Primærkulturer av rotteastrocytter og mikroglia og deres bruk i studien av amyotrofisk lateral sklerose

Cellekulturteknikker har gitt opphav til mange fremskritt innen ulike felt av cellulær nevrofysiologi innen helse og sykdom. Spesielt tillater primære cellekulturer, nylig isolert fra nevronvevet til et laboratoriedyr, eksperimentøren å studere oppførselen til forskjellige celler i forskjellige biokjemiske medier og fysiologiske oppsett. Bruk av forskjellige fluorescerende fysiologiske indikatorer som Ca²⁺-sensitive fargestoffer i kombinasjon med time-lapse videomikroskopi gir bedre innsikt i de cellulære biofysiske og biokjemiske prosessene i sanntid.

ALS er en ødeleggende nevrodegenerativ sykdom som påvirker øvre og nedre motorneuroner¹. Sykdommen har en kompleks patogenese av familiær type, men hovedsakelig av sporadisk form (90% av tilfellene)². Det er velkjent at ikke-celle autonome mekanismer bidrar til ALS patofysiologi, hovedsakelig på grunn av den essensielle rollen til gliaceller³. ALS er også godt karakterisert som en nevroinflammatorisk sykdom med involvering av humorale og cellulære faktorer av betennelse.

Immunoglobulin G er mye brukt som en molekylær markør i ALS og andre nevrodegenerative sykdommer. Å studere serumnivået til denne markøren kan indikere tilstedeværelsen og stadiet av nevroinflammasjon i sykdommen ^4,5,6, mens dens tilstedeværelse i cerebrospinalvæsken kan indikere et brudd på blodhjernebarrieren⁷. IgG ble også identifisert som avleiringer i ryggmargsmotornevronene hos ALS-pasienter⁷. Likevel har denne tilnærmingen vist noen uoverensstemmelser i korrelasjonen av nivået av IgG med stadium og egenskaper av sykdommen⁶.

IgG isolert fra sera hos ALS-pasienter (ALS IgG) kan indusere kalsiumrespons i naive astrocytter⁸ og glutamatfrigjøring i nevroner, noe som peker på en excitotoksisk effekt – et kjennetegn på ALS-patologi⁹. Studier på hSOD1^G93A ALS-rottemodellen (som inneholder flere kopier av den humane SOD1-mutasjonen¹⁰) viste imidlertid en rekke markører for oksidativt stress i dyrkede neurogliaceller¹¹, vev 12,13,14 eller levende dyr ¹³. Det er bemerkelsesverdig at astrocytter dyrket fra ALS-rottemodellen var mer utsatt for oksidativt stress indusert av peroksid enn astroglia fra ikke-transgene kullkamerater¹¹.

Mikrogliaceller i kultur påvirkes av ALS IgG på en mindre tydelig måte. Nemlig viste en BV-2 mikroglialcellelinje en økning i signalet fra fluorescerende markører for oksidativt stress som svar på anvendelsen av bare 4/11 ALS IgG-pasientprøver¹⁵. Det er velkjent at mikroglia deltar i mange nevroinflammatoriske patologier, og legger til oksidativt stress og sen progresjonsfase i den ikke-celle autonome mekanismen til ALS^16,17. Likevel indikerte dataene med ALS IgGs at disse cellene kanskje ikke er like reaktive som astrocytter til disse humorale faktorene for ALS-betennelse. Flere studier har blitt utført med primære astrocytter fra ALS murine modeller, ikke bare hos valper, men også hos symptomatiske dyr, enten på hjernen eller på ryggmargen 18,19,20,21. Dette gjelder også for mikrogliale primærkulturer, men i mindre grad enn astrocytter og hovedsakelig fra hjernegrupper på embryostadiet^22,23,24.

Vi bruker time-lapse videoavbildning av Ca²⁺ på celler i dyrkning primært som et middel til å følge intracellulære transienter av dette ionet som en fysiologisk markør for eksitotoksisitet. Ved biofysisk karakterisering av disse transientene (amplitude, areal under forbigående, stigningstid, frekvens) kan forskeren således oppnå eksperimentelle diagnostiske parametere fra ulike cellulære modeller av nevrodegenerasjon. Denne teknikken gir dermed en fordel av en kvantitativ fysiologisk vurdering av IgG som sykdomsbiomarkører. Det finnes en stor mengde litteratur om rollen til IgGs og Ca²⁺ i induksjonen av ALS. De fleste av disse studiene ble utført ved å indusere ALS ved å injisere pasient IgGs i eksperimentelle dyr 25,26,27,28,29^, som deretter viste intracellulær Ca ²⁺ høyde og IgG-avsetninger. En rekke studier undersøkte effekten av ALS IgGs på motorsynapsen in vitro^30,31,32. I ovennevnte sammenheng setter teknikken som presenteres her fokus på glialcellene som viktige aktører i den ikke-celle autonome mekanismen til ALS og kvantifiserer deres potensielle excitotoksiske respons på IgGs som humorale faktorer for nevroinflammasjon. Denne tilnærmingen kan ha en bredere anvendelse i testing av andre humorale faktorer som hele sera, CSF eller cytokiner i forskjellige cellekultursystemer og i cellulære modeller av generell betennelse.

Dette papiret beskriver hvordan man forbereder primære kulturer av gliaceller, astrocytter og mikroglia fra cortices av Sprague Dawley-rotter og hvordan man videre kan bruke disse cellene til å studere ALS-patofysiologi med pasient sera-avledet IgG. Protokoller er detaljerte for fargestoffbelastning av dyrkede celler (figur 1) og opptak av Ca²⁺ endringer i time-lapse videoavbildningseksperimenter. Eksempler på videoopptak vil vise hvordan gliaceller reagerer på ALS IgG sammenlignet med ATP, sistnevnte aktiverer purinerge membranreseptorer. Vist for første gang er et eksempel på hvordan astrocytter isolert fra hSOD1^G93A ALS rottehjerne reagerer med en mer uttalt Ca 2+ respons på ALS IgG sammenlignet med ikke-transgene kontroller og hvordan man relaterer denne prosessen til forskjellene i Ca²⁺ butikkdrift. Også vist er et eksempel på kalsiumavbildning i mikrogliaceller akutt utfordret med ALS IgG, med bare en beskjeden respons av intracellulært kalsium.