心筋虚血および再灌流傷害の改善されたげっ歯類モデル

この研究は、南京漢方医科大学の動物ケアおよび使用委員会によって承認されました(許可番号202004A002)。この研究は、実験動物の使用に関する国立衛生研究所(NIH)のガイドライン(NIH出版第85-23号、2011年改訂)に厳密に従った。30匹の雄のSprague-Dawleyラット(体重、300±50g;年齢、12±14週間)をこの研究に使用した。 1. 動物の準備 手術前にラットに食物と水を奪う12時間。術前断食は肺吸引を防ぐことを目的とした14。 手術前に高圧蒸気滅菌器を使用してすべての器具を滅菌してください。 腹腔内注射でペントバルビタールナトリウム(1.5%、75mg/kg) を 投与してラットを麻酔する( 材料表参照)。 ピンチトゥテストを実行して麻酔の有効性を評価します。注:ラットは、後足をピンセットで保持したときに反射が観察されない場合、十分に麻酔をかけられたとみなされます。 2 つのペーパークリップの中央部分をまっすぐにして、「S」シェイプにします。各「S」の広い部分をプルダウンして、小さなリトラクターを形成します。 直径2mmのポリ塩化ビニル(PVC)チューブを7mmの長さに切断します。長さ10cmの4-0縫合糸をPVCチューブに挿入し、その両端を結ぶ。 左前下降(LAD)冠状動脈とPVCチューブを6-0縫合糸を用いて一緒にリゲートする。眼科用はさみでPVCチューブの中央にある溝を切り、溝を使って6-0縫合糸をチューブに通し、脱落を防ぎます。メモ:PVCチューブと「S」形状リトラクターは、 補足図1に示されています。 2. 手術手順 以下の手順に従って、改良されたMIRIラットモデルを生成するための手術を行う。注:改良されたMIRI法によって生成された動物モデル群は、記事全体を通して実験モデル群と呼ばれる。 麻酔後(ステップ1.2)、ラットを手術ボード上に仰臥位で配置して、ラットの四肢をテープで固定する。首と左前胸部を脱毛クリームで剃り、アルコール75%とヨードフォアスクラブで皮膚をきれいにします。 眼科用はさみを使用して、中央の子宮頸部線に沿って首の皮膚を縦に切断する。 眼科用ピンセットで首筋を分離し、両側にリトラクター(ステップ1.4)を置いてさらに引っ込めます。注:このステップ中に甲状腺からの出血を防ぐために重要であるため、気管を適切に露出させる必要があります。 気管を露出させた後、第4気管輪と第5気管輪の間の空間を特定する。このスペースが穿刺ポイントです。 針先の鈍い縁を使ってこの点に印を付けます。この時点でクリコイド軟骨に平行に3mmの切開を行う。 切開部を介して吸引トロカール(材料表を参照)を気管に挿入し(ステップ2.1.5)、ラットを機械的に換気して、80呼吸/分の速度および8mL/kgの一回換気量で正常な呼吸を維持する。 次に、メスを45°の角度で保持しながら、剣状突起から2番目の左肋間腔の中央まで4〜5cmの切開を行う。穏やかかつゆっくりと、眼科用ピンセットを使用して大胸筋と鞘状前筋を分離し、肋間腔にアクセスする。 眼科用はさみを使用して、左の第3肋骨と第4肋骨の間を横方向に1.5cm切開する。 必要に応じて、左肺で覆われた心臓を露出させるために第4の肋骨を切り取ります。これにより、視認性が向上します。 怪我を防ぐために、生理食塩水に浸した綿球を胸腔内の肺の上に置きます。眼用ピンセットを用いて心膜を解剖し、ピンセットで左心房付属器を持ち上げ、大動脈の根元に存在する冠状動脈骨を同定する。 左肺と耳介の間の部分で、6-0の外科用縫合糸を用いてLADと予め準備された短いチューブ(ステップ1.6)を結紮し、スリップノットを用いて結ぶ。PVCチューブの溝にスリップノットを置き、第2のスリップノットを用いてライゲーションチューブとLADを45分間締め付けます(図1A、B)。 虚血期間中の左心室の前部の色の変化とSTセグメントの隆起を心電図(ECG)に記録する。注:左心室の前部は虚血期間中に薄くなる。 動脈クリップを使用して胸筋と皮膚を締め付け、湿った生理食塩水ガーゼで傷口を覆います。 スリップノットを緩め、45分15後に予め用意したショートチューブを取り外した(図1C)。 ラットを再灌流中に麻酔をかけたまま2時間。 以前に公開された手順16に従ってラットモデルを生成する手術を行う。注:この動物モデルグループは、記事全体を通して既存のモデルグループと呼ばれています。 LAD冠状動脈の結紮前に、実験モデル群と同様の工程を行う。 虚血期間中、実験モデル群と同じ位置に6-0の外科的縫合糸のみを用いて、各ラットの近位LAD冠状動脈をスリップノットで結紮し、スリップノットを45分間結ぶ。 結紮後、ピンセットでスリップノットを緩め、ラットの切開部を縫合針およびピンセットで縫合し、ラットの心臓を収穫する前に、再灌流17、18、19の期間にわたって1.5%ペントバルビタールナトリウムの深い麻酔で動物を保温する。 3. トリフェニルテトラゾリウムクロリド染色の評価 再灌流の終わりに、ラットはまだ深く麻酔をかけながらユーテン化される。ネズミを犠牲にし、すぐに彼らの心を収穫する16,20.PBS溶液で心臓を洗い流し、−20°Cで約20分間保存して組織を硬化させる。 続いて、ミクロトームブレードで心臓を2mmスライスに切断し、2%トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)( 材料表参照)とともに37°Cで約30分間インキュベートし、10%中性ホルマリンで固定する。 心臓切片を撮影し、ImageJソフトウェアの画像処理プログラムを用いて梗塞領域を算出する( 材料表参照)。注:染色のために、梗塞部位は淡白く見えるが、正常組織は暗赤色に見える。 4. 組織学的染色 再灌流期間の終わりに1.5%ペントバルビタールナトリウムの深い麻酔下で心臓を収穫する。 心臓を10%ホルマリンで4°Cで48時間固定する。 続いて、ミクロトームで心臓を少なくとも6つのスライス(厚さ5μm)に切除し、ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)およびマッソン染色のために少なくとも3つのスライスを確保する20,21。 スライドを光学顕微鏡で観察し、撮影します。 5. 心電図評価 動物を実験群または既存のMIRIモデル群または偽群にランダムに分割して、ECG変化を評価する。 外科的結紮中にすべてのラットを麻酔し、標準的な四肢リードIIトレース20,21を評価してECG変化を同定し、心筋虚血を確認する。 すべての画像をデジタルライブラリに保存します。 6. 統計解析 科学的なグラフと統計ソフトウェアを使用して統計分析を実行します( 材料表を参照)。 すべてのデータを平均±平均の標準誤差として表します。各グループの正規性検定および対数正規性検定の後、一元配置分散分析およびt検定22を実行して、グループ間の有意差を決定した。 p値<0.05を統計的に有意と考えてください。