双室渗透支持系统中的犬肠类器官

该研究获得批准并按照爱荷华州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC-19-337;国际药典-18-065;国际协调理事会-19-017）。下一节（步骤 1.1-1.3）介绍了渗透性支持播种协议， 图 3 总结了这些步骤。 图 3：渗透性支持播种方案的工作流程。 渗透性支撑插入物用CMGF + R / G，胶原I和细胞外膜基质的组合预涂并随后孵育。吸出来自犬类器官培养物的培养基并用细胞恢复溶液替换，然后在4°C下孵育30分钟。 随后将培养物转移到管中，并使用胰蛋白酶样蛋白酶进行类器官解离。通过过滤器去除未分离的类器官以获得单细胞悬浮液，并使用血细胞计数器或自动细胞计数器测定细胞浓度。将细胞接种在可渗透的支撑插入物上，并将CMGF + R / G添加到基底外侧室中。然后将培养物孵育24小时，并将剩余的液体从顶端室中取出并用CMGF + R / G代替。GSKiβ = 糖原合酶激酶β;CMGF + R / G = 具有通过岩石抑制剂和GSKiβ增强的生长因子的完整培养基。 请点击此处查看此图的大图。 1. 渗透性支持播种方案 渗透性支撑嵌件的预涂层 根据 表1中的信息，制备具有用Rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂和糖原合酶激酶-β抑制剂（GSKiβ）（CMGF + R / G）增强的生长因子的完整培养基。 准备一个冰桶，开始在冰上解冻细胞外膜基质。将包含所需插入片段数的24孔板放入培养箱中以进行预热。收集大鼠尾巴胶原蛋白I（3毫克/毫升）并将其放在冰上，同时避光。收集超前生长因子 + R/G 并将其放在冰上。 计算实验所需的插入片段和空白的总数，为每个插入片段保留100μL包衣溶液。注意：准备比所需更多的涂层溶液;建议至少准备比需要多15%。 在15mL管中，将CMGF + R / G与细胞外膜基质（1%）和胶原I（1%）混合，然后轻轻移液混合物。 用100μL包衣溶液涂覆每个聚酯插入物，并将插入物置于培养箱（37°C; 5%CO2 气氛）中1小时。 孵育后，使用真空吸出器或P1000移液管小心地从每个插入物上吸出包膜溶液，注意不要干扰插入物过滤器。将预涂好的板放入培养箱中保温。 犬类器官解离注意：使用已经培养至少四天的犬类类器官。在开始解离之前，参考Gabriel等人38 来确定样品何时健康，致密且足以进行实验。建议在每个孔电镀程序中解离一个额外的类器官孔。此外，建议将所需插入片段的数量增加约20%，以解释不均匀的类器官生长或由不当操作引起的损伤。如果计划使用FITC-葡聚糖，请准备额外的孔。 在生物安全柜中准备一个冰桶和一小瓶冷的1x高级DMEM / F12储备。 将细胞外膜基质放在冰上开始解冻，将其浸入冰中以防止快速解冻并避免凝固。将一盒移液器吸头（P200）放入冰箱中，用于细胞外膜基质的电镀。 将冷冻离心机预冷至4°C。 将 CMGF+ R/G 从冰箱/冰箱移至 37 °C 水浴中。尽可能避免直射光线。 用类器官培养物从24孔板中取出所有培养基以获得适当数量的孔（每2-4个插入片段24孔板的1孔），同时注意不要干扰细胞外膜基质。注意：体积可能因所使用的细胞计数系统而异。 每孔加入0.5 mL预冷细胞回收溶液以溶解细胞外膜基质圆顶。 将板在冰箱（4°C）中孵育30分钟。 移液悬浮液，收集所有类器官和溶解的细胞外膜基质，并将其转移到15 mL管中。 离心（700× g 在4°C下5分钟）并除去上清液，直到水平达到0.5mL标记，确保不干扰沉淀。 加入1mL胰蛋白酶样蛋白酶，并在37°C水浴中孵育8分钟。在孵育期间轻拂管几次以混合细胞。 将带有样品的试管转移回生物安全柜，并缓慢加入7 mL预冷的AddEM / F12以灭活胰蛋白酶样蛋白酶并停止细胞解离。 用 1 mL 高级 DMEM/F12 预拭 40 μm 细胞滤网。轻轻移取混合物并过滤悬浮液;移液器附加高级DMEM / F12以冲洗过滤器。 在4°C下离心管（700× g5 分钟）并除去上清液。请勿打扰颗粒。 将细胞沉淀重悬于约50-100μL培养基（CMGF + R / G）中，用于解离的每个类器官孔。 使用血细胞计数器或适当的机器计数悬浮液的子样品（〜10μL），并确定悬浮液中的总细胞数。 犬类器官播种 稀释或浓缩细胞悬浮液，以获得每毫升约75，000个细胞的细胞浓度。 将100μL悬浮液的种子放入每个插入片段中，使用BSA（1%）预涂包封尖以避免细胞在转移过程中粘附。添加一个涂层插入物作为无细胞空白，没有任何类器官生长，同时仍接受常规的培养基更换。 以圆周运动轻轻旋转板约30秒，以将接种细胞分散在插入片段上。通过光学显微镜确认细胞的均匀分布。 向基底外侧室中加入700μL CMGF + R / G，并将板置于培养箱（37°C; 5%CO2 气氛）中24小时。 24小时后，轻轻地从顶端室中取出细胞悬浮液，并用200μLCMGF + R / G替换它，将板返回到培养箱中。 2. 类器官细胞单层维持方案 注意：以下部分（步骤2.1-2.2）描述了类器官细胞单层维护方案。 图 4 总结了该协议中介绍的过程的工作流程。 补充表1中提供了一个笔记表，可以帮助TEER值测量的标准化。 图 4：渗透性支持培养物维护的工作流程。 TEER值使用电极（探头）和伏特/欧姆表进行测量。探头在插入孔中之前，必须用70%的酒精进行化学灭菌。测量空白和类器官细胞插入物，并计算TEER值。随后在顶端和基底外侧腔室中刷新培养基，并使用光学显微镜观察插入物上的犬类器官培养物。根据方案记录和处理类器官培养物或微孔膜中的撕裂。简称：TEER = 经上皮电阻。 请点击此处查看此图的大图。 透射率值测量注意：TEER值测量使用带有筷子附件的上皮伏特/欧姆计进行。请参阅制造商的使用说明。TEER值提供有关犬类器官单层完整性的信息。 在细胞培养生长期间每隔一天进行TEER值测量。 将上皮伏特/欧姆计及其电极移至生物安全柜。使用前用70%酒精对电极进行化学灭菌。将函数设置为欧姆。等待至少一分钟，直到电极变干。 在进行第一次测量之前，将线电极插入端口并打开电源。确保仪表显示 1，000 Ω，带电极插件，而不是测量筷子。如果不是这种情况，请调整设备。 将电极插入无细胞插入物（空白）的顶端和基底外侧室中，因此顶端室包含较短的电极，基底外侧室包含较长的电极（如图 4所示）。不要触摸膜，但同时要确保电极浸没在介质中。 等待几秒钟，直到值稳定下来，并在实验书中记下该值。测量剩余的犬类有机体单层，确保在测量不同样品时用70%的酒精对电极进行灭菌。注意不要用电极接触类器官单层。 测量后，最后一次用70%酒精对电极进行灭菌。请务必保护它们免受不当操作造成的损坏，并根据制造商的说明进行存放。 使用等式 （1） 计算每个孔的TEER值，其中R样品 和R空白 分别是来自单层和空白孔的欧姆（Ω）值，面积（cm²）是插入片段的面积（cm²）。 （1） 单层维护注：查看 表 2 中建议的介质更改计划。 使用无菌的一次性9“巴斯德移液器和真空吸气器，轻轻地从顶端吸出培养基，然后从基底外侧腔吸出培养基。倾斜板以清楚地看到介质表面。避免吸入太靠近顶端室中的微孔膜，以防止损坏细胞单层。注意：在样品之间移动时使用新的巴斯德移液器。移液器也是该程序的可能替代品。 使用 P1000 移液器缓慢加入 CMGF+ R/G，靶向顶端或基底外侧室的壁。在顶端腔中非常小心地进行介质更换，以避免损坏单层。 每隔一天在光学显微镜下检查孔，评估培养物的健康状况并监测类器官单层或微孔膜中的撕裂。使用相差显微镜突出显示培养物的细节。注意：在犬类类器官单层撕裂的情况下，单层有时间恢复和再生。在微孔膜撕裂的情况下，必须将孔排除在实验之外。 表2：类器官培养的培养基更换建议。 CMGF + R / G每隔一天在每隔一天的孔的顶端和基底外侧室中改变一次。周末较长的培养期要求在基底外侧和顶端腔中增加培养基的体积，该培养基在周五下午施用，并在周一更换。缩写：ROCK = rho相关激酶;GSKiβ = 糖原合酶激酶β;CMGF + R / G = 具有通过岩石抑制剂和GSKiβ增强的生长因子的完整培养基。 请按此下载此表格。 3. 渗透率实验方案 注：以下部分（步骤 3.1-3.5）介绍了渗透率实验方案。测量药物 体外 通透性的实验方案工作流程总结在 图5中。 图5：实验方案的工作流程。 在接种插入片段后8至12天之间，必须将类器官培养基从CMGF + R / G更改为CMGF +，以便进行细胞分化。将培养基（顶端和基底外侧）改为CMGF +后，TEER值仍应增加，犬类器官单层几乎达到汇合。在培养基变为CMGF +后至少四天，评估单层的准备情况。当单层完全形成，并且TEER值达到平台阶段（通常在1，500和2，500 Ω.cm2之间）时，将培养基更换为运输缓冲液30分钟，以使单层适应新环境。在实验时间为0分钟时，进行FITC-葡聚糖测定，并收集20分钟基底外侧样品。随后在读板器上分析结果。实验结束后，将顶端和基底外侧腔内容物再次更改为CMGF +，并获取TEER值读数。将单层孵育24小时，并通过重复的TEER测量评估单层的完整性。缩写：TEER =跨上皮电阻;岩石 = 罗氏相关激酶;GSKiβ = 糖原合酶激酶β;CMGF + R / G =具有用岩石抑制剂和GSKiβ增强的生长因子的完全培养基;CMGF+ = 具有生长因子但不含岩石抑制剂或GSKiβ的完全培养基;FITC = 异硫氰酸荧光素;F = 荧光。 请点击此处查看此图的大图。 评估类器官单层的准备情况注意：此步骤在播种后 8-14 天进行。 至少每隔一天在光学显微镜下检查一次单层（使用相差来可视化单层的完整性）。当细胞单层完全形成而没有间隙或明显的撕裂迹象时，继续下一步。 将类器官培养基从CMGF + R / G更改为CMGF +（不包括培养基成分中的岩石抑制剂和GSKiβ）。建议在实验前至少四天更换培养基。注意：此步骤将允许类器官单层的适当分化。 继续测量大约每隔一天测量一次TEER值。当TEER值开始稳定在大约1，500至2，000 Ω ×平方厘米（图6）时，每天测量TEER值。注意：这种稳定状态可以保持大约2-3天，这是执行渗透性测试的最佳时间窗口（通常在第11至13天）。高原TEER值可能会根据类器官的肠道定位，测量温度，品种，年龄和狗的疾病状态而略有振荡。 立即安排药物渗透性测定，以避免TEER值迅速下降或类器官单层过度生长到多个细胞层。 准备实验注意：在实验过程中可以使用培养箱振荡器，以避免无结垢水层的影响。在一致的温度下测量TEER值。 在实验当天，测量TEER值并确认值达到稳定状态并且没有迅速下降。 从过量的20%插入物中选择最佳的单层（通过光学显微镜和TEER值）来执行实验。 在光学显微镜下观察单层，并排除不完整，撕裂或过度生长的类器官单层。 准备转运缓冲液并将其pH值调整为所需值。注意：实验缓冲液的组成因实验设置而异。常用的缓冲液由汉克的平衡盐溶液（HBSS），葡萄糖（12.5 mM）和4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸（HEPES，25 mM）组成。该组合物确保了实验期间类器官培养的可行性。 小心地从所选孔的顶端和基底外侧室中吸出培养基。 向顶端室加入200μL运输缓冲液，向基底外侧室加入800μL。注意：运输缓冲液应首先添加到顶端室，然后添加到基底外侧室，以避免单层从微孔膜上脱落。 将板置于培养箱（37°C; 5%CO2 气氛）中30分钟以平衡。注意：犬类类器官单层现在已准备好进行药物渗透性实验。 典型实验布局-IgY浓度溶液注意：实验设计和布局可能会根据研究问题而变化。免疫球蛋白Y（IgY）通过类器官单层的渗透性在方案中用作示例，并且可以进行修饰。术语供体室是指最初应用药物的腔室，而接受室是指接受来自供体室的药物的室。典型的实验在2小时（例如，15，30，60，90，120分钟）的接收器室中收集样品。 通过将IgY溶液溶解在运输缓冲液中以达到所需的最终浓度来制备IgY溶液（选择的药物或溶质）。准备比所需更多的药物溶液。注意：水溶性低的药物可以先溶解在有机溶剂（例如乙醇，DMSO）中，然后再加入到缓冲液中。溶剂的最终浓度应小于1%，以免损坏电池单层。 从每个孔的供体室（顶端或基底外侧室）中取出缓冲液。 将IgY溶液（药物溶液）加入所有供体室。使用剩余的溶液作为时间0供体溶液来测量初始药物浓度。 在所需的时间点，从接收室中取出50μL并将其置于标记的管中。在最后一个时间点，从供体室中取出样品。在实验结束时，将供体和受体等分试样转移到-20°C冰箱中。注意：如果需要许多时间点，可以更换接收室中的缓冲液，但在计算表观渗透率时必须考虑在内。在实验结束时，在供体室中浓度不应超过供体室的10%，以保持沉没条件44。 类器官细胞单层质量控制注意：在实验过程中，FITC-葡聚糖溶液可用于确认单层完整性。FITC-葡聚糖被用作单层完整性测定的一个例子。其他包括路西法黄，PEG-4000，放射性标记的甘露醇和菊粉44。 在0分钟时，吸取顶端室的内容物，并为每个实验组一式三份更换250μLFITC-葡聚糖溶液（5mg / mL，4 kDa）。注意：不要将FITC-葡聚糖暴露在光线下。 20分钟后，从基底外侧室中取出缓冲液。 使用荧光板读数器测量基底外侧样品的荧光强度（使用校准曲线，激发设置为485nm，发射值设置为528nm）。注意：FITC的P应用程序 也可以使用讨论中描述的方法计算。 实验结束后，小心地从顶端和基底外侧腔中吸取多余的缓冲液。 在顶端室中加入200μLCMGF +，向基底外侧室中加入700μL。 测量各个孔中的TEER值。 将板置于培养箱（37°C; 5%CO2 气氛）中24小时。 如果适用，在24小时后，测量TEER值以评估在实验的质量控制部分对单层的可能损坏。使用光学显微镜可视化犬类器官单层的完整性。 用于下游分析的固定细胞单层 制备福尔马林 – 乙酸 – 醇溶液（FAA，组成在 表1中）。 使用P1000移液器或无菌一次性9“巴斯德移液器和真空抽吸器从顶端和基底外侧室中取出运输缓冲液或CMGF +。 用 FAA 填充顶腔和基底腔。 24小时后，吸入FAA并用70%乙醇代替。 用柔性实验室薄膜包裹板以防止蒸发并继续阻止制备。 图 6：跨实验组的 TEER 值。 在五组犬肠类器官单层中测量TEER值。三组由犬空肠类组成，两组由类结肠组成。每组包括12至22次重复。空肠类培养物的TEER值从第4天到第14天显示，结肠培养物从第4天到第12天显示（测量结束于类器官单层达到稳态值，表明单层已准备好用于实验）。误差线表示测量的扫描电镜。简称：TEER = 经上皮电阻。 请点击此处查看此图的大图。