Evaluatie van een betrouwbare biomarker in een cecale ligatie en punctie-geïnduceerd muismodel van sepsis
Summary
Dit protocol presenteert de operationele details van cecal ligatie en punctie (CLP) in een muismodel van sepsis. CLP is een van de meest gebruikte technieken om een diermodel van sepsis te maken. Daarom is een gestandaardiseerd CLP-protocol vereist voor het verkrijgen van betrouwbare onderzoeksresultaten.
Abstract
Sepsis is een ernstige levensbedreigende en zich snel ontwikkelende ziekte die jaarlijks wereldwijd miljoenen sterfgevallen veroorzaakt. Onderzoekers hebben enorme inspanningen geleverd om de pathofysiologie van sepsis op te helderen met behulp van verschillende diermodellen; het muismodel van sepsis geïnduceerd door cecale ligatie en punctie (CLP) wordt veel gebruikt in laboratoria. De drie technische aspecten die van invloed zijn op de ernst en repliceerbaarheid van het CLP-model zijn het percentage ligumligum, de grootte van de naald die wordt gebruikt voor cecal-punctie en het volume uitwerpselen dat in de buikholte wordt geperst. De snelle en specifieke diagnose van sepsis is een cruciale factor die de uitkomst beïnvloedt. De gouden standaard voor sepsisdiagnose is microbiële cultuur; dit proces is echter tijdrovend en soms onnauwkeurig. De detectie van sepsis-specifieke biomarkers is snel, maar de bestaande biomarkers zijn onbevredigend vanwege een korte halfwaardetijd, niet-specificiteit en onvoldoende gevoeligheid. Daarom is er dringend behoefte aan een betrouwbare biomarker van sepsis in de vroege stadia. Eerdere publicaties suggereren dat overmatige neutrofiele extracellulaire vallen (NET’s) voorkomen bij sepsis. Citrullinated histon H3 (CitH3), als een NET-component, is verhoogd, zowel bij septische dieren als patiënten, en de aanwezigheid van CitH3 is een betrouwbare diagnostische biomarker van sepsis. De huidige studie was gericht op het beschrijven van een gestandaardiseerd muismodel van CLP-geïnduceerde sepsis en het vaststellen van een betrouwbare bloedbiomarker van sepsis. Ons werk kan bijdragen aan de vroege en nauwkeurige diagnose van sepsis in de toekomst.
Introduction
Sepsis wordt gedefinieerd als levensbedreigende orgaandisfunctie veroorzaakt door een ontregelde gastheerrespons op infectie1, en septische shock is de belangrijkste doodsoorzaak in ernstige gevallen van sepsis2. Sepsis en septische shock veroorzaken elk jaar wereldwijd miljoenen sterfgevallen3. De sleutel tot het verbeteren van de uitkomst van patiënten met sepsis is het snel starten van behandelingen zoals antibiotica4. De gouden standaardmethode voor de diagnose van sepsis is microbiële cultuur; microbiële cultuur is echter tijdrovend en kan leiden tot vals-positieve en vals-negatieve resultaten, die de klinische betekenis sterk beperken5. Het is dus zeer wenselijk om een bloedbiomarker van sepsis te identificeren. Procalcitonine wordt erkend als een ideale sepsis biomarker, maar heeft een beperkte diagnostische werkzaamheid omdat het niet in staat is om sepsis te onderscheiden van steriele ziekten6.
Muis cecal ligatie en punctie (CLP) wordt vaak gebruikt om een model van sepsis te maken in wetenschappelijk onderzoek. CLP is een van de meest gebruikte sepsismodellen omdat het polymicrobiale peritonitis nabootst en zowel pro-inflammatoire als ontstekingsremmende immuunresponsen activeert7. Het is algemeen aanvaard dat CLP een klinisch relevanter sepsismodel creëert dan alternatieve technieken, zoals de injectie van bacterieel endotoxine. Daarom wordt CLP beschouwd als het klassieke sepsismodel voor gebruik in onderzoek8. Een groot nadeel van CLP is echter de reproduceerbaarheid, omdat de ernst van het model wordt beïnvloed door verschillende factoren, zoals het percentage ligumligum, de naaldgrootte, het aantal puncties en de laparotomietechniek. Daarom is het noodzakelijk om het CLP-geïnduceerde sepsismodel te standaardiseren. De huidige studie beschrijft de protocoldetails van het CLP-geïnduceerde sepsismodel om de gestandaardiseerde procedure te tonen en de reproduceerbaarheid ervan te vergroten.
De ontstekingsreactie treedt op in het vroege stadium van sepsis, waarbij neutrofielen overmatige hoeveelheden oxidanten en proteasen afgeven die orgaanschade veroorzaken8. Een belangrijke factor in de pathofysiologie van sepsis is de vorming van neutrofiele extracellulaire vallen (NET’s), die nucleaire en cytosolische componenten zoals DNA, citrullinated histonen en antimicrobiële proteïnasen vrijgeven9. Recente studies suggereren dat overmatige generatie van NET’s de pathologie van sepsis bemiddelt; ondertussen oefent een afname van NET’s, door enzymatische remming van peptidyl arginine deiminase (PAD) door chemicaliën zoals YW3-56 of Cl-amidine, een pro-overlevingseffect uit in muismodellen van sepsis10,11. Citrullinated histon H3 (CitH3) werd geïdentificeerd als een sepsis-specifiek eiwit in 201112, en latere publicaties hebben aangetoond dat de circulerende CitH3-concentratie een betrouwbare diagnostische biomarker is van sepsis 13,14. CitH3 wordt beschouwd als een gevoeligere en langdurige biomarker dan procalcitonine en is specifieker in het onderscheiden van sepsis dan inflammatoire cytokines13.
In deze studie hebben we een betrouwbare diagnostische biomarker van sepsis geëvalueerd in een CLP-geïnduceerd muismodel van sepsis.
Protocol
Representative Results
Discussion
CLP introduceert pathogenen in de buik om een preklinisch model van sepsis te creëren. Bij het uitvoeren van CLP is het belangrijk om steriele omstandigheden te gebruiken om de interferentie van exogene bacteriën te elimineren en om nauwkeurige doseringen van anesthetica te gebruiken16. De drie technische aspecten van CLP die van invloed zijn op de ernst en repliceerbaarheid van het sepsismodel zijn het percentage van de ligumligum, de grootte van de naald die wordt gebruikt voor cecal-punctie e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken professor Wang Wei en dokter Liu Shuai voor hun hulp bij de experimenten. Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de Young Research Funding van het Xiangya Hospital, Central South University (nr. 2019Q10), van de National and Science Foundation van de provincie Hunan (nr. 2020JJ4902) en van de National Natural Science Foundation of China (nr. 82202394).
Materials
| 21G needle | |||
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine | R&D Systems Inc | DY999 | |
| anti-CitH3 monoclonal antibody | laboratory self developed | ||
| anti-CitH3 polyclonal antibody | Abcam | ab5103 | |
| anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | |
| C57BL/6 mice | Xiangya School of Medicine, Central South University | ||
| Cl-amidine | Sigma Aldrich | SML2250 | |
| depilatory cream | |||
| Dnase I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| ketoprofen | Sigma Aldrich | PHR1375 | |
| silk sutures (4-0 & 6-0) | |||
| surgical instruments | |||
| YW3-56 | GLPBIO | GC48263 |
References
- Singer, M., et al. The third international consensus definitions for sepsis and septic shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).
- Shankar-Hari, M., et al. Developing a new definition and assessing new clinical criteria for septic shock: For the Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 775-787 (2016).
- Fleischmann-Struzek, C., et al. Incidence and mortality of hospital- and ICU-treated sepsis: results from an updated and expanded systematic review and meta-analysis. Intensive Care Medicine. 46 (8), 1552-1562 (2020).
- Evans, L., et al. Surviving sepsis campaign: international guidelines for management of sepsis and septic shock 2021. Intensive Care Medicine. 47 (11), 1181-1247 (2021).
- Hughes, J. A., Cabilan, C. J., Williams, J., Ray, M., Coyer, F. The effectiveness of interventions to reduce peripheral blood culture contamination in acute care: a systematic review protocol. Systematic Reviews. 7 (1), 216 (2018).
- Kibe, S., Adams, K., Barlow, G. Diagnostic and prognostic biomarkers of sepsis in critical care. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 66, 33-40 (2011).
- Dejager, L., Pinheiro, I., Dejonckheere, E., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis. Trends in Microbiology. 19 (4), 198-208 (2011).
- Hotchkiss, R., Karl, I. The pathophysiology and treatment of sepsis. The New England Journal of Medicine. 348 (2), 138-150 (2003).
- Madhi, R., Rahman, M., Taha, D., Morgelin, M., Thorlacius, H. Targeting peptidylarginine deiminase reduces neutrophil extracellular trap formation and tissue injury in severe acute pancreatitis. Journal of Cellular Physiology. 234 (7), 11850-11860 (2019).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Liang, Y., et al. Inhibition of peptidylarginine deiminase alleviates LPS-induced pulmonary dysfunction and improves survival in a mouse model of lethal endotoxemia. European Journal of Pharmacology. 833, 432-440 (2018).
- Deng, Q., et al. Citrullinated histone H3 as a therapeutic target for endotoxic shock in mice. Frontiers in Immunology. 10, 2957 (2019).
- Li, Y. Q., et al. Identification of citrullinated histone H3 as a potential serum protein biomarker in a lethal model of lipopolysaccharide-induced shock. Surgery. 150 (3), 442-451 (2011).
- Pan, B., et al. CitH3: a reliable blood biomarker for diagnosis and treatment of endotoxic shock. Scientific Reports. 7 (1), 8972 (2017).
- Park, Y., et al. An integrated plasmo-photoelectronic nanostructure biosensor detects an infection biomarker accompanying cell death in neutrophils. Small. 16 (1), 1905611 (2020).
- Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S. P., Sorensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).
- Brook, B., et al. A controlled mouse model for neonatal polymicrobial sepsis. Journal of Visualized Experiments. (143), e58574 (2019).
- Rittirsch, D., Huber-Lang, M., Flierl, M., Ward, P. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nature Protocols. 4 (1), 31-36 (2009).
- Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model. Surgery. 94 (2), 331-335 (1983).
