دراسة المناعة الموروثة في نموذج Caenorhabditis elegans لعدوى Microsporidia
Summary
إن عدوى Caenorhabditis elegans بواسطة الطفيلي المجهري Nematocida parisii تمكن الديدان من إنتاج ذرية شديدة المقاومة لنفس العامل الممرض. هذا مثال على المناعة الموروثة ، وهي ظاهرة جينية غير مفهومة جيدا. يصف هذا البروتوكول دراسة المناعة الموروثة في نموذج دودة قابلة للسحب وراثيا.
Abstract
تصف المناعة الموروثة كيف يمكن لبعض الحيوانات أن تنقل “ذاكرة” عدوى سابقة إلى ذريتها. هذا يمكن أن يعزز مقاومة مسببات الأمراض في ذريتهم ويعزز البقاء على قيد الحياة. في حين تم الإبلاغ عن المناعة الموروثة في العديد من اللافقاريات ، فإن الآليات الكامنة وراء هذه الظاهرة اللاجينية غير معروفة إلى حد كبير. تؤدي عدوى Caenorhabditis elegans بواسطة العامل الممرض الطبيعي Nematocida parisii إلى إنتاج الديدان ذرية مقاومة بقوة ل microsporidia. يصف هذا البروتوكول دراسة المناعة بين الأجيال في نموذج عدوى N. parisii –C. elegans البسيط والوراثي. تصف المقالة الحالية طرق إصابة C. elegans وتوليد ذرية مناعية. يتم إعطاء طرق أيضا لفحص مقاومة عدوى microsporidia عن طريق تلطيخ microsporidia وتصور العدوى عن طريق الفحص المجهري. على وجه الخصوص ، تمنع المناعة الموروثة غزو الخلايا المضيفة بواسطة microsporidia ، ويمكن استخدام التهجين الفلوري في الموقع (FISH) لتحديد أحداث الغزو. يمكن تحديد الكمية النسبية من جراثيم microsporidia المنتجة في النسل المناعي عن طريق تلطيخ الجراثيم بصبغة ملزمة للكيتين. حتى الآن ، ألقت هذه الطرق الضوء على الحركية وخصوصية مسببات الأمراض للمناعة الموروثة ، وكذلك الآليات الجزيئية الكامنة وراءها. هذه التقنيات ، إلى جانب الأدوات الواسعة المتاحة لأبحاث C. elegans ، ستمكن من اكتشافات مهمة في مجال المناعة الموروثة.
Introduction
المناعة الموروثة هي ظاهرة جينية حيث يمكن أن يؤدي تعرض الوالدين لمسببات الأمراض إلى تمكين إنتاج ذرية مقاومة للعدوى. وقد ظهر هذا النوع من الذاكرة المناعية في العديد من اللافقاريات التي تفتقر إلى أجهزة المناعة التكيفية ويمكن أن تحمي من الأمراض الفيروسية والبكتيرية والفطرية1. في حين أن المناعة الموروثة لها آثار مهمة على فهم كل من الصحة والتطور ، فإن الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه الحماية غير معروفة إلى حد كبير. ويرجع ذلك جزئيا إلى أن العديد من الحيوانات التي وصفت فيها المناعة الموروثة ليست كائنات حية نموذجية راسخة للبحث. وعلى النقيض من ذلك، تستفيد الدراسات التي أجريت على الديدان الخيطية الشفافة Caenorhabditis elegans من مجموعة أدوات وراثية وكيميائية حيوية واسعة النطاق2،3، وجينوم مشروح للغاية4،5، ووقت جيل قصير. في الواقع ، مكنت الأبحاث في C. elegans من تحقيق تقدم أساسي في مجالات علم الوراثة اللاجينية والمناعة الفطرية 6,7 ، وهي الآن نموذج راسخ لدراسة الذاكرة المناعية 8,9.
Microsporidia هي مسببات الأمراض الفطرية التي تصيب جميع الحيوانات تقريبا وتسبب التهابات قاتلة في البشر الذين يعانون من نقص المناعة10. تبدأ العدوى عندما يحقن بوغ microsporidia أو “يطلق” محتوياته الخلوية (sporoplasm) في خلية مضيفة باستخدام بنية تسمى الأنبوب القطبي. يؤدي التكرار داخل الخلايا للطفيلي إلى تكوين ميرونتس ، والتي تتمايز في النهاية إلى جراثيم ناضجة يمكنها الخروج من الخلية11,12. في حين أن هذه الطفيليات ضارة بصحة الإنسان والأمن الغذائي ، لا يزال هناك الكثير لتعلمه عن بيولوجيا العدوى12. Nematocida parisii هو طفيلي ميكروسبوريديان طبيعي يتكاثر حصريا في الخلايا المعوية للديدان ، مما يؤدي إلى انخفاض الخصوبة ، وفي النهاية ، الموت. تم استخدام نموذج عدوى N. parisii –C. elegans لإظهار: (1) دور الالتهام الذاتي في إزالة مسببات الأمراض13 ، (2) كيف يمكن ل microsporidia الخروج من الخلايا المصابة بشكل غير منطقي 14 ، (3) كيف يمكن لمسببات الأمراض أن تنتشر من خلية إلى أخرى عن طريق تشكيل syncytia 15 ، (4) البروتينات N. parisii تستخدمها للتفاعل مع مضيفها 16 ، و (5) تنظيم استجابة مسببات الأمراض داخل الخلايا النسخية (IPR) 17 ، 18.
يتم وصف بروتوكولات عدوى C. elegans في العمل الحالي ويمكن استخدامها للكشف عن بيولوجيا microsporidia الفريدة وتشريح استجابة المضيف للعدوى. يظهر الفحص المجهري للديدان الثابتة الملطخة بصبغة ربط الكيتين Direct Yellow 96 (DY96) انتشار العدوى لجراثيم microsporidia المحتوية على الكيتين في جميع أنحاء الأمعاء. كما يتيح تلطيخ DY96 تصور أجنة الدودة المحتوية على الكيتين للتقييم المتزامن لجاذبية الدودة (القدرة على إنتاج الأجنة) كقراءة للياقة البدنية للمضيف.
وقد كشفت الأبحاث الحديثة أن C. elegans المصابة ب N. parisii تنتج ذرية مقاومة بقوة لنفس العدوى19. تستمر هذه المناعة الموروثة جيلا واحدا وتعتمد على الجرعة ، حيث أن النسل من الآباء المصابين بشدة أكثر مقاومة للميكروسبوريديا. ومن المثير للاهتمام ، أن النسل الجاهز ل N. parisii هو أيضا أكثر مقاومة لمسببات الأمراض المعوية البكتيرية Pseudomonas aeruginosa ، على الرغم من أنها ليست محمية ضد الممرض الطبيعي Orsay virus19. يظهر العمل الحالي أيضا أن النسل المناعي يحد من غزو الخلايا المضيفة بواسطة microsporidia. تصف الطريقة أيضا جمع النسل المناعي وكيف يمكن استخدام FISH للكشف عن الحمض النووي الريبي N. parisii في الخلايا المعوية لفحص غزو الخلايا المضيفة وإطلاق الجراثيم20.
معا ، توفر هذه البروتوكولات أساسا متينا لدراسة microsporidia والمناعة الموروثة في C. elegans. ومن المأمول فيه أن يتيح العمل المستقبلي في هذا النظام النموذجي اكتشافات هامة في مجال المناعة الموروثة الوليد. ومن المرجح أيضا أن تكون هذه التقنيات نقاط انطلاق للتحقيق في المناعة الموروثة التي يسببها الميكروسبوريديا في الكائنات الحية المضيفة الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول دراسة microsporidia والمناعة الموروثة في نموذج عدوى N. parisii –C. elegans بسيط وقابل للسحب وراثيا.
إعداد بوغ هو بروتوكول مكثف ينتج عادة ما يكفي من الجراثيم لمدة 6 أشهر من التجارب ، اعتمادا على الإنتاجية24. الأهم من ذلك ، يجب تحديد العدوى لكل “الكثير” …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن ممتنون لويني جاو وين تشن وان لتقديمهما تعليقات مفيدة على المخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (المنحة رقم 522691522691).
Materials
| 2.0 mm zirconia beads | Biospec Products Inc. | 11079124ZX | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 1482613 | |
| 5 μm filter | Millipore Sigma | SLSV025LS | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | – | Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides |
| Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Zeiss | – | For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR |
| Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench | Baker | – | |
| Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V | Global Industrial | T9FB893150 | |
| Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers | Fisher Scientific | DRM600 | |
| Direct Yellow 96 | Sigma-Aldrich | S472409-1G | |
| EverBrite Mounting Medium with DAPI | Biotium | 23001 | |
| EverBrite Mounting Medium without DAPI | Biotium | 23002 | |
| Fiji/ImageJ software | ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| Mechanical rotor | Thermo Sceintific | 415110 / 1834090806873 | Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching |
| MicroB FISH probe | Biosearch Technologies Inc. | – | Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5' modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG |
| N2 | Wild-type, Bristol strain | Default strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-100G | |
| Sodium hydroxide solution (5 N) | Fisher Chemical | FLSS256500 | |
| Sodium hypochlorite solution (6%) | Fisher Chemical | SS290-1 | |
| Stemi 508 Stereo Microscope | Zeiss | – | For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Vectashield + A16 | Biolynx | VECTH1500 |
References
- Tetreau, G., Dhinaut, J., Gourbal, B., Moret, Y. Trans-generational immune priming in invertebrates: current knowledge and future prospects. Frontiers in Immunology. 10, 1938 (2019).
- Au, V., et al. CRISPR/Cas9 methodology for the generation of knockout deletions in Caenorhabditis elegans. G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (1), 135-144 (2019).
- Kamath, R. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
- The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
- Yoshimura, J., et al. Recompleting the Caenorhabditis elegans genome. Genome Research. 29, 1009-1022 (2019).
- Weinhouse, C., Truong, L., Meyer, J. N., Allard, P. Caenorhabditis elegans as an emerging model system in environmental epigenetics: C. elegans as an environmental epigenetics model. Environmental and Molecular Mutagenesis. 59 (7), 560-575 (2018).
- Ermolaeva, M. A., Schumacher, B. Insights from the worm: the C. elegans model for innate immunity. Seminars in Immunology. 26 (4), 303-309 (2014).
- Willis, A. R., Sukhdeo, R., Reinke, A. W. Remembering your enemies: mechanisms of within-generation and multigenerational immune priming in Caenorhabditis elegans. TheFEBS Journal. 288 (6), 1759-1770 (2020).
- Burton, N. O., et al. Cysteine synthases CYSL-1 and CYSL-2 mediate C. elegans heritable adaptation to P. vranovensis infection. Nature Communications. 11, 1741 (2020).
- Wadi, L., Reinke, A. W. Evolution of microsporidia: an extremely successful group of eukaryotic intracellular parasites. PLoS Pathogens. 16, 1008276 (2020).
- Han, B., Takvorian, P. M., Weiss, L. M. Invasion of host cells by microsporidia. Frontiers in Microbiology. 11, 172 (2020).
- Tamim El Jarkass, H., Reinke, A. W. The ins and outs of host-microsporidia interactions during invasion, proliferation and exit. Cellular Microbiology. 22 (11), 13247 (2020).
- Balla, K. M., Lažetić, V., Troemel, E. R. Natural variation in the roles of C. elegans autophagy components during microsporidia infection. PLoS ONE. 14, 0216011 (2019).
- Szumowski, S. C., Estes, K. A., Troemel, E. R. Preparing a discreet escape: Microsporidia reorganize host cytoskeleton prior to non-lytic exit from C. elegans intestinal cells. Worm. 1 (4), 207-211 (2012).
- Balla, K. M., Luallen, R. J., Bakowski, M. A., Troemel, E. R. Cell-to-cell spread of microsporidia causes Caenorhabditis elegans organs to form syncytia. Nature Microbiology. 1 (11), 1-6 (2016).
- Reinke, A. W., Balla, K. M., Bennett, E. J., Troemel, E. R. Identification of microsporidia host-exposed proteins reveals a repertoire of rapidly evolving proteins. Nature Communications. 8, 14023 (2017).
- Bakowski, M. A., et al. Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans. PLoS Pathogen. 10, 1004200 (2014).
- Reddy, K. C., et al. An intracellular pathogen response pathway promotes proteostasis in C. elegans. Current Biology. 27 (22), 3544-3553 (2017).
- Willis, A. R., et al. A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring. Science Advances. 7 (19), (2021).
- Tamim El Jarkass, H., et al. An intestinally secreted host factor promotes microsporidia invasion of C. elegans. eLife. 11, 72458 (2022).
- Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. 49, 2496 (2011).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Estes, K. A., Szumowski, S. C., Troemel, E. R. Non-lytic, actin-based exit of intracellular parasites from C. elegans intestinal cells. PLOS Pathogens. 7, 1002227 (2011).
- Botts, M. R., Cohen, L. B., Probert, C. S., Wu, F., Troemel, E. R. Microsporidia intracellular development relies on myc interaction network transcription factors in the host. G3 Genes|Genomes|Genetics. 6 (9), 2707-2716 (2016).
- Corsi, A. K. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
- Rivera, D. E., Lažetić, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize microbial colonization and infection in the Caenorhabditis elegans intestines. bioRxiv. , (2022).
- Zhang, G., et al. A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes. PLoS Pathogens. 12, 1006093 (2016).
- Luallen, R. J., et al. Discovery of a natural microsporidian pathogen with a broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans. PLoS Pathogens. 12, 1005724 (2016).
- Troemel, E. R., Félix, M. -. A., Whiteman, N. K., Barrière, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6, 309 (2008).
- Burton, N. O., et al. Intergenerational adaptations to stress are evolutionarily conserved, stress-specific, and have deleterious trade-offs. eLife. 10, 73425 (2021).
- Jaroenlak, P., et al. 3-Dimensional organization and dynamics of the microsporidian polar tube invasion machinery. PLoS Pathogens. 16, 1008738 (2020).
- Weidner, E., Manale, S. B., Halonen, S. K., Lynn, J. W. Protein-membrane interaction is essential to normal assembly of the microsporidian spore invasion tube. The Biological Bulletin. 188 (2), 128-135 (1995).
