therapy. J. Vis. Exp. (182), e63671, doi:10.3791/63671 (2022).

View Video