Flexibele organische elektronische apparaten voor gepulseerde elektrische veldtherapie van glioblastoom

Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Franse wetgeving en in overeenstemming met de richtlijn van de Raad van de Europese Gemeenschap van 24 november 1986 (86/609/EEG) voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Het onderzoek op dieren werd goedgekeurd door de Direction Départementale des Services Vétérinaires des Bouches-du-Rhône en goedgekeurd door de ethische commissie van Provence Cote D’Azur (Apafis # 22689-2019100414103054). 1. Microfabricage van flexibele apparaten (figuur 1) Reiniging van de glasplatenSoniceer glasglaasjes in 2% zeepoplossing gedurende 15 minuten. Spoel ze af met water. Soniceer opnieuw in een mengsel van 80% pure aceton en 20% pure isopropanol gedurende 15 minuten.LET OP: Deze oplosmiddelen zijn schadelijk en ontvlambaar. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM’ s) en hanteer ze onder een zuurkast. Spoel de glaasjes af met isopropanol en droog ze af met een luchtpistool.OPMERKING: Zorg ervoor dat aceton tijdens het hele proces niet op de substraten droogt. Gouden elektrodepatronen (Figuur 1A)Deponeer een laag van 3 μm paryleen-C (PaC) met een paryleendepositiesysteem (figuur 1Aa).Plaats de gereinigde glasplaten in de afzettingskamer. Spuit zeep op de koelmachine, laat deze drogen en steek deze in de daarvoor bestemde koudeval van het afzettingssysteem. Deze anti-kleefstof vergemakkelijkt de eenvoudige verwijdering van PaC uit de koelmachine na de afzetting.LET OP: PaC is irriterend en vormt een gevaar voor de gezondheid. Draag handschoenen tijdens het hanteren. Weeg 6 g PaC in een aluminium boot en plaats het in de oven. Evacueer de machine (P = 10 mTorr) en start de afzetting met de volgende parameters: TChiller = -100 °C, TFurnace = 690 °C, TVaporizer = 175 °C en TChamber = 135 °C. Wanneer de afzetting is voltooid en de temperatuur van de vaporizer lager is dan 40 °C, zet je de koelmachine, verdamper en oven uit. Ontlucht de machine en verzamel de monsters. Activeer het oppervlak van de monsters door zuurstofplasmabehandeling gedurende 30 s (100 W, 50 sccm). Spin-coat de plasmabehandelde monsters met een negatieve fotoresist op 1.000 x g gedurende 40 s. Plaats de monsters gedurende 2 minuten op een hete plaat bij 110 °C (figuur 1Ab).LET OP: De fotoresist-oplossing is ontvlambaar en veroorzaakt irritatie; draag PBM’s en hanteer deze onder een zuurkast. Plaats een i-line filter in de bundellijn van de UV-breedbandcontactuitlijner en stel de fotoresist bloot door een masker met het geïnterdigiteerde elektrodeontwerp (figuur 1Ac).OPMERKING: Interdigitated elektroden met een opening van 50 of 250 μm werden ontworpen met behulp van een lay-outeditor en fotomaskers werden besteld bij een bedrijf dat polyester fotomaskers produceert door middel van laserfotoplotting. Bak bovenstaande monsters bij 110 °C op een hete plaat gedurende 3 min en laat ze 5 min afkoelen tot kamertemperatuur. Dompel monsters gedurende 3 minuten onder in een metaalionvrije ontwikkelaar om de niet-blootgestelde fotoresist te verwijderen. Spoel monsters af met water en droog ze af met een luchtpistool (figuur 1Ad).LET OP: De ontwikkelaarsoplossing is irriterend; draag PBM’s en handvat onder een zuurkast. Activeer het oppervlak van de monsters door zuurstofplasmabehandeling gedurende 60 s (100 W, 50 sccm). Deponeer een 20 nm hechtingslaag chroom en een 300 nm laag goud met een thermische verdamper als volgt (figuur 1Ae). Ontlucht de verdampermachine en klem de monsters (naar beneden gericht) op de bovenste ronde plaat met metalen schroeven. Vul de speciale kroezen respectievelijk met chroom en goud. Sluit de machine af en evacueer deze om een druk onder 5·10-6 Torr te bereiken. Start de rotatie van de monsterhouder. Selecteer de kroes die chroom bevat en verhoog langzaam de stroom die er doorheen gaat totdat een afzettingssnelheid van 0,2 Å·s-1 is bereikt. Open de sluiter en wacht tot 20 nm chroom is afgezet. Sluit de sluiter en laat de stroom langzaam zakken tot 0 mA. Selecteer de kroes die goud bevat en verhoog langzaam de stroom die er doorheen gaat totdat een afzettingssnelheid van 0,2 Å·s-1 is bereikt. Open de sluiter om goud te verdampen, wacht tot 10 nm goud is afgezet en verhoog vervolgens de afzettingssnelheid tot 1,5 Å·s-1 totdat ongeveer 300 nm is afgezet. Sluit de sluiter en laat de stroom langzaam dalen tot 0 mA. Laat de monsters na afzetting 15 minuten afkoelen tot kamertemperatuur. Stop de rotatie van de monsterhouder, ontlucht de machine en verzamel de monsters. Dompel de monsters onder in een bekerglas met aceton. Plaats het bekerglas gedurende 15 minuten op een schudplaat die is ingesteld op 110 tpm om de fotoresist op te tillen. Spoel de monsters af met isopropanol en droog ze met een luchtpistool (figuur 1Af). Activeer het oppervlak van de monsters door zuurstofplasmabehandeling gedurende 30 s (100 W, 50 sccm). Leg een 3 μm isolatielaag PaC af met een paryleendepositiesysteem (zie stap 1.2.1) (figuur 1Ag). Omtrekopening (figuur 1B)Spin-coat de monsters met een positieve fotoresist op 600 x g gedurende 35 s. Plaats het op een hete plaat bij 110 °C gedurende 2 minuten (figuur 1Ba).LET OP: De fotoresist-oplossing is ontvlambaar en veroorzaakt irritatie; draag PBM’s en handvat onder een zuurkast. Zorg ervoor dat er geen i-line-filter in de bundellijn van de UV-breedbandcontactuitlijner zit en stel de fotoresist bloot via een masker met de omtrek van het apparaat met een UV-breedbandcontactaligner (figuur 1Bb). Dompel de monsters gedurende 4 minuten onder in een metaalionvrije ontwikkelaar om de blootgestelde fotoresist te verwijderen. Spoel de monsters af met water en droog ze met een luchtpistool (figuur 1Bc). Ets de omtrek door de twee lagen PaC met een reactieve ionenetser (160 W, 22 min, Ø2: 50 sccm, CF4: 10 sccm) (Figuur 1Bd). Verwijder de resterende fotoresist met aceton, spoel af met isopropanol en droog de monsters met een luchtpistool. PEDOT:PSS-coating (figuur 1C)Spincoat een zeepoplossing van 2% op 70 x g gedurende 35 s (figuur 1Ca). Deponeer een 3 μm opofferingslaag van PaC met een paryleendepositiesysteem (zie stap 1.2.1) (figuur 1Cb). Spin-coat positieve fotoresist bij 600 x g gedurende 35 s. Plaats de monsters gedurende 2 minuten op een hete plaat bij 110 °C (figuur 1cc). Zorg ervoor dat er geen i-line filter in de bundellijn van de UV-breedbandcontactuitlijner zit en stel de fotoresist bloot via een masker met het actieve oppervlak van de elektroden (figuur 1Cd). Dompel de monsters gedurende 4 minuten onder in een metaalionvrije ontwikkelaar om de blootgestelde fotoresist te verwijderen. Spoel de monsters af met water en droog ze af met een luchtpistool (figuur 1Ce). Ets de PaC met een reactieve ionenetser om het actieve oppervlak van de elektroden te openen (160 W, 24 min, Ø2: 50 sccm, CF4: 10 sccm). Controleer met een microscoop of er geen rest-Pac op het actieve oppervlak aanwezig is (figuur 1Cf). Verwijder de resterende fotoresist met aceton, spoel af met isopropanol en droog de monsters met een luchtpistool. Activeer het oppervlak van de monsters met behulp van zuurstofplasmabehandeling gedurende 90 s (100 W, 50 sccm). Meng een commerciële dispersie van chemisch gepolymeriseerd PEDOT:PSS met 5 vol% ethyleenglycol (EG) en 0,1 vol% dodecylbenzeensulfonzuur (DBSA). Sonicate gedurende 15 min. Voeg 1 wt% (3-glycydyloxypropyl) trimethylsiloxaan (GOPS) toe en soniceer gedurende 5 minuten. Filtreer de oplossing door een filter van 1,2 μm.LET OP: EG is irriterend en vormt een gevaar voor de gezondheid. DBSA is irriterend en corrosief. GOPS is corrosief. Draag geschikte PBM’s en hanteer deze chemicaliën onder een zuurkast.OPMERKING: Het totale volume is afhankelijk van het aantal monsters. Bereid voor 10 standaard glasglaasjes ten minste 20 ml voor die overeenkomt met de volgende hoeveelheden: 18,78 ml PEDOT:PSS, 1 ml EG, 20 μL DBSA en 200 μL GOPS. Spin-coat vier lagen PEDOT:PSS-oplossing op 150 x g gedurende 35 s. Bak na afzetting van elke laag de monsters bij 110 °C gedurende 60 s op een hete plaat en koel ze gedurende 5 minuten af tot kamertemperatuur voordat de volgende laag wordt gedraaid (figuur 1Cg). Verwijder de opofferende PaC-laag door de monsters onder te dompelen in water (figuur 1Ch). Bak de monsters gedurende 1 uur op 140 °C. Dompel de monsters gedurende 30 minuten onder in gedeïoniseerd water om de resterende zeep en verbindingen met een laag moleculair gewicht in de PEDOT:PSS-film te verwijderen en monsters los te maken van het glazen substraat (figuur 1Ci). Aansluitingen en verpakking (figuur 1D)Leg een dun laagje acrylverf neer op een polyimidefilm die is gecoat met koper (figuur 1Da). Gebruik een aerosol om een homogene verflaag te verkrijgen (figuur 1Db). Patroon de acrylverf met een laser (75 kHz, 7 W, 1 lasergang, 400 mm·s-1) om twee rechthoekige contactpads (5 mm x 15 mm; 1,5 mm opening) te verkrijgen (figuur 1Dc). Ets het koper nat met verzadigd 30% (w/v) ijzerchloride (FeCl3) in water gedurende 15 minuten bij 40 °C (figuur 1Dd).LET OP: FeCl3 is irriterend en corrosief; Behandel het met handschoenen onder een zuurkast. Strip de acrylverf met aceton door er lichtjes over te wrijven met een doek (figuur 1De). Snijd de polyimidefilm met patroon in rechthoekige vormen (15 mm x 30 mm) met een laser (15 kHz, 10 W, 30 laserpassen, 130 mm·s-1) (figuur 1Df). Doseer zilverpasta met een drieassige doseermachine bij een druk van drie bar met een naald met een diameter van 330 μm (5 m·min-1) (figuur 1Dg).LET OP: Zilverpasta is irriterend; Handvat met handschoenen. Lijn de PaC-sonde uit en bevestig deze met de polyimidefilm onder een binoculaire microscoop met behulp van een pincet (figuur 1Dh).OPMERKING: In stap 1.5.2 kunnen uitlijningsmarkeringen worden gemodelleerd om de positionering van de sonde op de contactpads te vergemakkelijken. Bak op 140 °C gedurende 2 uur in de oven. Plaats een 1 cm2 polyimide beschermingstape op de contactpads (figuur 1Di). Dompel de interface waar de PaC-sonde en polyimidefilm zijn aangesloten in PDMS (Figuur 1Dj). Bak het 2 uur op 50 °C. Verwijder de beschermingstape om de contactpads te openen (figuur 1Dk).OPMERKING: Microfabricage van in vitro apparaten is vergelijkbaar, maar stappen 1.2.1, 1.3 en 1.5 moeten worden overgeslagen. 2. Generatie van Glioblastoma GCaMP6f stabiele cellijn Lentivirus productieKweek in een kolf van 75 cm² een van HEK 293T afgeleide cellijn die is geoptimaliseerd voor lentivirusproductie in 10 ml Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) met 4,5 g· L-1 van glucose, L-glutamine, natriumpyruvaat en natriumbicarbonaat en aangevuld met 10% tetracyclinevrij foetaal runderserum (FBS), 100 eenheden·ml-1 penicilline en 100 μg·ml-1 streptomycine gedurende ten minste 3 dagen tot 80% samenvloeiing. Haal het medium uit de kolf. Spoel de cellen voorzichtig af met 10 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Voeg 1 ml 0,25% trypsine/EDTA-oplossing toe en incubeer de kolf gedurende 5 minuten bij 37 °C.LET OP: Trypsine / EDTA-oplossing vormt een gevaar voor de gezondheid; draag PBM’s en handvat onder een zuurkast. Voeg 8 ml kweekmedium toe. Spoel de celsuspensie voorzichtig door. Tel de cellen en plaat 4 x 106 cellen in een petrischaaltje in 8 ml kweekmedium. Verdun de volgende dag 25 μg van het plasmide met het gen GCaMP6f en een selectiemarker die resistentie tegen puromycine verleent in een totaal volume van 600 μL water. Voeg het toe aan een buisje transfectiereagens. Vortex gedurende 10 s bij 3.000 tpm en incubeer de buis bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten om de productie van nanodeeltjes mogelijk te maken. Voeg de inhoud van de buis druppelsgewijs toe aan de kweek van HEK 293 T-cellen en rock voorzichtig met de hand. Incubeer cellen bij 37 °C gedurende ten minste 4 uur. Vervang de media die nanodeeltjescomplexen bevatten door verse media en breng de cellen terug bij 37 °C. Verzamel drie dagen later het supernatant en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 500 x g om celafval te verwijderen. Verzamel de vloeibare fase met virale deeltjes.OPMERKING: De virusproductie in het supernatant kan worden bevestigd met behulp van een kwantitatieve lentivirale titertest en kan gedurende ten minste 2 jaar bij -80 °C worden bewaard. Glioblastoom cellen transductieKweek in een kolf van 75 cm² glioblastoomcellen in 10 ml DMEM met 1 g· L-1 van glucose, L-glutamine, natriumpyruvaat en natriumbicarbonaat en aangevuld met 10% tetracyclinevrije FBS, 100 eenheden·ml-1 penicilline en 100 μg·ml-1 streptomycine gedurende ten minste 4 dagen. Gooi het medium weg en voeg het in stap 2.1.9 verkregen supernatant toe aan de doelcellen. Voeg 5 μg·ml-1 hexadimethrinebromide toe aan het medium om de transductie te verbeteren. Incubeer gedurende 6 uur bij 37 °C. Vervang het medium door 10 ml vers medium.LET OP: Hexadimethrine Bromide is een irriterend middel. Pak het aan met handschoenen. Generatie van een stabiele cellijnVoeg twee tot drie dagen na transductie 10 ml DMEM toe met 1 g· L-1 van glucose, L-glutamine, natriumpyruvaat en natriumbicarbonaat, 10% FBS, 100 eenheden·ml-1 penicilline, 100 μg·ml-1 van streptomycine en aangevuld met puromycine om de niet-getransduceerde cellen te doden. Kweek cellen in dit medium gedurende ten minste 3 dagen.LET OP: Puromycine is een irriterend middel; Pak het aan met handschoenen.OPMERKING: De gevoeligheid van cellen voor puromycine moet vóór transductie worden getest door cellen te kweken in hun aanbevolen medium dat verschillende concentraties puromycine bevat. Controleer een dag later de cellen met een microscoop. Kies de juiste concentratie waarbij de meerderheid van de cellen dood is, maar weinigen nog in leven zijn, om ervoor te zorgen dat het antibioticum niet te giftig is en ook de getransfecteerde cellen kan doden. Verwijder het medium en spoel de cellen af met 10 ml PBS. Voeg 1 ml 0,25% van een trypsine/EDTA-oplossing toe en incubeer de kolf gedurende 5 minuten bij 37 °C. Voeg 8 ml kweekmedium toe. Spoel de celsuspensie voorzichtig door. Verzamel 100 μL celsuspensie en meet de celconcentratie met een celteller. Zuig 50 μL celsuspensie op in een handheld geautomatiseerde celteller met een sensor van 60 μm. Zaad 1 cel/put in een 96-well plaat. Voeg bijvoorbeeld voor een concentratie van 1 x 10 3 cellen per ml 1 / (1 x 103) toe, d.w.z. 0,001 ml celsuspensie per put. Zaai elke put om de kans op succes te vergroten. Compleet met kweekmedium om een totaal volume van 200 μL per put te bereiken. Zoek een dag later elk putje met één cel en controleer de fluorescentie (λexc = 490 nm en λem = 530 nm). Markeer de putjes die slechts één getransfecteerde cel bevatten. Ga door met de groei gedurende een paar dagen totdat de put bijna samenvloeit. Gooi het medium weg en spoel de cellen af met 200 μL PBS. Voeg 100 μL 0,25% trypsine/EDTA-oplossing toe en incubeer de 96-well-plaat gedurende 5 minuten bij 37 °C. Voeg 100 μL medium toe en spoel de celsuspensie voorzichtig door. Breng de celsuspensie over in een petrischaaltje. Voeg 5 ml medium toe en laat de cellen een paar dagen groeien tot de petrischaal bijna samenvloeit. Gooi het medium weg en spoel de cellen af met 5 ml PBS. Voeg 1 ml 0,25% trypsine/EDTA-oplossing toe en incubeer de petrischaal gedurende 5 minuten bij 37 °C. Voeg 6 ml medium toe en spoel de celsuspensie voorzichtig door. Breng de celsuspensie over in een T25-kolf. Ga door met de groei gedurende een paar dagen totdat de kolf bijna samenvloeit. Gooi het medium weg en spoel de cellen af met 5 ml PBS. Voeg 1 ml 0,25% trypsine/EDTA-oplossing toe en incubeer de T25-kolf gedurende 5 minuten bij 37 °C. Voeg 7 ml DMEM toe met 1 g· L-1 van glucose, L-glutamine, natriumpyruvaat en natriumbicarbonaat, en aangevuld met 10% FBS, 100 eenheden·ml-1 penicilline en 100 μg·ml-1 streptomycine. Spoel de celsuspensie voorzichtig door. Splits de celsuspensie in vier T25-kolven (2 ml per kolf) en voeg 5 ml medium toe aan elke kolf. Laat de cellen een paar dagen groeien tot de kolven bijna samenvloeien. Herhaal stap 2.3.12 voor drie kolven en houd de laatste kolf voor stap 3.1.3. Breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten op 150 x g . Gooi het supernatant weg en resuspensie van de celkorrel in 900 μL. Meng de cellen voorzichtig om een homogene celsuspensie te behouden. Breng de celsuspensie over in cryogene opslagflacons. Voeg 100 μL dimethylsulfoxide toe. Plaats de cryovialen een nacht op -80 °C. Breng bevroren cellen over naar vloeibare stikstof voor verdere experimenten.OPMERKING: De efficiëntie van de transfectie kan worden beoordeeld door 5 μM ionomycinecalciumzout in het medium toe te voegen en de geïnduceerde toename van fluorescentie onder een fluorescentiemicroscoop te controleren (λexc = 490 nm en λem = 530 nm). 3.3D modellen Sferoïde cultuurBereid een oplossing van 1% (m/v) agarose in gedeïoniseerd (DI) water.Voeg 100 g agarosepoeder toe aan 100 ml DI-water en verwarm de oplossing in een magnetron tot al het poeder is opgelost. Roer de oplossing regelmatig om klonten te voorkomen. Autoclaaf de oplossing gedurende 20 minuten bij 120 °C. Eenmaal uit de autoclaaf gehaald, voeg je voorzichtig 75 μL agarose-oplossing per put toe in een plaat met 96 putten. Zet het aan de zijkant van de put om een meniscus te vormen, wat resulteert in een niet-hechtende ronde bodem. Laat het 15 minuten stollen bij kamertemperatuur. Maak de cellen (stap 2.3.12) los van de in stap 2.3.14 verkregen kolf. Voeg 10.000 cellen per put van glioblastoomcellen toe en voltooi om een totaal volume van 150 μL per put te bereiken met DMEM dat 1 g bevat · L-1 van glucose, L-glutamine, natriumpyruvaat en natriumbicarbonaat, en aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 eenheden·ml-1 penicilline en 100 μg·ml-1 streptomycine. Incubeer cellen bij 37 °C zonder de plaat gedurende 3 dagen te verplaatsen. Vervang vervolgens de helft van de media door verse media om de 2 dagen met een meerkanaals pipet tot verdere experimenten. Houd de pipetpunt in het bovenste deel van de put om schade aan de agarose of de sferoïde zelf te voorkomen.OPMERKING: De grootte van de sferoïden hangt af van het aantal gezaaide cellen en de cellijn, dus het moet worden aangepast afhankelijk van de experimenten. Het in ovo modelPlaats bevruchte eieren van Japanse kwartel (C. japonica) in een broedmachine (37 °C en 57% vochtigheid) op trays met een automatische rotator die eieren om de 2 uur draait. Deze dag wordt beschouwd als Embryonale Dag (ED) 0. Was plastic weegboten door ze in 70% (w/v) ethanol te plaatsen. Haal de weegboten eruit en droog ze onder een zuurkast.OPMERKING: Vanaf dit punt worden experimenten niet uitgevoerd in steriele omstandigheden. Er zijn echter schone omstandigheden vereist om de ontwikkeling van schimmels op de embryo’s te voorkomen. Open op ED3 de eieren voorzichtig met een pincet met dunne uiteinden voorgewassen met 70% (w / v) ethanol. Giet het embryo in een plastic weegboot, bedek het met een andere weegboot en plaats het gedurende 3 dagen in een standaard bevochtigde couveuse bij 37 °C. Maak op ED6 een kleine incisie in het chorioallantoïsche membraan (CAM) met een naald van 23 G. Plaats met behulp van een pipet een 7-daagse sferoïde op de incisie en breng het embryo gedurende 3 dagen terug naar de couveuse, tot verdere experimenten.OPMERKING: Een fluorescerende kleurstof kan in het oog van het embryo worden geïnjecteerd om bloedvaten te visualiseren. Plaats op de dag van het experiment de flexibele sonde bovenop de gevasculariseerde tumor met behulp van een micromanipulator. De in vivo modelOPMERKING: Dit deel van het protocol is aangepast van het eerder gepubliceerde deel als referentie14. Volwassen meerkleurige fluorescerende AMU-Neuroinflam muizen (B6.Cg-Tg(Thy1-CFP)23Jrs(Ly6a-EGFP)G5Dzk(Itgax-EYFP)1Mnz/FD) werden gebruikt; deze muizen presenteren labeling van een subpopulatie van Thy1+ neuronen door transgene expressie van ECFP, labeling van perifere LyzM+ ontstekingscellen door transgene expressie van EGFP en etikettering van een subtype van microglia dat EYFP tot expressie brengt onder controle van Cd11c+. Kortom, de dieren worden licht verdoofd met 1,5% isofluraan gedurende 2 minuten voor elke behandeling of injectie. Voor de operatie worden de dieren verdoofd met Ketamine (120 mg/kg; IP) en Xylazine (12 mg/kg; IP). Vervolgens wordt 3% Lidocaïne-gel lokaal aangebracht om eventuele pijn in de oren te verlichten die gepaard gaat met de fixatie van stereotactische ondersteuning. Vervolgens wordt 0,25% Bupivacaïne-oplossing toegediend aan de operatieplaats om eventuele pijn als gevolg van de craniotomie te verlichten. Nadat de muis was voorbereid op een operatie, werd een craniotomie van 4 mm diameter uitgevoerd volgens referentie14. Met een naald van 26 G werd een gat gemaakt in de dura-mater in het midden van de craniotomie en werd de tumorsferoïde geïnjecteerd met het in referentie beschreven injectiesysteem14. Bovendien, zoals hier beschreven, werd een flexibele elektrode op de GCamp6 of DsRed geplaatst die tumorsferoïde tot expressie bracht voordat de craniotomie met een glazen venster werd afgesloten.Plaats een druppel Dulbecco’s Fosfaat-Gebufferde Zoutoplossing (DPBS) zodat deze de craniotomie bedekt. Plaats de flexibele elektrode op de druppel DPBS en plaats de achterkant van de sonde met contactpads voorzichtig op de rug van de muis (figuur 4B).OPMERKING: Gebruik steriele handschoenen en een “tip only” techniek. Vervang de handschoenen als er contact komt met een niet-steriel oppervlak. Zorg voor thermische ondersteuning tijdens deze procedure. Raak de DPBS-druppel aan met een klein stukje papier om DPBS te absorberen totdat de sonde plat op de dura kan liggen en de kromming van de hersenen kan volgen. Zorg ervoor dat een kleine laag DPBS onder de elektroden blijft zonder uit de zijkant van de elektrode te ontsnappen. Dit zorgt voor een barrière tegen lijmoverloop tijdens de volgende stappen.OPMERKING: Steriliseer alle apparatuur voor gebruik. Plaats een kleine druppel siliconenlijm op de sonde en bedek deze met een rond dekglas van 5 mm. Duw het afdekglas naar beneden totdat de siliconen gelijkmatig zijn verdeeld en de afstand tussen het afdekglas en de sonde minimaal is. Duw het afdekglas nog eens 30 s naar beneden zodat siliconen kunnen stollen. Om het dekglas vast te zetten, brengt u snel secondelijm aan de zijkanten aan en duwt u het naar beneden totdat de lijm is uitgehard. Breng met behulp van een tandenstoker secondelijm aan op de nek van de sonde en zorg ervoor dat de secondelijm onder de nek wordt getrokken om er stabiele ondersteuning voor te bieden. Bedek de schedel met tandcement om een chronische dop te bouwen. Zorg er speciaal voor dat u alleen de randen van het afdekglas bedekt. Til de achterkant van de sonde op en breng cement aan onder de hals van de sonde. Laat de sonde op het cement rusten voordat deze uithardt. Duw de hals van de sonde voorzichtig naar beneden met een stompe tang, zodat het oppervlak zich op hetzelfde niveau bevindt als dat van het dekglas en niet in de weg staat van het microscoopobjectief tijdens het experiment. Bedek de bovenkant van de sondehals met niet meer dan 1,5 mm tandcementlaag om een stevige grip op de sonde te krijgen. Bouw een cementput met een nok van 1,5 mm op een afstand van 1-2 mm rond het dekglas om een bassin te creëren voor de onderdompelingsvloeistof voor de beeldvorming van twee fotonen (figuur 4C). Nadat het cement is uitgehard, breng buprenorfine postoperatieve analgetica aan (0,05 mg / kg, 0,1 ml per 10 g lichaamsgewicht subcutaan) en houd het dier in een warme atmosfeer totdat het wakker wordt. Dit omvat de nabijheid van een infraroodlamp en het inpakken van het dier in een papieren handdoek.OPMERKING: Plaats een thermometer ter hoogte van de muis om de temperatuur te controleren. Karakteriseer de impedantie in het bereik van 1-10 kHz met behulp van een potentiostaat. Laat het dier minstens 10 dagen herstellen van de operatie. Dien ontstekingsremmende geneesmiddelen onmiddellijk na de operatie toe en blijf de toestand van het dier controleren om de juiste postoperatieve analgesie te bieden. 4. Pulsed Electric Field (PEF) levering en beeldvorming Plaats de monsters onder een fluorescentiemicroscoop. In het geval van 3D-modellen kunnen tumoren alleen van bovenaf worden waargenomen.OPMERKING: Voor het in ovo-model werden experimenten uitgevoerd onder een epifluorescentiemicroscoop (maar is ook mogelijk met een microscoop met twee fotonen), terwijl experimenten met het in vivo-model werden uitgevoerd onder een microscoop met twee fotonen (figuur 6). Sluit een pulsgenerator aan op de contactpads van de apparaten, met behulp van pogo-pinconnectoren (in vitro) of krokodillenklemmen (in ovo en in vivo) (figuur 4A). Stel de gewenste parameters in (aantal pulsen, spanning, pulsduur, frequentie) en pas PEF’s toe door de generator te laten draaien (figuur 4A). Meet fluorescentie tegelijkertijd om de effecten van de PEF’s in realtime te observeren.