孟加拉玫瑰介导的光动力疗法抑制 白色念珠菌
Summary
耐药性白色念珠菌的发病率不断上升，这是全世界的一个严重健康问题。抗菌光动力疗法 （aPDT） 可能提供对抗耐药性真菌感染的策略。本方案描述了Rose bengal介导的apDT在体外耐多药白色念珠菌菌株的疗效。
Abstract
侵袭性 白色念珠菌 感染是人类中一种严重的机会性真菌感染，因为它是肠道，口腔，阴道和皮肤最常见的定殖者之一。尽管有抗真菌药物，但侵袭性念珠菌病的死亡率仍约为50%。不幸的是，耐药性 白色念珠菌 的发病率在全球范围内正在增加。抗菌光动力疗法（aPDT）可以提供替代或辅助治疗，以抑制 白色念珠菌 生物膜的形成并克服耐药性。孟加拉玫瑰（RB）介导的aPDT已经显示出对细菌和 白色念珠菌的有效细胞杀伤。在这项研究中，描述了RB-aPDT对耐多药 白色念珠菌的 疗效。自制的绿色发光二极管（LED）光源设计用于与96孔板的孔的中心对齐。酵母在具有不同浓度RB的孔中孵育，并用不同流量的绿光照亮。采用平板稀释法分析杀伤效果。通过光和RB的最佳组合，实现了3对数生长抑制。得出的结论是，RB-aPDT可能潜在地抑制耐药的 白色念珠菌。
Introduction
白色念珠菌定植于健康个体的胃肠道和泌尿生殖道中，在约50%的个体中可被检测为正常微生物群1。如果在宿主和病原体之间产生不平衡，白色念珠菌能够入侵并引起疾病。感染的范围可以从局部粘膜感染到多器官衰竭2。在美国的一项多中心监测研究中，2009 年至 2017 年间，从侵袭性念珠菌病患者中分离出的约一半是白色念珠菌 3 号。念珠菌血症可能与高发病率、死亡率、住院时间延长有关4.美国疾病控制和预防中心报告说，在所有测试的念珠菌血液样本中，约有7%对抗真菌药物氟康唑5具有耐药性。耐药性念珠菌属的出现引起了人们的关切，即开发抗真菌药物的替代或辅助疗法。
抗菌光动力疗法（aPDT）涉及用PS6峰值吸收波长处的光激活特定的光敏剂（PS）。激发后，激发的PS将其能量或电子转移到附近的氧分子并返回到基态。在此过程中，形成活性氧和单线态氧并引起细胞损伤。aPDT自20世纪90年代以来已被广泛用于杀死微生物7。aPDT的一个好处是，在照射过程中，单线态氧和/或活性氧（ROS）在细胞中会损坏多个细胞器;因此，直到今天才发现对apDT的抗性。此外，最近的一项研究报告说，在apDT后存活的细菌对抗生素8变得更加敏感。
aPDT中使用的光源包括激光器，带滤光片的金属卤素灯，近红外光和发光二极管（LED）9，10，11，12。激光提供高光功率，通常大于0.5 W / cm2，允许在很短的时间内提供高光剂量。它已被广泛用于治疗时间较长的不方便的情况，例如用于口腔感染的apDT。激光器的缺点是其光斑尺寸的照明很小，使用扩散器从几百微米到10毫米不等。此外，激光设备价格昂贵，需要特定的培训才能操作。另一方面，带滤光片的金属卤素灯的照射面积相对较大13。但是，灯太重且昂贵。LED光源已成为aPDT在皮肤病学领域的主流，因为它体积小且价格较低。照射面积可以相对较大，具有LED灯泡的阵列排列。整个脸部可以同时被照亮9.然而，目前可用的大多数（如果不是全部）LED光源都是为临床使用而设计的。它可能不适合在实验室中进行实验，因为它占用空间且价格昂贵。我们开发了一种廉价的LED阵列，它非常小，可以从LED灯带切割和组装。LED可以安装在不同的布置中，用于不同的实验设计。在一次实验中，可以在96孔板甚至384孔板中完成不同条件的apDT。
孟加拉玫瑰（RB）是一种有色染料，广泛用于增强人眼角膜损伤的可视化14。RB介导的aPDT对 金黄色葡萄球菌， 大肠杆菌和 白色念珠菌 的杀伤作用与甲苯胺蓝O15的效率大致相当。这项研究展示了一种验证RB-aPDT对耐多药白色念 珠菌的影响的方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
最近报道了RB-PDT治疗真菌性角膜炎的临床应用结果令人鼓舞 19.RB的吸收峰在450-650nm处。确定光源的通量率对于成功的apDT至关重要。治疗癌细胞需要高通量（通常>100 J / cm2），而较低的通量有望治疗感染的病变6。高通量意味着长时间暴露，这在临床环境中可能不切实际。对于治疗真菌性角膜炎，眼科界同意5.4 J/ cm 2 20。RB的孵育…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作已获得国立成功大学应用纳米医学中心的资助，教育部（MOE）高等教育萌芽项目框架内的特色区域研究中心计划，以及台湾科技部[MOST 109-2327-B-006-005]到TW Wong。洪俊华感谢台湾成功大学医院[NCKUH-11006018]和[MOST 110-2314-B-006-086-MY3]的资助。
Materials
| 1.5 mL microfuge tube | Neptune, San Diego, USA | #3745.x | |
| 5 mL round-bottom tube with cell strainer cap | Falcon, USA | #352235 | |
| 96-well plate | Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan | #16196 | |
| Aluminum foil | sunmei, Tainan, Taiwan | ||
| Aluminum heat sink | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | BK-T220-0051-01 | |
| Centrifuge | Eppendorf, UK | 5415R | disperses heat from the LED array |
| Graph pad prism software | GraphPad 8.0, San Diego, California, USA | graphing and statistics software | |
| Green light emitting diode (LED) strip | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | 2835 | |
| Incubator | Yihder, Taipei, Taiwan | LM-570D (R) | Emission peak wavelength: 525 nm, Viewing angle: 150°; originated from https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63 |
| Light power meter | Ophir, Jerusalem, Israel | PD300-3W-V1-SENSOR, | |
| Millex 0.22 μm filter | Merck, NJ, USA | SLGVR33RS | |
| Multidrug-resistant Candida albicans | Bioresource Collection and Research CenterBioresource, Hsinchu, Taiwan | BCRC 21538/ATCC 10231 | http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538 |
| OD600 spectrophotometer | Biochrom, London, UK | Ultrospec 10 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich, MO, USA | 330000 | stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C |
| Sterilized glass tube | Sunmei Co., Ltd., Tainan, Taiwan | AK45048-16100 | |
| Yeast Extract Peptone Dextrose Medium | HIMEDIA, India | M1363 |
References
- Naglik, J. R., Challacombe, S. J., Hube, B. Candida albicans secreted aspartyl proteinases in virulence and pathogenesis. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 400-428 (2003).
- Pappas, P. G., et al. Clinical practice guideline for the management of candidiasis: 2016 update by the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 62 (4), 1-50 (2016).
- Ricotta, E. E., et al. Invasive candidiasis species distribution and trends, United States, 2009-2017. Journal of Infectious Diseases. 223 (7), 1295-1302 (2021).
- Koehler, P., et al. Morbidity and mortality of candidaemia in Europe: an epidemiologic meta-analysis. Clinical Microbiology and Infection. 25 (10), 1200-1212 (2019).
- Toda, M., et al. Population-based active surveillance for culture-confirmed candidemia – four sites, United States, 2012-2016. Morbidity and Mortality Weekly Report Surveillance Summaries. 68 (8), 1-15 (2019).
- Lee, C. N., Hsu, R., Chen, H., Wong, T. W. Daylight photodynamic therapy: an update. Molecules. 25 (21), 5195 (2020).
- Wainwright, M. Photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT). Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 42 (1), 13-28 (1998).
- Wong, T. W., et al. Indocyanine green-mediated photodynamic therapy reduces methicillin-resistant staphylococcus aureus drug resistance. Journal of Clinical Medicine. 8 (3), 411 (2019).
- Kim, M. M., Darafsheh, A. Light sources and dosimetry techniques for photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 96 (2), 280-294 (2020).
- Wong, T. W., Sheu, H. M., Lee, J. Y., Fletcher, R. J. Photodynamic therapy for Bowen’s disease (squamous cell carcinoma in situ) of the digit. Dermatologic Surgery. 27 (5), 452-456 (2001).
- Wong, T. W., et al. Photodynamic inactivation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by indocyanine green and near infrared light. Dermatologica Sinica. 36 (1), 8-15 (2018).
- Stasko, N., et al. Visible blue light inhibits infection and replication of SARS-CoV-2 at doses that are well-tolerated by human respiratory tissue. Scientific Reports. 11 (1), 20595 (2021).
- Crosbie, J., Winser, K., Collins, P. Mapping the light field of the Waldmann PDT 1200 lamp: potential for wide-field low light irradiance aminolevulinic acid photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 76 (2), 204-207 (2002).
- Feenstra, R. P., Tseng, S. C. Comparison of fluorescein and rose bengal staining. Ophthalmology. 99 (4), 605-617 (1992).
- Demidova, T. N., Hamblin, M. R. Effect of cell-photosensitizer binding and cell density on microbial photoinactivation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (6), 2329-2335 (2005).
- Shahid, H., et al. Duclauxin derivatives from fungi and their biological activities. Frontiers in Microbiology. 12, 766440 (2021).
- Arendrup, M. C., Park, S., Brown, S., Pfaller, M., Perlin, D. S. Evaluation of CLSI M44-A2 disk diffusion and associated breakpoint testing of caspofungin and micafungin using a well-characterized panel of wild-type and fks hot spot mutant Candida isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (5), 1891-1895 (2011).
- Mukaremera, L., Lee, K. K., Mora-Montes, H. M., Gow, N. A. R. Candida albicans yeast, pseudohyphal, and hyphal morphogenesis differentially affects immune recognition. Frontiers in Immunology. 8, 629 (2017).
- Hung, J. H., et al. Recent advances in photodynamic therapy against fungal keratitis. Pharmaceutics. 13 (12), 2011 (2021).
- Martinez, J. D., et al. Rose Bengal photodynamic antimicrobial therapy: a pilot safety study. Cornea. 40 (8), 1036-1043 (2021).
