שילוב של הדפסה תלת-ממדית ואלקטרוספינינג לייצור עלוני מסתם לב ביומימטיים
Summary
השיטה המוצגת מציעה דרך חדשנית להנדסת מבנים של סיבים ביומימטיים בפיגומים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) (למשל, עלוני מסתם לב). נעשה שימוש בגיאומטריות מוליכות מודפסות בתלת-ממד כדי לקבוע צורה וממדים. כיוון הסיבים ומאפייניו היו ניתנים להתאמה בנפרד עבור כל שכבה. ניתן לייצר דגימות מרובות בהגדרה אחת.
Abstract
אלקטרוספינינג הפכה לטכניקה נפוצה בהנדסת רקמות לב וכלי דם מכיוון שהיא מציעה את האפשרות ליצור פיגומים סיביים (מיקרו)סיביים בעלי תכונות מתכווננות. מטרת מחקר זה הייתה ליצור פיגומים רב שכבתיים המחקים את מאפייני הסיבים האדריכליים של עלוני מסתמי הלב האנושיים באמצעות אספנים מוליכים המודפסים בתלת-ממד.
דגמים של שסתום אבי העורקים נוצרו באמצעות תוכנה מסחרית לתכנון בעזרת מחשב (CAD). חומצה פולילקטית מוליכה שימשה לייצור תבניות עלון מודפסות בתלת-ממד. נגטיבים אלה שולבו במנדרל אלקטרוספינינג מתוכנן ומסתובב במיוחד. שלוש שכבות של פוליאוריתן סובבו על האספן, מחקות את כיוון הסיבים של מסתמי הלב האנושיים. מבנה פני השטח והסיבים הוערך באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM). היישום של צבע פלואורסצנטי איפשר גם הדמיה מיקרוסקופית של מבנה הסיבים הרב שכבתי. בדיקות מתיחה בוצעו כדי להעריך את התכונות הביומכניות של הפיגומים.
הדפסה תלת-ממדית של חלקים חיוניים עבור מתקן האלקטרוספינינג התאפשרה תוך זמן קצר בתקציב נמוך. שסתום אבי העורקים שנוצר בעקבות פרוטוקול זה היה תלת-שכבתי, עם קוטר סיבים של 4.1 ± 1.6 מיקרומטר. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית חשפה שכבות בודדות עם סיבים מיושרים באופן שונה, כאשר כל שכבה הגיעה במדויק לתצורת הסיבים הרצויה. הפיגומים שיוצרו הראו חוזק מתיחה גבוה, במיוחד לאורך כיוון היישור. קבצי ההדפסה של האספנים השונים זמינים כקובץ משלים 1, קובץ משלים 2, קובץ משלים 3, קובץ משלים 4 וקובץ משלים 5.
עם פרוטוקול התקנה וזרימת עבודה מיוחד במיוחד, ניתן לחקות רקמות עם מבני סיבים מורכבים על פני שכבות מרובות. סיבוב ישיר על אספנים מודפסים בתלת-ממד יוצר גמישות רבה בייצור צורות תלת-ממדיות בעלויות ייצור נמוכות.
Introduction
מחלות לב וכלי דם הן סיבת המוות המובילה במדינות המערב 1. למרות שנעשה מחקר מקיף בתחום זה, ההערכה היא כי הנטל של מחלת מסתם לב ניוונית יגדל עוד יותר במהלך השנים הבאות2. החלפת מסתם לב כירורגי או התערבותי אפשרית כאופציה טיפולית. בשלב זה, מסתמי לב מכניים וביו-פרוסטטיים זמינים, שניהם עם חסרונות בודדים. שסתומים מכניים הם טרומבוגניים ודורשים נוגדי קרישה לכל החיים. למרות שסתומים ביולוגיים אינם דורשים נוגדי קרישה, הם מראים חוסר שיפוץ, שיעור גבוה של הסתיידות, והשפלה במקביל3.
מסתמי לב מהונדסים ברקמות עשויים להיות מסוגלים להתמודד עם חסרונות אלה על ידי החדרת פיגום מיקרופיברוס לגוף המאפשר שיפוץ in vivo. קיימות שיטות שונות, כגון אלקטרוספינינג (ESP), דה-סלולריזציה, מיקרומולדינג, ריסוס, ציפוי טבילה והדפסה ביולוגית תלת-ממדית. שיטות אלה ניתן לבחור ליצירת תכונות ספציפיות, להיות זול יותר ומהיר יותר, או רק בשל חוסר חלופות. שיטות וחומרים ניתן אפילו לשלב כדי ליצור מבנים מורכבים יותר4. לדוגמה, ESP הייתה טכניקה סטנדרטית ליצירת פיגומים בהנדסת רקמות, המאפשרת שילוב של חומרים שונים והתאמה של קוטרי סיבים, אוריינטציות סיבים ונקבוביות4. יתר על כן, מגוון טכניקות לאחר העיבוד מאפשרות שיפוץ רקמות אופטימלי, יכולת המו-תאימות משופרת והתכלות ביולוגית מתכווננת של פיגומי אלקטרוספון 5,6,7.
ה-ESP הבסיסי משתמש באספנים סטטיים או מסתובבים, שיש להם השפעה ישירה על מידת יישור הסיבים ועל קוטרי הסיבים המתקבלים8. בשל מגבלות הייצור, אספנים מסתובבים קלאסיים של ESP מורכבים מתופים מסתובבים, דיסקים, חוטים או מוטות מתכת. ההקדמה של הדפסה תלת-ממדית מאפשרת יצירה של גיאומטריות אספנים אינדיבידואליות יותר שאינן מוגבלות על ידי טכניקות ייצור מסורתיות. אינדיבידואליזציה זו שימושית במיוחד ליצירת מבנים תלת-ממדיים כגון עלוני מסתם לב.
הארכיטקטורה התלת-שכבתית הטבעית (פיברוסה, ספונגיוסה, חדר) של עלוני מסתמי הלב האנושיים היא תגובת הרקמות לכוחות המכניים ולעקה הגזירה שהן נחשפות אליהן במהלך מחזור הלב 9,10. הסיבים של הלמינה פיברוסה מכוונים באופן היקפי, בעוד שהסיבים של הלמינה ספונגיוסה מיושרים באופן אקראי ואלה של חדר הלמינה רדיאלי. לפיכך, מוצעת שכבה משולשת עם כיווני הסיבים המתאימים כדי לחקות את תכונותיהם של שסתומים אלה בפיגום מהונדס רקמה.
פרוטוקול זרימת העבודה מתאר שיטה חדשנית לייצור עלונים תלת-שכבתיים תלת-שכבתיים של מסתמי לב באמצעות הדפסה תלת-ממדית ואלקטרו-ספינינג. בנוסף, מוצג שלב בקרת איכות כדי להבטיח כיוון סיבים מדויק בכל שכבה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר מציג שני חידושים בתחום הנדסת הרקמות (הקרדיווסקולרית): ייצור בעלות נמוכה של פנטומים מודפסים בתלת-ממד לחלוטין עבור אלקטרוספינינג ושימוש באספן רב-תכליתי לייצור עלוני מסתם לב הניתנים להתאמה ורב-שכבתיים.
לאחרונה, הדפסה תלת-ממדית הפכה לכלי רב ערך לייצור ציוד מעבדה, למשל, ביו-ריאקטורים או הגדרות ייצור ובדיקה11,12. לכן, ניתן היה לייצר את מערך האלקטרוספינינג שהוצג במחקר זה בפרק זמן קצר ובתקציב סביר (טבלה 1). זה נשאר בקנה אחד עם ממצאים קודמים לייצור בעלות נמוכה של הגדרות אלקטרוספינינג באמצעות הדפסה תלת-ממדית13.
יתר על כן, למיטב ידיעתם של המחברים, זו הפעם הראשונה שחומר מוליך להדפסה תלת-ממדית שימש ליצירת אספן אלקטרוספינינג עבור עלוני מסתמי לב. עד כה, אספנים שהודפסו בתלת-ממד יוצרו על ידי סינטר לייזר מתכתי14 או באמצעות הדפסת פולימרים לא מוליכים ולאחר מכן עיבוד לאחר מכן עם ציפוי מוליך15. בניגוד לגישה חדשנית זו, נהלים אלה נמצאים בעמדת נחיתות משמעותית מכיוון שהם יקרים יותר, או נמשכים זמן רב יותר או דורשים עבודת כפיים רבה יותר.
אלקטרוספינינג תלוי במספר רב של משתנים המשפיעים על המורפולוגיה של הסיבים שנוצרו. אף על פי שמערכות אלקטרוספינינג מסחריות שונות זמינות בשוק, קבוצות מחקר רבות משתמשות בתצורות מותאמות אישית מאוד כדי להתאים לצרכים הספציפיים שלהן16. בהתחשב בכך, ייתכן שיהיה צורך להתאים את הערכים המתוארים בפרוטוקול זה (מתח, מרחק ומהירות סיבוב) עבור הגדרות בודדות ויש לראותם כנקודת התחלה ולא כערכים קבועים. יתר על כן, ידוע כי פרמטרים סביבתיים יכולים להשפיע באופן משמעותי על תוצאות אלקטרוספינינג17,18. לכן, מומלץ מאוד לשלוט לפחות בטמפרטורה ובלחות בתוך מתקן אלקטרוספינינג. תוצאות אלקטרוספינינג אופטימליות התקבלו בין 15-20% לחות יחסית בטמפרטורה שבין 21 ל -24 מעלות צלזיוס. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, הציוד הבא חיוני: מנוע המסוגל להאיץ אספן במשקל של כ-300 גרם עד למהירות סיבוב של 2,000 סל”ד, משאבת מזרק המתאימה לקצבי זרימה בנפח קטן של 1-3 מ”ל/שעה, ויחידת אספקת חשמל בעלת מוט כפול המסוגלת ±20 קילו-וולט זרם ישיר (DC).
בהתאם למחקרים קודמים, ניתן היה לדמיין את המבנה הסיבי של פיגומי האלקטרוספון על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית19. ניתן היה להדגים בהצלחה את המבנה הרב שכבתי של הפיגום, כולל כיווני הסיבים המשתנים. במיוחד כאשר עובדים עם שכבות מרובות או חומרים מרובים, יש לשקול את הכנסת הצבעים הפלואורסצנטיים כהליך סטנדרטי לבקרת איכות מחמירה. זה יכול לשפר את ההערכה החזותית של התוצאות לאחר שינויים בפרמטרים או בפרוטוקול זרימת העבודה. לא ניתן להמליץ על יישום צבע בפיגומים שישמש להערכת in vivo או in vitro . זה חשוב כדי למנוע הפרעה עם שיטות אנליטיות מבוססות.
לחיקוי מורפולוגיה טבעית של מסתמי לב יש חשיבות רבה כדי לייצר שכפול מהונדס רקמה שישמש כתותבת מסתם לב (איור 4B). הוכח כי לגיאומטריית השסתומים הספציפית יש השפעה גבוהה על שיפוץ in vivo 20. בהקשר זה, הדפסה תלת-ממדית של גיאומטריית העלון עבור אלקטרוספינינג היא בעלת יתרון, שכן איטרציות קלות ומהירות ליישום. אפילו ייצור של גיאומטריות מסתם מותאמות אישית מתקבל על הדעת ופיתוח מאוחר יותר של מודלים תלת ממדיים בודדים ומותאמים אישית של הפרעות במסתמי הלב, למשל, למטרות הוראה, אפשרי.
שיפור נוסף של תכונות מסתם הלב המהונדס על ידי רקמות עומד במרכז מאמצי המחקר הנוכחיים, שכן מספר קבוצות מחקר עבדו על פיתוח פיגומים רב שכבתיים עם אוריינטציות סיבים מוגדרות. Masoumi et al. ייצרו פיגומים מרוכבים משכבת סבקט פוליגליצרול יצוקה ומחצלות סיבי אלקטרוספון פוליקפרולקטון (PCL)21. לפיכך, ניתן ליצור שכבה משולשת משתי שכבות אלקטרו-ספון מכוונות המופרדות על ידי יריעה של פוליגליצרול סבקט מיקרו-פבריקטי. עם זאת, בניגוד לפיגומים שעל היד, הם לא היו בצורת תלת-ממד ולא חיקו כראוי את השכבה האמצעית (spongiosa). גישה נוספת לייצור מסתם לב מהונדס רקמות ביולוגיות נקטה על ידי Jana et al.22,23. הם ייצרו בהצלחה פיגומים תלת-שכבתיים עם סיבים מכוונים באמצעות קולטי אלומיניום עבור אלקטרוספינינג מבוסס PCL. שוב, פיגומים אלה הציגו גם פגמים מורפולוגיים, שכן יש להם רק מראה דו-ממדי, והפיגום הסופי מתפשט על ידי חישורים.
אף על פי שהפרוטוקול מספק מידע מפורט על האופן שבו מיוצרים עלונים תלת-ממדיים ותלת-שכבתיים של מסתמי לב, נדרשים מספר שלבים נוספים ליצירת תותבת מסתם לב ממשית. סטנט בקוטר 24 מ”מ מומלץ עבור העלונים המתוארים כאן. משלימים את הסטנט המשמש, ניתן לספק את העלונים עם מבני תמיכה נוספים לתפירה. כדי לאפשר גמישות מרבית, העלונים המוצגים כאן אינם מותאמים אישית לתכנון סטנט ספציפי. ניתן לעשות זאת פשוט על ידי שינוי התבנית באמצעות תוכנת CAD.
למרות שהיא משמשת להנדסת רקמות מסתם לב, השיטה המוצגת תהיה ישימה בקלות עבור תצורות אלקטרוספינינג באורתופדיה24, אורולוגיה25, אף אוזן גרון26 ואחרים. ייצור של מבנים תלת-ממדיים מתוחכמים ו/או מותאמים אישית אפשרי על ידי יישום של אספנים אחרים שהודפסו בתלת-ממד. למרות שהחומר של האספן השתנה, העיקרון של אלקטרוספינינג נשאר שלם27. לכן, השימוש בפולימרים שונים אפשרי תיאורטית, אם כי ייתכן שיהיה צורך בהתאמת הפרמטרים של אלקטרוספינינג.
בסך הכל, הפרוטוקול המוצג מתאר דרך קלה וחסכונית לייצור עלוני מסתם לב רב שכבתיים. היישום של הדפסה תלת-ממדית מאפשר הסתגלות מהירה ושינויים של האספן והתוספות. זה מאפשר ייצור של תותבות ספציפיות למטופל ללא תהליך ייצור מסובך של, למשל, אספני מתכות. ניתן ליצור דגימות מרובות בריצה אחת בתנאים זהים. לכן, ניתן לבצע בדיקות הרסניות חומריות על הדגימות עם היתרון של העובדה שנותרו (כמעט) זהות לבניית השסתום בפועל. הכללת קבצי ההדפסה כקבצים משלימים במחקר זה נועדה לתמוך בהתקדמותם של פיגומי מסתם לב רב שכבתיים. לטכניקת האלקטרוספינינג החדשה הזו יש גם פוטנציאל גבוה לתחומים אחרים של רפואה רגנרטיבית, שכן אספנים שעברו שינוי ותבניות מסתובבות אחרות שהודפסו בתלת-ממד קל ליישום.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המדענים הקלינאים ברפואת כלי דם (PRIME), במימון דויטשה פורשונגסגמיינשאפט (DFG, קרן המחקר הגרמנית), פרויקט מספר MA 2186/14-1.
Materials
| BTC-FR2.5TN.D09 | ZwickRoell GmbH & Co. KG | Traction engine (Tensile tests) | |
| C5-E Motor Controller | Nanotec Electronic GmbH & Co. KG | Motor controll unit | |
| CH1: CPN 30 kV | 0.3 mA | iseg Spezialelectronik GmbH | Power Supply Unit Anode | |
| CH1: CPN 30 kV | 0.3 mA | iseg Spezialelektronik GmbH | Power Supply Unit Kathode | |
| Conductive Composite PLA | ProtoPasta | Conductive PLA | |
| Cura 4.7.1 | Ultimaker BV | Slicing Software Ultimaker, step 1.1.2 | |
| DAPI Stock Solution c = 0.1 mg/mL | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | DAPI | |
| Disposable Scalpel No. 23 | FEATHER | Scalpel | |
| Fluorescein (C.I. 45350) M 376.28 g/mol | Carl Roth GmbH + Co. KG | Fluorescein | |
| Fume Hood as per DIN 12924 Class 2 | Köttermann GmbH | Fume Hood | |
| Leica Applicatin Suite X 3.5.5.19976 | Leica Microsystems GmbH | Software for Confocal Laser Scanning Microscope | |
| Luerlock Syringe 20 mL | BD Plastipak | Luerlock Syringe | |
| Metal needle plane 2.50/2.00 x 20 mm | Unimed S.A. | Needle with plane tip | |
| Montage-complet-tubes; inner diameter x outer diameter: 1/16" x 1/8", length 1.000 mm | Bohlender GmbH | F740-28 | Solvent resistant tubes |
| N,N-Dimethylformamide ≥99.8% | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | Dimethylformamide | |
| Pellethane 2363 80AE | Velox GmbH Hamburg | Polyurethane | |
| PLA | Ultimaker BV | PLA | |
| Plug&Drive Studio (1.0.4) | Nanotec Electronic GmbH & Co. KG | Motor operation software | |
| SEM Evo LS 10 | Zeiss MicroImaging GmbH | Scanning Electron Microscope | |
| SHT 31-D | Adafruit Industries | Temperature and Humidity Sensor | |
| SolidWorks 2020 CAD Software | Dassault Systèmes | Commercial CAD Software | |
| Sulforhodamine 101 50 mg | Sigma – Aldrich | S 7635 | Texas Red |
| Syringe Pump Model: Fusion 100 | Chemyx Inc. | Syringe Pump | |
| TCS SP8 inverted CEL BMi8 | Leica Microsystems GmbH | Confocal Laser Scanning Microscope | |
| testXpert V11.02 | ZwickRoell GmbH & Co. KG | Software Tensile Test | |
| Tetrahydrofuran ≥99.9% | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | Tetrahydrofuran | |
| Type 1511530000202 #980361 | Binder Labortechnik GmbH | Heating Cabinet | |
| Ultimaker 3 Extended | Ultimaker BV | 3D Printer |
References
- Van Camp, G. Cardiovascular disease prevention. Acta Clinica Belgica. 69 (6), 407-411 (2014).
- Iung, B., Vahanian, A. Epidemiology of valvular heart disease in the adult. Nature Reviews Cardiology. 8 (3), 162-172 (2011).
- Fioretta, E. S., et al. Cardiovascular tissue engineering: From basic science to clinical application. Experimental Gerontology. 117 (1), 1-12 (2019).
- Xue, J., Wu, T., Dai, Y., Xia, Y. Electrospinning and electrospun nanofibers: methods, materials, and applications. Chemical Reviews. 119 (8), 5298 (2019).
- Grande, D., Ramier, J., Versace, D. L., Renard, E., Langlois, V. Design of functionalized biodegradable PHA-based electrospun scaffolds meant for tissue engineering applications. New Biotechnology. 37, 129-137 (2017).
- Tara, S., et al. Well-organized neointima of large-pore poly(l-lactic acid) vascular graft coated with poly(l-lactic-co-ε-caprolactone) prevents calcific deposition compared to small-pore electrospun poly(l-lactic acid) graft in a mouse aortic implantation model. Atherosclerosis. 237 (2), 684-691 (2014).
- Voorneveld, J., Oosthuysen, A., Franz, T., Zilla, P., Bezuidenhout, D. Dual electrospinning with sacrificial fibers for engineered porosity and enhancement of tissue ingrowth. Journal of Biomedical Material Research. 105 (6), 1559-1572 (2017).
- Kishan, A. P., Cosgriff-Hernandez, E. M. Recent advancements in electrospinning design for tissue engineering applications: A review. Journal of Biomedical Materials Research. 105 (10), 2892-2905 (2017).
- Sacks, M. S., David Merryman, W., Schmidt, D. E. On the biomechanics of heart valve function. Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).
- Buchanan, R. M., Sacks, M. S. Interlayer micromechanics of the aortic heart valve leaflet. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (4), 813-826 (2014).
- Gensler, M., et al. 3D printing of bioreactors in tissue engineering: A generalised approach. PLoS One. 15 (11), 0242615 (2020).
- Grab, M., et al. Customized 3D printed bioreactors for decellularization-High efficiency and quality on a budget. Artificial Organs. 45 (12), 1477-1490 (2021).
- Huang, J., Koutsos, V., Radacsi, N. Low-cost FDM 3D-printed modular electrospray/electrospinning setup for biomedical applications. 3D Printing in Medicine. 6 (1), 8 (2020).
- Fukunishi, T., et al. Preclinical study of patient-specific cell-free nanofiber tissue-engineered vascular grafts using 3-dimensional printing in a sheep model. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 153 (4), 924-932 (2017).
- Jana, S., Lerman, A. In vivo tissue engineering of a trilayered leaflet-shaped tissue construct. Regenerative Medicine. 15 (1), 1177-1192 (2020).
- Hasan, A., et al. Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts. Acta Biomaterialia. 10 (1), 11-25 (2014).
- Wang, X., Ding, B., Yu, J., Yang, J. Large-scale fabrication of two-dimensional spider-web-like gelatin nano-nets via electro-netting. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 86 (2), 345-352 (2011).
- Yang, G. -. Z., Li, H. -. P., Yang, J. -. H., Wan, J., Yu, D. -. G. Influence of working temperature on the formation of electrospun polymer nanofibers. Nanoscale Research Letters. 12 (1), 55 (2017).
- Ekaputra, A. K., Prestwich, G. D., Cool, S. M., Hutmacher, D. W. Combining electrospun scaffolds with electrosprayed hydrogels leads to three-dimensional cellularization of hybrid constructs. Biomacromolecules. 9 (8), 2097-2103 (2008).
- Motta, S. E., et al. Geometry influences inflammatory host cell response and remodeling in tissue-engineered heart valves in-vivo. Scientific Reports. 10 (1), 19882 (2020).
- Masoumi, N., et al. Tri-layered elastomeric scaffolds for engineering heart valve leaflets. Biomaterials. 35 (27), 7774-7785 (2014).
- Jana, S., Lerman, A. Behavior of valvular interstitial cells on trilayered nanofibrous substrate mimicking morphologies of heart valve leaflet. Acta Biomaterialia. 85, 142-156 (2019).
- Jana, S., Franchi, F., Lerman, A. Trilayered tissue structure with leaflet-like orientations developed through in vivo tissue engineering. Biomedical Materials. 15 (1), 015004 (2019).
- Zhou, Y., Chyu, J., Zumwalt, M. Recent progress of fabrication of cell scaffold by electrospinning technique for articular cartilage tissue engineering. International Journal of Biomaterials. 2018, 1953636 (2018).
- Zamani, M., Shakhssalim, N., Ramakrishna, S., Naji, M. Electrospinning: application and prospects for urologic tissue engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 579925 (2020).
- Heilingoetter, A., Smith, S., Malhotra, P., Johnson, J., Chiang, T. Applications of Electrospinning for Tissue Engineering in Otolaryngology. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 130 (4), 395-404 (2020).
- Xue, J., Xie, J., Liu, W., Xia, Y. Electrospun nanofibers: new concepts, materials, and applications. Accounts of Chemical Research. 50 (8), 1976-1987 (2017).
