3D 프린팅과 전기방사를 결합하여 생체모방 심장 판막 전단지 제조
Summary
제시된 방법은 3차원(3D) 스캐폴드(예: 심장 판막 전단지)에서 생체 모방 섬유 구조를 엔지니어링하는 혁신적인 방법을 제공합니다. 3D 인쇄된 전도성 형상은 모양과 치수를 결정하는 데 사용되었습니다. 섬유 배향 및 특성은 각 층에 대해 개별적으로 조정가능하였다. 하나의 설정으로 여러 샘플을 제조 할 수 있습니다.
Abstract
전기 방사는 조정 가능한 특성을 가진 (마이크로) 섬유질 스캐폴드를 만들 수있는 가능성을 제공하기 때문에 심혈관 조직 공학에서 널리 사용되는 기술이되었습니다. 이 연구의 목적은 전도성 3D 인쇄 수집기를 사용하여 인간 심장 판막 전단지의 건축 섬유 특성을 모방 한 다층 스캐폴드를 만드는 것이 었습니다.
대동맥 밸브 커셉의 모델은 상용 컴퓨터 지원 설계 (CAD) 소프트웨어를 사용하여 만들어졌습니다. 전도성 폴리락트산은 3D 프린트된 리플릿 템플릿을 제작하는 데 사용되었습니다. 이 커셉 네거티브는 특별히 설계된 회전 전기 방사 맨드렐에 통합되었습니다. 폴리우레탄의 세 층이 수집기 위로 회전하여 인간 심장 판막의 섬유 배향을 모방했습니다. 표면 및 섬유 구조는 주사 전자 현미경 (SEM)으로 평가되었다. 형광 염료의 적용은 또한 다층 섬유 구조의 현미경 시각화를 허용했습니다. 스캐폴드의 생체역학적 특성을 평가하기 위해 인장 시험을 수행하였다.
전기방사 장비를 위한 필수 부품의 3D 프린팅은 저렴한 예산으로 단기간에 가능했다. 이 프로토콜에 따라 만들어진 대동맥 판막 커셉은 섬유 직경이 4.1 ± 1.6 μm인 3층으로 제작되었습니다. SEM 이미징은 섬유의 균일 한 분포를 보여주었습니다. 형광 현미경 검사는 서로 다르게 정렬 된 섬유를 가진 개별 층을 밝혀 냈으며, 각 층은 원하는 섬유 구성에 정확하게 도달했습니다. 제조된 스캐폴드는 특히 정렬 방향을 따라 높은 인장 강도를 보였다. 다른 컬렉터의 인쇄 파일은 보조 파일 1, 보조 파일 2, 보충 파일 3, 보조 파일 4 및 보조 파일 5로 사용할 수 있습니다.
고도로 전문화 된 설정 및 워크 플로우 프로토콜을 사용하면 여러 층에 걸쳐 복잡한 섬유 구조가있는 조직을 모방 할 수 있습니다. 3D 인쇄 컬렉터에서 직접 회전하면 낮은 생산 비용으로 3D 모양을 제조할 때 상당한 유연성을 얻을 수 있습니다.
Introduction
심혈관 질환은 서구 국가에서 사망의 주요 원인입니다 1. 이 분야에서 광범위한 연구가 수행되었지만 퇴행성 심장 판막 질환의 부담은 향후2 년 동안 더욱 증가 할 것으로 추정됩니다. 외과 적 또는 중재 적 심장 판막 교체는 치료 옵션으로 가능합니다. 이 시점에서 기계적 및 생체 보철 심장 판막을 사용할 수 있으며 둘 다 개별적인 단점이 있습니다. 기계식 밸브는 혈전성이며 평생 항응고가 필요합니다. 생물학적 판막은 항응고를 필요로하지 않지만, 리모델링 부족, 높은 석회화 속도 및 수반되는 분해를 보여줍니다3.
조직 조작된 심장 판막은 생체 내 리모델링을 허용하는 미세섬유성 스캐폴드를 체내에 도입함으로써 이러한 단점을 해결할 수 있을 것이다. 다양한 방법, 예를 들어, 전기방사(ESP), 탈세포화, 마이크로몰딩, 스프레이, 딥코트 및 3D-바이오프린팅이 이용가능하다. 이러한 방법은 특정 속성을 만들거나 저렴하고 빠르거나 대안이 부족하기 때문에 선택할 수 있습니다. 방법과 재료를 결합하여 더 복잡한 구조를 만들 수도 있습니다4. 예를 들어, ESP는 조직 공학에서 스캐폴드를 만드는 표준 기술이었으며, 다양한 재료의 조합과 섬유 직경, 섬유 방향 및 다공성의 조정을 허용합니다 4. 또한, 다양한 후처리 기술은 최적화된 조직 리모델링, 개선된 혈적합성, 및 전기방사된 스캐폴드 5,6,7의 조절가능한 생분해를 가능하게 한다.
기본 ESP는 정적 또는 회전 컬렉터를 사용하며, 이는 섬유 정렬 정도와 획득 된 섬유 직경8에 직접적인 영향을 미칩니다. 제조 제한으로 인해 클래식 ESP 회전 수집기는 회전 드럼, 디스크, 와이어 또는 금속 막대로 구성됩니다. 3D 프린팅의 도입은 전통적인 제조 기술에 의해 제한되지 않는보다 개인화 된 수집가 형상을 만들 수있게합니다. 이 개별화는 심장 판막 전단지와 같은 3D 구조물을 만드는 데 특히 유용합니다.
인간 심장 판막 전단지의 자연적인 삼층 (fibrosa, spongiosa, ventricularis) 구조는 심장 주기 9,10 동안 노출되는 기계적 힘과 전단 응력에 대한 조직의 반응입니다. 라미나 섬유사의 섬유는 원주적으로 배향되는 반면, 라미나 스폰지오사의 섬유는 무작위로 정렬되고 라미나 심실의 섬유는 방사상으로 정렬됩니다. 따라서 상응하는 섬유 배향을 갖는 삼중 층이 조직 공학 스캐폴드에서 이러한 밸브의 특성을 모방하도록 제안된다.
워크플로우 프로토콜은 3D 프린팅 및 전기방사를 사용하여 3층 3D 심장 판막 전단지를 제작하는 혁신적인 방법을 설명합니다. 또한 모든 레이어에서 정확한 섬유 방향을 보장하기 위해 품질 관리 단계가 제공됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
설명 된 프로토콜은 (심혈관) 조직 공학 분야에서 두 가지 혁신을 제시합니다 : 전기 방사를위한 완전히 3D 인쇄 팬텀의 저비용 제조와 적응 가능한 다층 심장 판막 전단지를 생산하기위한 다목적 수집기의 사용.
최근에, 3D 프린팅은 실험실 장비, 예를 들어, 생물반응기 또는 제조 및 테스트 셋업(11,12)의 생산을 위한 유용한 도구가 되었다. 따라서, 본 연구에서 제시한 전기방사 셋업을 단시간 내에 저렴한 예산으로 제조할 수 있었다(표 1). 이것은 3D 프린팅(13)을 사용하여 전기 방사 설정의 저비용 생산에 대한 이전의 발견과 일치합니다.
또한 저자가 아는 한, 전도성 3D 프린팅 소재를 사용하여 심장 판막 전단지용 전기방사 컬렉터를 만든 것은 이번이 처음입니다. 지금까지, 3D 프린팅된 컬렉터는 금속 레이저 소결(14 )에 의해 제조되거나 비전도성 폴리머 프린팅 및 도전성 코팅(15)을 사용한 후속 후처리를 사용하여 제작되었다. 이 새로운 접근 방식과는 달리, 이러한 절차는 더 비싸거나, 훨씬 더 오래 걸리거나, 더 많은 육체 노동이 필요하기 때문에 상당한 단점에 처해 있습니다.
전기 방사는 생성 된 섬유의 형태학에 영향을 미치는 다양한 변수에 달려 있습니다. 다른 상용 전기 방사 설정이 시중에서 판매되고 있지만, 많은 연구 그룹은 특정 요구 사항16에 부합하기 위해 고도로 개인화 된 설정을 사용합니다. 이 점을 고려하여 이 프로토콜에서 설명하는 값(전압, 거리 및 회전 속도)은 개별 설정에 맞게 조정해야 할 수 있으며 고정 값이 아닌 시작점으로 간주되어야 합니다. 또한, 환경 파라미터가 전기방사 결과(17,18)에 상당한 영향을 미칠 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 전기 방사 장비 내에서 적어도 온도와 습도를 제어하는 것이 좋습니다. 최적의 전기방사 결과는 21°C와 24°C 사이의 온도에서 15-20% 상대 습도 사이에서 얻어졌다. 이 프로토콜을 따르기 위해서는 약 300g 무게의 콜렉터를 2,000rpm의 회전 속도로 가속할 수 있는 모터, 1-3mL/h의 작은 부피 유량에 적합한 시린지 펌프, ±20kV 직류(DC)를 지원하는 이중 극 전원 공급 장치가 필수적입니다.
이전의 연구들과 일치하여, 형광 현미경(19)에 의해 전기방사된 스캐폴드의 섬유질 구조를 가시화할 수 있었다. 다양한 섬유 배향을 포함하는 스캐폴드의 다층 구조를 성공적으로 입증할 수 있었다. 특히 여러 층 또는 여러 재료로 작업 할 때 형광 염료의 도입은 엄격한 품질 관리를위한 표준 절차로 간주되어야합니다. 매개 변수 또는 워크플로 프로토콜의 변경 후 결과의 시각적 평가를 향상시킬 수 있습니다. 생체내 또는 시험관내 평가에 사용되는 스캐폴드에서의 염료의 적용은 권장될 수 없다. 이는 확립 된 분석 방법과의 간섭을 피하는 데 중요합니다.
자연 심장 판막 형태를 모방하는 것은 심장 판막 보철물로 사용되는 조직 조작 복제물을 생성하는 데 매우 중요합니다 (그림 4B). 특정 밸브 기하학이 생체내 리모델링(20)에 높은 영향을 미친다는 것이 밝혀졌다. 이러한 맥락에서, 전기 방사를 위한 전단지 형상의 3D 프린팅은 반복이 쉽고 빠르게 구현되기 때문에 유리하다. 개인화 된 판막 기하학의 생산조차도 상상할 수 있으며 예를 들어 교육 목적으로 심장 판막 이상에 대한 개별적이고 개인화 된 3D 모델의 후속 개발이 가능합니다.
조직 공학 심장 판막 특성의 추가 개선은 여러 연구 그룹이 정의 된 섬유 방향을 가진 다층 스캐폴드를 개발하기 위해 노력했기 때문에 현재 연구 노력의 중심에 있습니다. Masoumi et al. 성형된 폴리글리세롤 세바케이트 층 및 전기방사된 폴리카프로락톤(PCL) 섬유 매트(21)로부터 제조된 복합 스캐폴드. 따라서, 삼중 층은 미세제작된 폴리글리세롤 세바케이트의 시트에 의해 분리된 두 개의 배향된 전기방사 층으로부터 생성될 수 있었다. 그러나 손에 든 스캐폴드와는 달리, 그들은 3D 모양도 아니었고 중간 층 (spongiosa)을 적절하게 모방하지도 않았습니다. 생체 영감을받은 조직 공학 심장 판막을 생산하는 또 다른 접근법은 Jana et al.22,23에 의해 추구되었습니다. 그들은 PCL 기반 전기 방사를 위해 알루미늄 수집기를 사용하여 지향 섬유가있는 삼중 층 스캐폴드를 성공적으로 생산했습니다. 다시 말하지만,이 스캐폴드는 2D 외관 만 가지고 있기 때문에 형태 학적 불완전 성을 보여 주었고 최종 스캐폴드는 스포크에 의해 충만 해집니다.
이 프로토콜은 3D, 삼중 층으로 된 심장 판막 전단지가 어떻게 생산되는지에 대한 자세한 정보를 제공하지만 실제 심장 판막 보철물을 만드는 데 필요한 몇 가지 단계가 더 있습니다. 여기에 설명 된 전단지에는 직경 24mm의 스텐트를 사용하는 것이 좋습니다. 사용된 스텐트에 상보적으로, 전단지는 스티칭을 위한 추가적인 지지 구조를 제공받을 수 있다. 최대한의 유연성을 허용하기 위해 여기에 표시된 전단지는 특정 스텐트 설계로 개별화되지 않습니다. 이것은 CAD 소프트웨어를 사용하여 템플릿을 변경하는 것만으로 수행 할 수 있습니다.
심장 판막 조직 공학에 사용되지만, 제시된 방법은 정형 외과24, 비뇨기과 25, 이비인후과26 및 기타의 전기 방사 설정에 쉽게 적용 할 수 있습니다. 정교한 및/또는 개별화된 3D 구조물의 생산은 다른 3D 인쇄 컬렉터의 구현에 의해 실현 가능하다. 컬렉터의 재질은 변경되었지만 전기 방사의 원리는 그대로 유지됩니다27. 따라서, 상이한 중합체의 사용은 이론적으로 가능하지만, 전기방사 파라미터의 조정이 필요할 수 있다.
전반적으로, 제시된 프로토콜은 다층 심장 판막 전단지를 제조하는 쉽고 비용 효율적인 방법을 설명합니다. 3D 프린팅의 적용은 컬렉터와 인서트의 빠른 적응과 수정을 허용합니다. 이것은 예를 들어, 금속 수집기의 복잡한 제조 공정 없이 환자 특이적 보철물의 생산을 허용한다. 동일한 조건에서 한 번에 여러 샘플을 만들 수 있습니다. 따라서 재료 파괴 테스트는 실제 밸브를 구축하기 위해 (거의) 동일한 것들이 남아 있다는 이점으로 샘플에 대해 수행 될 수 있습니다. 이 연구에서 인쇄 파일을 보충 파일로 포함시키는 것은 다층 심장 판막 스캐폴드의 발전을 지원하기위한 것입니다. 이 새로운 전기 방사 기술은 수정 된 수집가 및 기타 3D 인쇄 된 회전 템플릿이 구현하기 쉽기 때문에 재생 의학의 다른 분야에 대한 높은 잠재력을 가지고 있습니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation), 프로젝트 번호 MA 2186 / 14-1이 자금을 지원하는 혈관 의학의 임상의 과학자 프로그램 (PRIME)의 지원을 받았습니다.
Materials
| BTC-FR2.5TN.D09 | ZwickRoell GmbH & Co. KG | Traction engine (Tensile tests) | |
| C5-E Motor Controller | Nanotec Electronic GmbH & Co. KG | Motor controll unit | |
| CH1: CPN 30 kV | 0.3 mA | iseg Spezialelectronik GmbH | Power Supply Unit Anode | |
| CH1: CPN 30 kV | 0.3 mA | iseg Spezialelektronik GmbH | Power Supply Unit Kathode | |
| Conductive Composite PLA | ProtoPasta | Conductive PLA | |
| Cura 4.7.1 | Ultimaker BV | Slicing Software Ultimaker, step 1.1.2 | |
| DAPI Stock Solution c = 0.1 mg/mL | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | DAPI | |
| Disposable Scalpel No. 23 | FEATHER | Scalpel | |
| Fluorescein (C.I. 45350) M 376.28 g/mol | Carl Roth GmbH + Co. KG | Fluorescein | |
| Fume Hood as per DIN 12924 Class 2 | Köttermann GmbH | Fume Hood | |
| Leica Applicatin Suite X 3.5.5.19976 | Leica Microsystems GmbH | Software for Confocal Laser Scanning Microscope | |
| Luerlock Syringe 20 mL | BD Plastipak | Luerlock Syringe | |
| Metal needle plane 2.50/2.00 x 20 mm | Unimed S.A. | Needle with plane tip | |
| Montage-complet-tubes; inner diameter x outer diameter: 1/16" x 1/8", length 1.000 mm | Bohlender GmbH | F740-28 | Solvent resistant tubes |
| N,N-Dimethylformamide ≥99.8% | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | Dimethylformamide | |
| Pellethane 2363 80AE | Velox GmbH Hamburg | Polyurethane | |
| PLA | Ultimaker BV | PLA | |
| Plug&Drive Studio (1.0.4) | Nanotec Electronic GmbH & Co. KG | Motor operation software | |
| SEM Evo LS 10 | Zeiss MicroImaging GmbH | Scanning Electron Microscope | |
| SHT 31-D | Adafruit Industries | Temperature and Humidity Sensor | |
| SolidWorks 2020 CAD Software | Dassault Systèmes | Commercial CAD Software | |
| Sulforhodamine 101 50 mg | Sigma – Aldrich | S 7635 | Texas Red |
| Syringe Pump Model: Fusion 100 | Chemyx Inc. | Syringe Pump | |
| TCS SP8 inverted CEL BMi8 | Leica Microsystems GmbH | Confocal Laser Scanning Microscope | |
| testXpert V11.02 | ZwickRoell GmbH & Co. KG | Software Tensile Test | |
| Tetrahydrofuran ≥99.9% | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | Tetrahydrofuran | |
| Type 1511530000202 #980361 | Binder Labortechnik GmbH | Heating Cabinet | |
| Ultimaker 3 Extended | Ultimaker BV | 3D Printer |
References
- Van Camp, G. Cardiovascular disease prevention. Acta Clinica Belgica. 69 (6), 407-411 (2014).
- Iung, B., Vahanian, A. Epidemiology of valvular heart disease in the adult. Nature Reviews Cardiology. 8 (3), 162-172 (2011).
- Fioretta, E. S., et al. Cardiovascular tissue engineering: From basic science to clinical application. Experimental Gerontology. 117 (1), 1-12 (2019).
- Xue, J., Wu, T., Dai, Y., Xia, Y. Electrospinning and electrospun nanofibers: methods, materials, and applications. Chemical Reviews. 119 (8), 5298 (2019).
- Grande, D., Ramier, J., Versace, D. L., Renard, E., Langlois, V. Design of functionalized biodegradable PHA-based electrospun scaffolds meant for tissue engineering applications. New Biotechnology. 37, 129-137 (2017).
- Tara, S., et al. Well-organized neointima of large-pore poly(l-lactic acid) vascular graft coated with poly(l-lactic-co-ε-caprolactone) prevents calcific deposition compared to small-pore electrospun poly(l-lactic acid) graft in a mouse aortic implantation model. Atherosclerosis. 237 (2), 684-691 (2014).
- Voorneveld, J., Oosthuysen, A., Franz, T., Zilla, P., Bezuidenhout, D. Dual electrospinning with sacrificial fibers for engineered porosity and enhancement of tissue ingrowth. Journal of Biomedical Material Research. 105 (6), 1559-1572 (2017).
- Kishan, A. P., Cosgriff-Hernandez, E. M. Recent advancements in electrospinning design for tissue engineering applications: A review. Journal of Biomedical Materials Research. 105 (10), 2892-2905 (2017).
- Sacks, M. S., David Merryman, W., Schmidt, D. E. On the biomechanics of heart valve function. Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).
- Buchanan, R. M., Sacks, M. S. Interlayer micromechanics of the aortic heart valve leaflet. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (4), 813-826 (2014).
- Gensler, M., et al. 3D printing of bioreactors in tissue engineering: A generalised approach. PLoS One. 15 (11), 0242615 (2020).
- Grab, M., et al. Customized 3D printed bioreactors for decellularization-High efficiency and quality on a budget. Artificial Organs. 45 (12), 1477-1490 (2021).
- Huang, J., Koutsos, V., Radacsi, N. Low-cost FDM 3D-printed modular electrospray/electrospinning setup for biomedical applications. 3D Printing in Medicine. 6 (1), 8 (2020).
- Fukunishi, T., et al. Preclinical study of patient-specific cell-free nanofiber tissue-engineered vascular grafts using 3-dimensional printing in a sheep model. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 153 (4), 924-932 (2017).
- Jana, S., Lerman, A. In vivo tissue engineering of a trilayered leaflet-shaped tissue construct. Regenerative Medicine. 15 (1), 1177-1192 (2020).
- Hasan, A., et al. Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts. Acta Biomaterialia. 10 (1), 11-25 (2014).
- Wang, X., Ding, B., Yu, J., Yang, J. Large-scale fabrication of two-dimensional spider-web-like gelatin nano-nets via electro-netting. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 86 (2), 345-352 (2011).
- Yang, G. -. Z., Li, H. -. P., Yang, J. -. H., Wan, J., Yu, D. -. G. Influence of working temperature on the formation of electrospun polymer nanofibers. Nanoscale Research Letters. 12 (1), 55 (2017).
- Ekaputra, A. K., Prestwich, G. D., Cool, S. M., Hutmacher, D. W. Combining electrospun scaffolds with electrosprayed hydrogels leads to three-dimensional cellularization of hybrid constructs. Biomacromolecules. 9 (8), 2097-2103 (2008).
- Motta, S. E., et al. Geometry influences inflammatory host cell response and remodeling in tissue-engineered heart valves in-vivo. Scientific Reports. 10 (1), 19882 (2020).
- Masoumi, N., et al. Tri-layered elastomeric scaffolds for engineering heart valve leaflets. Biomaterials. 35 (27), 7774-7785 (2014).
- Jana, S., Lerman, A. Behavior of valvular interstitial cells on trilayered nanofibrous substrate mimicking morphologies of heart valve leaflet. Acta Biomaterialia. 85, 142-156 (2019).
- Jana, S., Franchi, F., Lerman, A. Trilayered tissue structure with leaflet-like orientations developed through in vivo tissue engineering. Biomedical Materials. 15 (1), 015004 (2019).
- Zhou, Y., Chyu, J., Zumwalt, M. Recent progress of fabrication of cell scaffold by electrospinning technique for articular cartilage tissue engineering. International Journal of Biomaterials. 2018, 1953636 (2018).
- Zamani, M., Shakhssalim, N., Ramakrishna, S., Naji, M. Electrospinning: application and prospects for urologic tissue engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 579925 (2020).
- Heilingoetter, A., Smith, S., Malhotra, P., Johnson, J., Chiang, T. Applications of Electrospinning for Tissue Engineering in Otolaryngology. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 130 (4), 395-404 (2020).
- Xue, J., Xie, J., Liu, W., Xia, Y. Electrospun nanofibers: new concepts, materials, and applications. Accounts of Chemical Research. 50 (8), 1976-1987 (2017).
