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医学

Combinación de impresión 3D y electrohilado para fabricar folletos biomiméticos de válvulas cardíacas

Published: March 23, 2022
doi:
10.3791/63604
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1Department of Cardiac Surgery,Ludwig Maximilians University Munich, 2Chair of Medical Materials and Implants,Technical University Munich, 3Faculty for Chemistry and Pharmacy,Ludwig Maximilians University Munich, 4Cardiovascular Research Unit,University of Cape Town, 5DZHK (German Centre for Cardiovascular Research), partner site Munich Heart Alliance

Summary

El método presentado ofrece una forma innovadora de diseñar estructuras de fibras biomiméticas en andamios tridimensionales (3D) (por ejemplo, valvas de válvulas cardíacas). Se utilizaron geometrías conductoras impresas en 3D para determinar la forma y las dimensiones. La orientación y las características de la fibra fueron ajustables individualmente para cada capa. Se pueden fabricar varias muestras en una sola configuración.

Abstract

El electrohilado se ha convertido en una técnica muy utilizada en la ingeniería de tejidos cardiovasculares, ya que ofrece la posibilidad de crear andamios (micro)fibrosos con propiedades ajustables. El objetivo de este estudio fue crear andamios de múltiples capas que imitaran las características arquitectónicas de la fibra de las valvas de las válvulas cardíacas humanas utilizando colectores conductores impresos en 3D.

Los modelos de cúspides de válvula aórtica se crearon utilizando software comercial de diseño asistido por computadora (CAD). Se utilizó ácido poliláctico conductor para fabricar plantillas de folletos impresas en 3D. Estos negativos de cúspide se integraron en un mandril de electrohilado giratorio específicamente diseñado. Tres capas de poliuretano se hicieron girar sobre el colector, imitando la orientación de la fibra de las válvulas cardíacas humanas. La estructura de la superficie y la fibra se evaluaron con un microscopio electrónico de barrido (SEM). La aplicación de tinte fluorescente también permitió la visualización microscópica de la estructura de fibra multicapa. Se realizaron pruebas de tracción para evaluar las propiedades biomecánicas de los andamios.

La impresión 3D de piezas esenciales para la plataforma de electrohilado fue posible en poco tiempo con un bajo presupuesto. Las cúspides de la válvula aórtica creadas siguiendo este protocolo eran de tres capas, con un diámetro de fibra de 4,1 ± 1,6 μm. Las imágenes SEM revelaron una distribución uniforme de las fibras. La microscopía de fluorescencia reveló capas individuales con fibras alineadas de manera diferente, y cada capa alcanzó con precisión la configuración de fibra deseada. Los andamios producidos mostraron una alta resistencia a la tracción, especialmente a lo largo de la dirección de alineación. Los archivos de impresión para los diferentes recopiladores están disponibles como Archivo suplementario 1, Archivo complementario 2, Archivo complementario 3, Archivo complementario 4 y Archivo complementario 5.

Con una configuración altamente especializada y un protocolo de flujo de trabajo, es posible imitar tejidos con estructuras de fibra complejas en múltiples capas. Girar directamente sobre colectores impresos en 3D crea una flexibilidad considerable en la fabricación de formas 3D a bajos costos de producción.

Introduction

Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de muerte en los países occidentales 1. Aunque se realizan extensas investigaciones en este campo, se estima que la carga de la enfermedad degenerativa de las válvulas cardíacas aumentará aún más durante los próximos años2. El reemplazo quirúrgico o intervencionista de la válvula cardíaca es posible como una opción terapéutica. En este punto, las válvulas cardíacas mecánicas y bioprotésicas están disponibles, ambas con inconvenientes individuales. Las válvulas mecánicas son trombogénicas y requieren anticoagulación de por vida. Aunque las válvulas biológicas no requieren anticoagulación, muestran una falta de remodelación, una alta tasa de calcificación y una degradación concomitante3.

Las válvulas cardíacas de ingeniería tisular podrían abordar estos inconvenientes mediante la introducción de un andamio microfibroso en el cuerpo que permita la remodelación in vivo. Varios métodos, por ejemplo, electrohilado (ESP), descelularización, micromoldeo, pulverización, dip-coat y bioimpresión 3D, están disponibles. Estos métodos se pueden elegir para crear propiedades específicas, siendo más baratos y rápidos, o simplemente debido a la falta de alternativas. Los métodos y materiales incluso se pueden combinar para crear estructuras más complejas4. Por ejemplo, esp ha sido una técnica estándar para crear andamios en ingeniería de tejidos, permitiendo la combinación de diferentes materiales y el ajuste de diámetros de fibra, orientaciones de fibra y porosidades4. Además, una variedad de técnicas de postprocesamiento permiten optimizar la remodelación de los tejidos, mejorar la hemocompatibilidad y la biodegradación ajustable de los andamios electrohilados 5,6,7.

El ESP básico utiliza colectores estáticos o giratorios, que influyen directamente en el grado de alineación de la fibra y en los diámetros de fibra obtenidos8. Debido a las restricciones de fabricación, los colectores giratorios ESP clásicos consisten en tambores giratorios, discos, alambres o varillas de metal. La introducción de la impresión 3D permite la creación de geometrías de colector más individualizadas que no están limitadas por las técnicas de fabricación tradicionales. Esta individualización es especialmente útil para la creación de construcciones 3D como las valvas de las válvulas cardíacas.

La arquitectura natural de tres capas (fibrosa, spongiosa, ventricularis) de las valvas de las válvulas cardíacas humanas es la respuesta de los tejidos a las fuerzas mecánicas y al estrés cortante al que están expuestos durante el ciclo cardíaco 9,10. Las fibras de la lámina fibrosa están orientadas circunferencialmente, mientras que las fibras de la lámina espongiosa están alineadas aleatoriamente y las de la lámina ventricularis radialmente. Por lo tanto, se propone una triple capa con las orientaciones de fibra correspondientes para imitar las propiedades de estas válvulas en un andamio de ingeniería tisular.

El protocolo de flujo de trabajo describe un método innovador para producir valvas de válvula cardíaca 3D de tres capas utilizando impresión 3D y electrohilado. Además, se presenta un paso de control de calidad para garantizar una orientación precisa de la fibra en cada capa.

Protocol

1. Trabajos preparatorios Impresión 3DNOTA: Los siguientes pasos requieren la descarga de los archivos “Standard Triangle Language” (STL) proporcionados como Archivo Suplementario 1, Archivo Suplementario 2, Archivo Suplementario 3, Archivo Suplementario 4 y Archivo Suplementario 5 con este manuscrito. Las piezas del colector se proporcionan como archivos STL. La brida de conexión se proporciona como archivo “STandard for the Exchange of Product model data” (STEP) para permitir el ajuste del colector para que se ajuste a configuraciones individuales. Además, se proporciona un dibujo técnico para las varillas metálicas centrales para la fabricación convencional como Expediente Suplementario 6. Abra el software de corte (consulte la Tabla de materiales) y configure el cabezal de impresión activo para ácido poliláctico no conductor (PLA) y una boquilla de 0,4 mm.NOTA: El software de corte, el filamento y el diámetro de la boquilla pueden variar según la impresora 3D disponible. Cargue los archivos STL Specimen_mount_A (Archivo suplementario 3) y Speciment_mount_B (Archivo suplementario 4) en el software de segmentación. Gire los modelos, de modo que las superficies triangulares se coloquen en la placa de construcción. Marque todas las piezas, haga clic con el botón derecho y seleccione Multiplicar modelos seleccionados. Escriba 1 en el símbolo del sistema Número de copias y haga clic en Aceptar. Coloque un total de cuatro modelos en la placa de construcción. Establezca el grosor de la rebanada en 0,1 mm, el grosor de la pared en 1 mm, la densidad de relleno en el 40 % y desactive la casilla Generar soporte . Haga clic en el botón Dividir | Guarde en Extraíble para guardar el archivo de impresión en una unidad USB. Cargue PLA no conductor en la impresora e inicie el archivo de impresión. Una vez completada la impresión, retire los modelos de la placa de construcción y compruebe si hay deformación en las esquinas inferiores. En el software de corte, mantenga los parámetros del material y reemplace los modelos con Collector_Flange (Archivo suplementario 1 y Archivo suplementario 5) y Leaflet_Template (Archivo suplementario 2). Gire la brida, de modo que la superficie circular plana esté contra la placa de construcción. Además, gire la plantilla del folleto, de modo que la superficie cuadrada se coloque directamente sobre la placa de construcción. Marque la brida y multiplique el modelo como en el paso 1.1.4. Tipo 1 para recibir 1 copia y 1 original del modelo de brida en la placa de construcción. Marque el modelo de folleto y multiplique por 8 para recibir un total de nueve modelos de folleto, siguiendo los pasos descritos en 1.1.4. Establezca el grosor de la rebanada en 0,1 mm, el grosor de la pared en 1 mm, la densidad de relleno en el 80 % y desmarque la casilla Generar soporte . Haga clic en el botón Dividir | Guarde en Extraíble para guardar el nuevo archivo de impresión en una unidad USB. Cargue PLA conductor en la impresora e inicie el proceso de impresión. Después de completar la impresión, retire los modelos de la placa de construcción. Retire cuidadosamente las fibras de filamento individuales en la parte inferior del negativo de la valva con un cortador de alambre si están presentes en los modelos de la valva (ya que no se utilizaron estructuras de soporte). Solución de hiladoPRECAUCIÓN: El tetrahidrofurano (THF) y la dimetilformamida (DMF) son disolventes dañinos que no deben inhalarse ni entrar en contacto con la piel. Se recomienda encarecidamente usar guantes resistentes a los solventes y gafas protectoras mientras los manipula. Al manipularlos, trabaje bajo un capó de escape, ya que son extremadamente volátiles. Coloque una báscula debajo de la campana de escape y coloque una botella de vidrio de tapón de rosca de 200 ml sobre ella. Tara la báscula. Vierta 50 ml de DMF y 50 ml de THF en la botella de vidrio. Tenga en cuenta el peso de los disolventes. Coloque una barra magnética dentro de la botella, colóquela en un agitador magnético y enciéndala. Multiplique el peso observado por 0,15 (= 15% p/v) y transfiera la cantidad correspondiente de poliuretano (PU) lentamente a la botella de vidrio que contiene la mezcla de disolventes (DIN 1310). Cierre la botella y revuelva durante al menos 12 h a temperatura ambiente para obtener una solución homogénea. 2. Configuración de electrohilado EnsamblajeNOTA: Como los andamios de folleto creados con el colector presentado son relativamente pequeños, se recomienda el uso opcional de un mandril de tambor de gran diámetro (D: 110 mm). Esto permite la creación de andamios más grandes y de múltiples capas, lo que será beneficioso para la evaluación microscópica, de biocompatibilidad y biomecánica. Ensamble el colector utilizando las piezas impresas en 3D y seis tornillos M3 x 15. Use tres tornillos para asegurar las varillas de metal a una de las bridas. Deslice un Specimen_mount_B entre las barras de metal. Asegúrese de que los espacios para las plantillas apunten en la dirección opuesta a la brida. Llene las tres ranuras de la Specimen_mount_B con plantillas de folletos de válvulas cardíacas. Coloque Specimen_mount_A en la parte superior y llene los espacios con plantillas. Desliza otro Specimen_mount_A y rellena los espacios con plantillas. Arregla las plantillas poniendo la segunda Specimen_mount_B encima. Coloque la segunda brida en la parte superior y use los tornillos M3 para asegurarla.NOTA: Asegúrese de que todas las plantillas de folletos estén orientadas en la misma dirección (borde recto del folleto paralelo a las varillas de metal). Coloque el colector de folleto ensamblado en la configuración de electrohilado y asegure firmemente las bridas al eje del motor (es decir, tornillos M6 y tuercas de ala) (Figura 1).PRECAUCIÓN: Como el PLA conductor es más frágil que el PLA normal, use una llave dinamométrica a 1.4 Nm al sujetar pernos que ejerzan presión sobre el material para evitar que se rompan. Coloque un soporte de aguja a 30 cm del colector. Fije una aguja de calibre 14 (G) con una punta plana en el soporte de la aguja y fíjela a la altura del eje del colector. Conecte un tubo flexible y resistente a los disolventes (por ejemplo, politetrafluoroetileno (PTFE)) al puerto luer-lock de la aguja.NOTA: DMF y THF disuelven muchos plásticos. Es necesario utilizar materiales resistentes a los disolventes cuando se trabaja con estos disolventes, por ejemplo, herramientas de metal y vidrio. Cuando se requieran herramientas de plástico (es decir, jeringa o tubo), asegúrese de usar materiales resistentes a los solventes. Guíe el tubo hasta la bomba de la jeringa para la conexión posterior de la jeringa llena de polímero. Conexión de la fuente de alimentación (PSU)PRECAUCIÓN: Durante la configuración, asegúrese de que la fuente de alimentación esté desconectada de la fuente de alimentación principal. Conecte dos cables blindados de alto voltaje al ánodo y al cátodo de la fuente de alimentación. Con un clip de cocodrilo, conecte el cable conectado al cátodo (- polo) a la aguja de 14 G. Compruebe la conexión entre el clip y la aguja. A continuación, guíe el cable de alto voltaje, para que corra fuera del área de giro para evitar interferencias. Conecte el colector al ánodo (+ polo) con un clip de cocodrilo y el segundo cable de alta tensión. Utilice un anillo deslizante o un contacto deslizante con un cable pelado para crear contacto en la brida del colector. Preparación de la jeringaNOTA: Este paso debe realizarse inmediatamente antes de que comience el proceso de centrifugado. Llene una jeringa Luer-lock de 20 ml con la solución giratoria preparada en el paso 1.2. Conecte la jeringa al tubo resistente a los disolventes y empuje manualmente la solución en el sistema de tuberías hasta que se vea una gota en la punta de la aguja. Coloque la jeringa en la bomba de la jeringa. Después de encender la bomba, ingrese los siguientes parámetros: diámetro: 19.129 mm; volumen: 5 mL; velocidad 3 mL/h. 3. Proceso de electrohilado Prueba de motorNOTA: La fabricación del colector mediante impresión 3D puede provocar un movimiento descentrado del colector. Por lo tanto, una prueba con velocidades de revolución más bajas pero sin alto voltaje es muy recomendable. Abra el software de control del motor haciendo doble clic en el icono de la computadora. Conéctese al control del motor haciendo clic en el botón Conectar . Después de conectarse, seleccione el modo de operación Velocidad de perfil y haga clic en la pestaña Operación ubicada en la esquina superior izquierda de la pantalla. Seleccione la pestaña Velocidad del perfil debajo del botón Detención rápida enmarcado por una línea roja. Escriba los siguientes ajustes: Velocidad objetivo: 200 rpm; aceleración de perfil: 100; desaceleración del perfil: 200; parada rápida: 5000.NOTA: La dirección de rotación debe ser hacia arriba en el lado de la aguja, que se puede ajustar cambiando el signo en el campo de “velocidad objetivo” de “+” a “-“. Inicie la ejecución de prueba y compruebe si hay desequilibrio en el recopilador. Si el recopilador funciona sin problemas, continúe con el protocolo. De lo contrario, detenga el motor y reajuste el colector como se describe en el paso 2.1.9. Detenga el motor haciendo clic en el botón Activar activado y cambie la velocidad objetivo a 2.000 rpm. Proceso de fabricaciónNOTA: El electrohilado es un proceso con una alta dependencia de los parámetros ambientales. Se obtuvieron resultados óptimos de electrohilado entre 15-20% de humedad relativa a una temperatura entre 21 y 24 °C.Primera capaNOTA: Durante la fase de configuración, es posible que se haya formado una gota seca de PU en la punta de la aguja. Retire la gota con una herramienta larga y no conductora, si es necesario. En el software de control del motor, haga clic en el botón Habilitar operación para encender el motor. Encienda la fuente de alimentación de alto voltaje y ajuste el voltaje tanto para el ánodo como para el cátodo: menos polo (aguja): 18 kV; más poste (colector): 1,5 kV. Arranque la bomba de la jeringa a un caudal de 3 ml/h. Ajuste un temporizador a 20 min. Observe la punta de la aguja para la formación de un cono de sastre. Dependiendo de la forma del cono en la punta de la aguja, ajuste el voltaje en el cátodo en incrementos de ±100 V hasta que se establezca un cono de sastre estable.NOTA: Si la gota está colgando, el voltaje es demasiado bajo. Sin embargo, el flujo inestable puede indicar que el voltaje es demasiado alto. Espere 20 minutos para que las plantillas de cúspide se cubran adecuadamente con fibras. Apague la bomba de la jeringa. Apague la fuente de alimentación accionando el interruptor de encendido. Detenga el motor haciendo clic en el botón Activar activado en el software de control del motor.PRECAUCIÓN: Para evitar lesiones por partes móviles en el sistema, espere hasta que el colector se haya detenido por completo para abrir la cámara de prueba. Segunda capa En el software de control del motor, modifique el campo de entrada Velocidad objetivo a 10 rpm. Repita los pasos 3.2.1.1-3.2.1.9. Tercera capaNOTA: Antes de que los andamios estén completamente secos, son extremadamente sensibles a la tensión mecánica. Tenga mucho cuidado al realizar los pasos 3.2.3.2-3.2.3.6. Evite tocar los andamios / fibras durante estos pasos, ya que el andamio podría quedar inútil. Abra con cuidado los tornillos que conectan las bridas del colector al eje del motor y retire el colector de la valva (Figura 2B) del dispositivo de electrohilado. Usando un bisturí, corte las fibras electrohiladas a lo largo del contorno exterior de cada plantilla de folleto (Figura 2C). Retire la brida de un lado del colector. Extraiga los insertos impresos en 3D y separe las plantillas de folletos de los soportes triangulares no conductores. Gire todas las plantillas de folletos en 90° y vuelva a montar el colector. Inserte el colector en la configuración de electrohilado y asegúrelo firmemente. Una vez más, verifique si hay algún desequilibrio antes de continuar con el proceso de centrifugado. En el software de control del motor, modifique la velocidad objetivo del campo de entrada a 2.000 rpm. Repita los pasos 3.2.1.1-3.2.1.9.NOTA: Después de terminar el proceso de electrohilado, se recomienda encarecidamente enjuagar el tubo y la aguja con DMF puro para evitar la obstrucción del tubo. Andamios teñidos fluorescentes (opcional)NOTA: Los colorantes fluorescentes se utilizan para hacer que las fibras sean visibles bajo un microscopio de fluorescencia convencional. Esto solo es necesario durante la implementación del método y para el control de calidad después de que se hayan aplicado nuevas configuraciones. No se recomienda el uso de colorantes fluorescentes cuando se fabrican andamios utilizando configuraciones establecidas. Divida la solución de hilado preparada en el paso 1.2 en tres porciones iguales en botellas separadas. Usando una escala, mida 1 mg de colorante fluorescente por cada gramo (0.1 wt%) de solución de polímero. Repita para los tres colorantes fluorescentes (es decir, fluoresceína, Rojo de Texas, 4′,6-diamidino-2-fenilindol [DAPI]). Agregue el tinte a la solución de hilado, cierre la tapa de la botella y revuelva durante 2-3 h o hasta la homogeneización.NOTA: Para evitar que los colorantes fluorescentes se desvanezcan, proteja la solución giratoria de la luz tanto como sea posible, es decir, colocando una cubierta opaca sobre el agitador magnético. El proceso para andamios teñidos fluorescentes es muy similar al proceso estándar descrito en los pasos 3.2.1-3.2.3. En el paso 3.2.1, reemplace la jeringa estándar por una jeringa llena de la solución giratoria que contiene el primer tinte fluorescente. En el paso 3.2.2, reemplace los tubos y la aguja utilizados actualmente por otros nuevos o limpios. Posteriormente, coloque una jeringa con la solución giratoria que contiene el segundo colorante fluorescente en la bomba de la jeringa. En el paso 3.2.3 de nuevo, reemplace el tubo y la aguja por otros nuevos o limpios y reemplace la jeringa por una que esté llena con una solución giratoria que contenga el tercer tinte fluorescente.NOTA: Para evitar retrasos durante el proceso de fabricación, es beneficioso utilizar tres juegos de tubos y agujas. Alternativamente, el tubo y la aguja se pueden enjuagar a fondo con THF y DMF entre la producción de capas hasta que no quede ninguna solución giratoria que contenga tinte fluorescente en el sistema. 4. Postprocesamiento y adquisición de muestras Andamios de postprocesamiento Retire el colector del dispositivo de electrohilado. Usando un bisturí, corte cada plantilla libre en su base como se describe en el paso 3.2.3.2. Abra el selector, como se describió anteriormente, y coloque las plantillas, en la base hacia abajo, en una bandeja. Coloque la bandeja en un armario de secado durante la noche a 40 °C. Después de que las muestras estén completamente secas, use un bisturí para cortar cuidadosamente a lo largo de los bordes de la plantilla del prospecto para eliminar las fibras excedentes. Después, pele cuidadosamente el andamio del folleto de la plantilla y colóquelo en una bandeja para su posterior procesamiento.

Representative Results

Este protocolo está dirigido al desarrollo de un andamio de triple capa destinado a su uso en la ingeniería de tejidos cardiovasculares de válvulas cardíacas. Imita la configuración de colágeno de las tres capas en la válvula cardíaca humana nativa. Cada capa consiste en fibras con un diámetro total de 4,1 ± 1,6 μm (Figura 1). Figura 1: Características de la fibra. Análisis de fibras: Recuento total de fibras; Diámetro en μm: media, modo, desviación estándar, diámetro mínimo, diámetro máximo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Las plantillas de folletos están diseñadas para adaptarse a una prótesis de válvula aórtica de Ø 24 mm (Figura 2C). Después del secado, los andamios de la valva mantuvieron su forma de una cúspide de válvula cardíaca 3D (Figura 3A). Figura 2: Configuración de electrohilado. (A) Colector impreso en 3D ensamblado en la configuración rotativa; (B) Representación CAD del colector imprimible en 3D; (C) Representación CAD de la valva de la válvula cardíaca negativa que se muestra en B; triángulo indica la parte ampliada. Abreviatura: CAD = diseño asistido por ordenador. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Se utilizaron imágenes SEM para evaluar las capas alineadas y no alineadas (TEMP F3512-21). Las fotografías se tomaron a un aumento de 100x, 500x y 2,000x en tres lugares diferentes en un andamio. Los andamios de fibra alineados aparecen con una superficie lisa y una orientación estricta en la dirección circunferencial (Figura 3B). El análisis visual de la imagen 2.000x con respecto a la orientación de la fibra confirma la alineación primaria de las fibras (Figura 3C). Los andamios de fibra no alineados muestran una superficie similarmente lisa en comparación con las fibras alineadas. La orientación de la fibra es desordenada, con muchas intersecciones prominentes entre las fibras (Figura 3D). El análisis visual posterior confirma la desalineación de fibras sin orientación primaria visible (Figura 3E). Figura 3: Folleto electrohilado e imágenes SEM. (A) Folleto multicapa Electrospun y colector de folletos impresos en 3D; (B) Imagen SEM de fibras no alineadas (aumento 1,000x); (C) Análisis de la orientación de las fibras no alineadas; (D) Imagen SEM de fibras alineadas (aumento 1,000x); (E) Análisis de orientación de fibras alineadas. Barras de escala = 10 mm (A), 100 μm (B, D). Abreviatura: SEM = microscopía electrónica de barrido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Las imágenes de andamios multicapa teñidos fluorescentes revelaron tres capas individuales con distintas orientaciones de fibra (Figura 4D). La capa inferior (Figura 4A; azul) muestra fibras alineadas en orientación horizontal con muy poca intersección entre las fibras. La capa intermedia (Figura 4B; verde) muestra fibras no alineadas sin orientación de fibra primaria. La capa superior (Figura 4C; rojo) muestra las fibras alineadas en una orientación perpendicular. El análisis visual de las capas superior e inferior revela un ángulo promedio entre las dos capas de 89°, que está de acuerdo con la rotación de 90° del colector durante el proceso de hilado (Figura 4E). Figura 4: Microscopía de fluorescencia de andamio multicapa. (A) Imagen de fluorescencia de la primera capa con orientación primaria de abajo a la izquierda a arriba a la derecha; (B) Imagen de fluorescencia de la segunda capa con orientación de fibra no alineada; (C) Imagen de fluorescencia de la tercera capa con orientación primaria de abajo a la derecha a arriba a la izquierda; (D) Imagen de fluorescencia de las tres capas combinadas en un andamio; (E) Análisis de orientación de fibra para las tres capas (Capa 1: azul; Capa 2: verde; Capa 3: rojo); aumento = 400x (A-D); barras de escala = 100 μm (A-D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. La medición del espesor se realizó en 21 muestras (Figura 5A) (TEMP F3510-21). Todas las muestras se crearon aplicando los mismos parámetros. La temperatura y la humedad podrían diferir entre 20,3 °C y 26,1 °C y 35% y 55% de humedad, respectivamente. Los resultados mostraron un aumento relativamente lineal en el espesor de ~ 2.65 μm por minuto. Otro experimento mostró la consistencia de los resultados después de 60 min de centrifugado bajo parámetros coincidentes (Figura 5B). La humedad y la temperatura podrían diferir entre el 35% y el 50% de humedad y entre 20,3 °C y 26,1 °C, respectivamente. Los resultados fueron andamios de entre 126 y 181 μm de espesor. El espesor medio fue de 151,11 ± 13,17 μm. El aumento en el espesor fue de ~ 2.52 μm por minuto, en promedio. Figura 5: Medición del espesor. (A) Espesor de los andamios por tiempo hilado; n = 21; Coeficiente de correlación (r) = 0,653; p** = 0,00132; B) Espesor de las muestras después de 60 min; n = 13; línea roja: media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Las pruebas de tracción para andamios de fibra alineados y no alineados se realizaron en dos direcciones, a lo largo de la dirección circunferencial y perpendicular a ella. Cada lechada constaba de 15 ejemplares. Las muestras se tomaron de los andamios de los aviones de acuerdo con DIN 53504: 2017-03. El espesor se midió en tres puntos diferentes en cada muestra y se utilizó para calcular los valores máximos de fuerza por mm cuadrado. Los valores de espesor se sitúan entre 0,03 y 0,2 mm. La comparación de la resistencia a la tracción final reveló una diferencia significativa (p < 0,001) entre las orientaciones para los andamios de fibra alineados (Figura 6A). Los andamios alcanzaron una resistencia máxima de 12,26 ± 2,59 N/mm2 a lo largo de la orientación circunferencial. La resistencia a la tracción se redujo a 3,86 ± 1,08 N/mm2 en la dirección perpendicular. Los andamios de fibra no alineados no muestran diferencias en la resistencia a la tracción final para las diferentes orientaciones (F1: 7.19 ± 1.75 N/ mm2, F2: 7.54 ± 1.59 N / mm2; p = 0.60). El análisis comparativo de la elongación en la rotura para los andamios de fibra alineados reveló diferencias significativas (p < 0,001) en la distensibilidad entre las direcciones (Figura 6B). La extensibilidad alcanzó 187,01 ± 39,37% en la dirección circunferencial frente a 107,16 ± 30,04% en la dirección perpendicular. Por el contrario, el alargamiento en la rotura de las esteras de fibra no alineadas reveló una extensibilidad uniforme en ambas direcciones (F1: 269,74 ± 24,78 %; F2: 285,01 ± 25,58 %; p = 0,69). Las curvas representativas de tensión-deformación muestran enormes diferencias en el comportamiento del material, dependiendo de la dirección en la que se aplica la fuerza de tracción. Las esteras de fibra no alineadas mostraron un comportamiento elástico lineal, mientras que las esteras de fibra alineadas mostraron no linealidad en la dirección axial. Figura 6: Pruebas de tracción de fibras alineadas y no alineadas. (A) Resistencia a la tracción definitiva para esteras de fibra alineadas y no alineadas en direcciones circunferenciales y axiales; n = 15; (B) Alargamiento en la rotura para esteras de fibra alineadas y no alineadas en direcciones circunferenciales y axiales; n = 15; (C) Curvas representativas de tensión-deformación de andamios alineados y no alineados, tirados en direcciones axiales y circunferenciales, respectivamente. (***p < 0,001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Métricas de fabricación Nombre Material Importe Tiempo total Peso total [g] Coste [€ por kg] Costo total 1 Specimen_Mount_A Regular PLA 2 18:19 159 51,33 € 8,16 € 2 Specimen_Mount_B Regular PLA 2 19:42 161 51,33 € 8,26 € 3 Brida colectora PLA conductor 2 10:40 95 99,98 € 9,50 € 4 Leaflet_Inlet PLA conductor 9 05:32 31 99,98 € 3,10 € Total 29,02 € Tabla 1: Métricas de fabricación. Tabla que especifica la cantidad, el tiempo de fabricación, la cantidad de material necesario y los costos de las piezas impresas en 3D. Abreviatura: PLA = ácido poliláctico. Archivo suplementario 1: Brida colectora adaptable. Step-file para adaptar e imprimir brida del colector. Haga clic aquí para descargar este archivo. Archivo suplementario 2: Plantilla de folleto. Plantilla stL-file para imprimir folletos. Haga clic aquí para descargar este archivo. Expediente suplementario 3: Montaje de muestra A. STL-file para imprimir el montaje de muestra A. Haga clic aquí para descargar este archivo. Expediente suplementario 4: Espécimen de montaje B. STL-file para imprimir el montaje de la muestra B. Haga clic aquí para descargar este archivo. Expediente suplementario 5: Brida colectora. Archivo STL para imprimir brida de colector. Haga clic aquí para descargar este archivo. Expediente suplementario 6: Biela metálica. Dibujo técnico para la construcción de bielas metálicas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

El protocolo descrito presenta dos innovaciones en el campo de la ingeniería de tejidos (cardiovasculares): la fabricación de bajo costo de fantasmas completamente impresos en 3D para electrohilado y el uso de un colector versátil para producir valvas de válvulas cardíacas adaptables y de múltiples capas.

Recientemente, la impresión 3D se ha convertido en una herramienta valiosa para la producción de equipos de laboratorio, por ejemplo, biorreactores o configuraciones de fabricación y prueba11,12. Por lo tanto, fue posible fabricar la configuración de electrohilado presentada en este estudio en un corto período de tiempo y con un presupuesto asequible (Tabla 1). Esto se mantiene en línea con los hallazgos anteriores para la producción de bajo costo de configuraciones de electrohilado mediante el uso de impresión 3D13.

Además, según el mejor conocimiento de los autores, esta es la primera vez que se utiliza un material conductor de impresión 3D para crear un colector de electrohilado para valvas de válvulas cardíacas. Hasta ahora, los colectores impresos en 3D se fabricaban mediante sinterización láser de metal14 o utilizando impresión de polímero no conductor y posterior postprocesamiento con un recubrimiento conductor15. En contraste con este enfoque novedoso, esos procedimientos están en una desventaja significativa, ya que son más caros, toman mucho más tiempo o requieren más trabajo manual.

El electrohilado depende de multitud de variables que impactan en la morfología de las fibras creadas. Aunque hay diferentes configuraciones comerciales de electrohilado disponibles en el mercado, muchos grupos de investigación utilizan configuraciones altamente individualizadas para satisfacer sus necesidades específicas16. Teniendo esto en cuenta, los valores descritos en este protocolo (voltaje, distancia y velocidad de rotación) pueden necesitar ser adaptados para configuraciones individuales y deben verse como un punto de partida en lugar de valores fijos. Además, se sabe que los parámetros ambientales pueden tener una influencia significativa en los resultados del electrohilado17,18. Por lo tanto, es muy recomendable controlar al menos la temperatura y la humedad dentro de la plataforma de electrohilado. Se obtuvieron resultados óptimos de electrohilado entre 15-20% de humedad relativa a una temperatura entre 21 y 24 °C. Para seguir este protocolo, es esencial el siguiente equipo: un motor capaz de acelerar un colector que pesa aproximadamente 300 g a una velocidad de revolución de 2.000 rpm, una bomba de jeringa adecuada para caudales de pequeño volumen de 1-3 ml / h y una unidad de fuente de alimentación de doble polo capaz de ±20 kV de corriente continua (CC).

En línea con estudios previos, fue posible visualizar la estructura fibrosa de los andamios electrohilados mediante microscopía de fluorescencia19. Fue posible demostrar con éxito la estructura de múltiples capas del andamio, incluidas las diferentes orientaciones de la fibra. Especialmente cuando se trabaja con múltiples capas o múltiples materiales, la introducción de tintes fluorescentes debe considerarse como un procedimiento estándar para un estricto control de calidad. Podría mejorar la evaluación visual de los resultados después de los cambios en los parámetros o el protocolo de flujo de trabajo. No se puede recomendar la aplicación de colorante en andamios para su evaluación in vivo o in vitro . Esto es importante para evitar interferencias con los métodos analíticos establecidos.

Imitar la morfología natural de la válvula cardíaca es de gran importancia para producir una réplica de ingeniería tisular que se utilizará como prótesis de válvula cardíaca (Figura 4B). Se ha demostrado que la geometría específica de la válvula tiene un alto impacto en la remodelación in vivo 20. En este contexto, la impresión 3D de la geometría del folleto para electrohilado es una ventaja, ya que las iteraciones son fáciles y rápidas de implementar. Incluso la producción de geometrías de válvulas personalizadas es concebible y el desarrollo posterior de modelos 3D individuales y personalizados de anomalías de válvulas cardíacas, por ejemplo, con fines de enseñanza, es posible.

La mejora adicional de las propiedades de las válvulas cardíacas de ingeniería tisular está en el centro de los esfuerzos de investigación actuales, ya que varios grupos de investigación han trabajado en el desarrollo de andamios de múltiples capas con orientaciones de fibra definidas. Masoumi et al. fabricaron andamios compuestos a partir de una capa de sebacado de poliglicerol moldeado y esteras de fibra de policaprolactona (PCL) electrohiladas21. Por lo tanto, se podría crear una triple capa a partir de dos capas de electrohilados orientados separados por una lámina de sebacado de poliglicerol microfabricado. Sin embargo, a diferencia de los andamios disponibles, no estaban en forma de 3D ni imitaban adecuadamente la capa media (spongiosa). Otro enfoque para producir una válvula cardíaca bioinspirada de ingeniería tisular fue perseguido por Jana et al.22,23. Produjeron con éxito andamios de triple capa con fibras orientadas utilizando colectores de aluminio para electrohilado basado en PCL. Una vez más, estos andamios también presentaron imperfecciones morfológicas, ya que solo tienen una apariencia 2D, y el andamio final está impregnado de radios.

A pesar de que el protocolo proporciona información detallada sobre cómo se producen las valvas de válvulas cardíacas en 3D y de triple capa, se necesitan varios pasos más para crear una prótesis de válvula cardíaca real. Se recomienda un stent de 24 mm de diámetro para las valvas aquí descritas. Complementariamente al stent utilizado, los folíolos pueden ser provistos de estructuras de soporte adicionales para la costura. Para permitir la máxima flexibilidad, los folletos que se muestran aquí no están individualizados para un diseño de stent específico. Esto se puede hacer simplemente alterando la plantilla utilizando el software CAD.

Aunque se utiliza para la ingeniería de tejido de válvulas cardíacas, el método presentado será fácilmente aplicable para configuraciones de electrohilado en ortopedia24, urología25, otorrinolaringología26 y otros. La producción de construcciones 3D sofisticadas y/o individualizadas es factible mediante la implementación de otros coleccionistas impresos en 3D. Aunque el material del colector ha cambiado, el principio de electrohilado permanece intacto27. Por lo tanto, el uso de diferentes polímeros es teóricamente posible, aunque puede ser necesario ajustar los parámetros de electrohilado.

En general, el protocolo presentado describe una forma fácil y rentable de fabricar valvas de válvulas cardíacas de varias capas. La aplicación de la impresión 3D permite una rápida adaptación y modificaciones del colector y los insertos. Esto permite la producción de prótesis específicas para el paciente sin un complicado proceso de fabricación de, por ejemplo, colectores metálicos. Se pueden crear varias muestras en una sola ejecución en condiciones idénticas. Por lo tanto, se pueden realizar pruebas destructivas de materiales en las muestras con el beneficio de tener (casi) idénticas restantes para construir la válvula real. La inclusión de los archivos de impresión como archivos suplementarios en este estudio está destinada a apoyar el avance de los andamios de válvulas cardíacas de múltiples capas. Esta nueva técnica de electrohilado también tiene un alto potencial para otros campos de la medicina regenerativa, ya que los colectores modificados y otras plantillas giratorias impresas en 3D son fáciles de implementar.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el Clinician Scientist Program In Vascular Medicine (PRIME), financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación), proyecto número MA 2186/14-1.

Materials

BTC-FR2.5TN.D09 ZwickRoell GmbH & Co. KG Traction engine (Tensile tests)
C5-E Motor Controller Nanotec Electronic GmbH & Co. KG Motor controll unit
CH1: CPN 30 kV | 0.3 mA iseg Spezialelectronik GmbH Power Supply Unit Anode
CH1: CPN 30 kV | 0.3 mA iseg Spezialelektronik GmbH Power Supply Unit Kathode
Conductive Composite PLA ProtoPasta Conductive PLA
Cura 4.7.1 Ultimaker BV Slicing Software Ultimaker, step 1.1.2
DAPI Stock Solution c = 0.1 mg/mL Sigma-Aldrich Chemie GmbH DAPI
Disposable Scalpel No. 23 FEATHER Scalpel
Fluorescein (C.I. 45350) M 376.28 g/mol Carl Roth GmbH + Co. KG Fluorescein
Fume Hood as per DIN 12924 Class 2 Köttermann GmbH Fume Hood
Leica Applicatin Suite X 3.5.5.19976 Leica Microsystems GmbH Software for Confocal Laser Scanning Microscope
Luerlock Syringe 20 mL BD Plastipak Luerlock Syringe
Metal needle plane 2.50/2.00 x 20 mm Unimed S.A. Needle with plane tip
Montage-complet-tubes; inner diameter x outer diameter: 1/16" x 1/8", length 1.000 mm Bohlender GmbH F740-28 Solvent resistant tubes
N,N-Dimethylformamide ≥99.8% Sigma-Aldrich Chemie GmbH Dimethylformamide
Pellethane 2363 80AE Velox GmbH Hamburg Polyurethane
PLA Ultimaker BV PLA
Plug&Drive Studio (1.0.4) Nanotec Electronic GmbH & Co. KG Motor operation software
SEM Evo LS 10 Zeiss MicroImaging GmbH Scanning Electron Microscope
SHT 31-D Adafruit Industries Temperature and Humidity Sensor
SolidWorks 2020 CAD Software Dassault Systèmes Commercial CAD Software
Sulforhodamine 101 50 mg Sigma – Aldrich  S 7635 Texas Red
Syringe Pump Model: Fusion 100 Chemyx Inc. Syringe Pump
TCS SP8 inverted CEL BMi8 Leica Microsystems GmbH Confocal Laser Scanning Microscope
testXpert V11.02 ZwickRoell GmbH & Co. KG Software Tensile Test
Tetrahydrofuran ≥99.9% Sigma-Aldrich Chemie GmbH Tetrahydrofuran
Type 1511530000202 #980361 Binder Labortechnik GmbH Heating Cabinet
Ultimaker 3 Extended Ultimaker BV 3D Printer
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Freystetter, B., Grab, M., Grefen, L., Bischof, L., Isert, L., Mela, P., Bezuidenhout, D., Hagl, C., Thierfelder, N. Combining 3D-Printing and Electrospinning to Manufacture Biomimetic Heart Valve Leaflets. J. Vis. Exp. (181), e63604, doi:10.3791/63604 (2022).
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