用于细胞外囊泡分析的冻裂-断裂电子显微镜

1. 癌性尿路上皮细胞的培养和EV的分离 注意：提出了从人浸润性膀胱癌尿路上皮细胞（T24）细胞系获得EV的方案。然而，必须优化培养条件以使用其他细胞类型。 将密度为3×10 4个细胞/ cm2的T24细胞放入三个烧瓶中（生长表面为75 cm2），并开始在CO 2培养箱中在37°C和5%CO2下培养3天（图2A）。 在A-DMEM和F12的1：1（v / v）混合物中使用T24细胞培养基，并补充5%胎牛血清（FBS），4mM谷氨酰胺，100mg / mL链霉素和100 U / mL青霉素。注意：以下隔离产生在MV中丰富的EV。在开始分离之前，用光学显微镜检查细胞以确认活力和汇合度（图2B）。当T24细胞汇合度为70%时，开始从条件培养基中收集EV。 用移液管从烧瓶（T75）中用MVs收集培养基到锥形离心管中（图2C）。在4°C下以300× g 离心10分钟（图2D）。 小心地将上清液收集到带有移液管的新离心管中（图2E）。 将上清液在4°C下以2，000× g离心20分钟。 用移液管小心地将上清液收集到新的离心管中。 在4°C下以10，000× g 离心40分钟。 寻找管子底部有白色颗粒的存在。注：如有必要，请更换离心机转子以达到所需的重力。EV颗粒在离心管底部被视为白色颗粒（图2F）;标记其位置以避免在移液过程中丢失沉淀（图2G）。 用移液管小心地丢弃上清液。向沉淀中加入1.5 mL PBS并重悬含有MV的沉淀。 在4°C下以10，000× g 离心40分钟，并在管底部寻找白色沉淀的存在。注意：EV颗粒在离心管底部被视为白色斑块;标记其位置以避免在移液过程中丢失沉淀。 用移液管小心地丢弃上清液。轻轻地将固定剂2.5%戊二醛加入0.1M二甲酸钠缓冲液（pH 7.2）中。在4°C下静置20分钟（图2H）。注意：戊二醛和二甲砷酸钠是有毒的。在通风橱中工作，戴上防护手套，并适当地丢弃它们。 用移液管小心地取出固定剂。向沉淀中加入洗涤缓冲液（0.1M二甲砷酸钠缓冲液）。在4°C下静置10分钟，不要重悬沉淀。 2. 电动汽车的冷冻 注意：在冷冻之前，首先用甘油冷冻保护样品。 制备0.1M二甲酰亚酸钠缓冲液。除去洗涤缓冲液，在0.1M卡卡代酸缓冲液中加入50μL30%甘油。轻轻地重悬EV以使溶液均匀。在4°C下孵育30分钟。 用氯仿超声浴中的中心凹坑清洁铜载体5分钟（图3A）。如果使用多个样品，请风干它们并用颜色标记它们（图3B）。使用前，请将载体存放在干燥、干净的地方（例如，在培养皿中的镜头纸上）。请勿徒手触摸托架。 准备移液器，溶液，滤纸，镊子，立体显微镜，带有氟利昂和液氮（LN2）的杜瓦瓶，金属棒和冷冻管。用LN2冷却它。注意：在处理LN2 和冷却的氟利昂时，请穿戴防护设备并相应地工作。 在冻结之前再次重悬电动汽车。避免形成气泡。注：快速执行步骤2.4-2.7。 在立体显微镜下工作（图3C）。将1.5-1.7μL样品转移到铜载体的中心凹坑中，使凸起的液滴高于铜载体边缘，同时不会将样品溢出边缘（图3D）。如果溢出，请使用滤纸干燥载体的外环。 将凝固的氟利昂与金属棒混合以再次液化（图3E）。 用镊子抓住铜载体的外圈，并将其浸入冷却的氟利昂中，轻轻摇动镊子8秒（图3F）。8秒后，快速将载体转移到另一个装满LN2的杜瓦瓶中。 立即进行压裂或将样品储存在LN2中。在后一种情况下，标记冷冻管并通过将其浸入LN2 中来冷却小瓶和镊子尖端（图3G）。在LN2下，将冷冻的铜载体收集到小瓶中，将其关闭，并将其储存在LN2 容器中（图3H）直到冻结破裂。 3. EV的断裂和复制品的制作 注意：根据制造商的操作说明准备冷冻压裂装置。（图 4A）。清洁设备的腔室。将铂 （Pt/C） 和碳 （C） 喷枪分别以 45° 和 90° 的角度放置（图 4B）。 启动单元真空系统。当压力达到 6.6 × 10−2 Pa（5 × 10−4 托）时，将单元室冷却至 −150 °C。 使用干镊子将带有冷冻样品的铜载体转移到冷冻压裂装置中（图4C）。使用低温透射仪或快速工作，以避免样品解冻和冰晶沉积。将载体固定在样品台上。 等到真空再次达到6.6×10-2 Pa（5×10-4 托），然后将刀温设置为-100°C（图4D）。 等到真空达到 1.0 × 10−3 Pa （8 × 10−6 托）。 用双筒望远镜观察样品并小心地接近刀（图4E）。 通过打开刀的电动运动开始切片样品（图4F），并切片直到样品表面光滑（图4G）。 对于压裂，关闭切刀的电动运动，然后缓慢手动控制切刀，从而压裂样品（图4H）。为了保护断裂表面在阴影之前不形成冰晶和碎屑，请将刀移到断裂样品上方。 继续以45°的Pt阴影（图4I，J）。 准备秒表和/或打开冷冻压裂装置上的石英晶体监测器，这将可以监督样品上铂的厚度。在石英晶体监视器上测量的Pt层的推荐厚度为2.5 nm，对应于给定高张力和电流下的4秒阴影（即Pt阴影速度为0.63 nm / s）。 在开始阴影之前，将刀从样品上移开。在 Pt/C 喷枪上施加高张力 （1，600 V），并将电流增加到 60 mA。Pt的火花应该出现，并且应该开始遮蔽样品。此时，开始4秒倒计时和/或观察并定位石英晶体监视器上Pt的位置。注意：C层的推荐厚度为2.5 nm，相当于在给定的高张力和电流下10秒的阴影。 当获得所需的Pt厚度时，关闭电流和高张力。 以90°进行C阴影（即C阴影的速度为0.25 nm / s）。 在C枪上施加高张力（1，900 V），将电流增加到90 mA，并且应该出现C的火花并开始阴影样品;在那一刻，开始10秒倒计时。当获得所需的C厚度时，关闭电流和高张力。 4. 清理复本和复本分析 使用样品表中的铜载体，并用镊子将它们转移到12孔瓷板中室温下的蒸馏水中（图4K）。复制品将漂浮在水面上，而载体下沉（图4L）。 用钢丝环将复制品从蒸馏水中转移到含有次氯酸钠的孔中。盖上盖子，在室温下在通风橱中放置过夜。注意：次氯酸钠有毒。在通风橱中工作，戴上防护手套，并适当地丢弃它们。 将复制品转移到ddH2O并洗涤30分钟。重复3次。 将带有线环的复制品转移到网格铜TEM网格（例如，方形或蜂窝100+网格）。风干网格2小时，然后将其储存在网格存储盒中直到显微镜检查。注意：通常，网格可以在黑暗，干燥的室温条件下储存数月。 使用TEM显微镜对复制品进行成像并获得显微照片。 为此，请插入带有复制品的TEM网格，并根据制造商的操作手册启动TEM成像。可在 80 kV 或 100 kV 下工作。 使用TEM上的相机检查样品并以较低和较高的放大倍率获取显微照片。 分析中小型车的显微照片。要测量中压直径，请使用斐济/ImageJ软件16。根据Hallett等人的说法，MVs的直径是显微照片上测量值的4/π倍。