Vi har använt standardtekniker för auditiv hjärnstamsrespons (ABR) och tillämpat dem på kläckande kycklingar, en brådmogen fågelmodell för hörselfunktion. Protokollet beskriver djurberedning och ABR-förvärvstekniker i detalj, med steg som kan översättas till andra fågel- eller gnagaremodeller.
Det auditiva hjärnstamssvaret (ABR) är en ovärderlig analys inom klinisk audiologi, icke-mänskliga djur och mänsklig forskning. Trots den utbredda användningen av ABR för att mäta auditiv neural synkronisering och uppskatta hörselkänslighet i andra ryggradsdjursmodellsystem har metoder för registrering av ABR i kycklingen inte rapporterats på nästan fyra decennier. Kycklingar ger en robust djurforskningsmodell eftersom deras hörselsystem är nära funktionell mognad under sena embryonala och tidiga kläckningsstadier. Vi har demonstrerat metoder som används för att framkalla en- eller tvåkanaliga ABR-inspelningar med hjälp av subdermala nålelektroduppsättningar i kycklingkläckningar. Oavsett elektrodinspelningskonfiguration (dvs. montage) inkluderade ABR-inspelningar 3-4 positivtgående toppvågformer inom de första 6 ms av en supratröskelklickstimulans. Topp-till-dal-vågformsamplituder varierade från 2-11 μV vid högintensiva nivåer, med positiva toppar som uppvisade förväntade latensintensitetsfunktioner (dvs. ökning av latens som en funktion av minskad intensitet). Standardiserad hörlursposition var avgörande för optimala inspelningar eftersom lös hud kan täppa till hörselgången och djurrörelser kan lossna stimulansgivaren. Toppamplituderna var mindre och latenserna var längre när djurens kroppstemperatur sänktes, vilket stödde behovet av att upprätthålla fysiologisk kroppstemperatur. För unga kläckningar (<3 h efter lucka dag 1) höjdes trösklarna med ~5 dB, topplatenserna ökade ~1-2 ms och topp till dalamplituder minskade ~1 μV jämfört med äldre kläckningar. Detta tyder på ett potentiellt ledande relaterat problem (dvs. vätska i mellanörathålan) och bör övervägas för unga kläckningar. Sammantaget möjliggör de ABR-metoder som beskrivs här noggrann och reproducerbar registrering av in vivo hörselfunktion hos kycklingkläckningar som kan tillämpas på olika utvecklingsstadier. Sådana fynd jämförs lätt med mänskliga och däggdjursmodeller av hörselnedsättning, åldrande eller andra hörselrelaterade manipulationer.
Studien av framkallade neurala svar på ljudstimuli går tillbaka över ett halvt sekel1. Det auditiva hjärnstamssvaret (ABR) är en framkallad potential som har använts som ett mått på hörselfunktion hos både icke-mänskliga djur och människor i årtionden. Den mänskliga ABR presenterar med fem till sju vågformstoppar som konventionellt märks med romerska siffror (I-VII)2. Dessa toppar analyseras baserat på deras latens (tid för förekomst i millisekunder) och amplitud (topp-till-dalstorlek i mikrovolt) av de neurala svaren. ABR är avgörande för att utvärdera hörselnervens funktion och integritet samt hjärnstam och hörseltröskelkänslighet. Underskott i hörselsystemet resulterar i frånvarande, reducerade, långvariga eller onormala ABR-latenser och amplituder. Anmärkningsvärt nog är dessa parametrar nästan identiska hos människor och andra djur, vilket gör det till ett konsekvent objektivt test av hörselfunktionen i ryggradsdjursmodeller3.
Ett sådant modellsystem är kycklingen, och det är särskilt användbart av olika skäl. Fåglar kan klassificeras som altricial eller precocial4. Altricialfåglar kläcks med sinnen som fortfarande utvecklas; till exempel visar ladugårdsugglor inte en konsekvent ABR förrän fyra dagar efter lucka5. Brådmogna djur som kycklingluckan med nästan mogna sinnen. Uppkomsten av hörsel uppträder i embryonal utveckling, så att dagar före kläckning (embryonal dag 21) är hörselsystemet nära funktionell mognad 6,7,8. Altricialfåglar och de flesta däggdjursmodeller är mottagliga för yttre faktorer som påverkar utvecklingen och kräver djurhållning tills hörseln är mogen. Kyckling ABR kan utföras samma dag som luckan, avstå från behovet av utfodring eller en berikad miljö.
Den embryonala kycklingen har varit en välstuderad modell för fysiologi och utveckling, särskilt i den auditiva hjärnstammen. Specifika strukturer inkluderar kycklingcochleär kärna, uppdelad i nucleus magnocellularis (NM) och nucleus angularis (NA), och fågelkorrelaten för den mediala överlägsna olivoljan som kallas nucleus laminaris (NL)6,7. ABR är idealisk för att fokusera på central hörselfunktion före nivån på framhjärnan och cortex. Översättning mellan in vivo ABR-mätningar och in vitro neuronala studier av utveckling8, fysiologi9, tonotopi10 och genetik11,12 ger idealiska forskningsmöjligheter som stöder studier av övergripande hörselfunktion.
Även om ABR har studerats utförligt i däggdjursmodeller har det varit mindre fokus för fåglar. Tidigare fågel-ABR-studier inkluderar karakteriseringar av undulat13, hackspett14, mås15, dykfåglar16, zebrafink17, dygnsrycklingar18, kanariefågel19, tre arter av uggla 5,20,21,22 och kyckling23. Med tanke på de nästan fyra decennierna sedan den senaste grundliga karakteriseringen av kyckling ABR har många av de utrustningar och tekniker som tidigare använts förändrats. Insikter från studier i andra fågelmodeller kan hjälpa till att utveckla modern kyckling ABR-metodik samtidigt som de fungerar som en jämförelse med kyckling ABR. Detta dokument kommer att beskriva den experimentella installationen och designen för att möjliggöra ABR-inspelning hos kläckande kycklingar som också kan tillämpas på embryonala utvecklingsstadier och andra små gnagare och fågelmodeller. Dessutom, med tanke på kycklingens tidiga utveckling, kan utvecklingsmanipulationer utföras utan någon omfattande djurhållning. Manipuleringar till ett utvecklande embryo kan utvärderas bara några timmar efter att djuret kläckts med nästan mogen hörselförmåga.
Fåglarnas auditiva hjärnstam är väl studerad, och många strukturer är analoga med däggdjurets hörselväg. Hörselnerven ger excitatoriska ingångar till de två första ordningens centrala kärnor, den cochleära kärnan magnocellularis (NM) och angularis (NA). NM skickar en excitatorisk projektion bilateralt till sitt hörselmål, nucleus laminaris (NL)7. NL-projekt till kärnan mesencephalicus lateralis, pars dorsalis (MLd)40,41. NL projicerar också till den överlägsna olivkärnan (SON), som ger återkopplingshämning till NM, NA och NL42. Denna mikrokrets med lägre hörselstam är utsökt bevarad för den funktion den underordnar sig, ljudlokalisering och binaural hörsel33. Fågelns övre hörselhjärnstamregioner har också kärnor som är analoga med däggdjurets laterala lemniscus och underlägsna colliculus i mellanhjärnan. Med tanke på dessa likheter är sammansättningen av aviär ABR upp till den auditiva mellanhjärnan jämförbar med alla ryggradsdjur.
Medan flera fågelarter visar tre positiva toppar inom 6 ms efter stimulansstart, har korrelationen mellan ABR-toppar och centrala hörselstrukturer en viss variation. Våg I kan rimligen antas vara det första neurala svaret från den perifera basilarpapillen och hörselnerven och visar liten variation mellan individer (figur 1C). Efterföljande vågidentifiering är mindre säker och kan skilja sig åt mellan arter. Kuokkanen et al.17 fastställde nyligen att våg III av ladugårdsugglans ABR genereras av NL; därför är det rimligt att hävda att våg II härstammar från NM och NA i den cochleära kärnan20. Ugglan Wave III definierades dock som den positiva toppen som genererades 3 ms efter stimulansstart. Detta motsvarar våg II enligt definitionen i Kläcknings kyckling ABR. I ladugårdsugglan ABR kombinerades vågorna I och II.
Medan den kläckande kycklingen vanligtvis presenterades med tre toppar inom 6 ms, observerades ibland en fjärde topp (t.ex. se figur 1A). Befolkningsdata, större urvalsstorlek och ytterligare experimentella paradigmer skulle behövas för att stödja en fjärde våg, och i vissa fall en femvågig kyckling ABR. Det mest konsekventa fyndet var de tre topprepresentationer som visas här.
Eftersom ABR definieras som ett mått på neural synkronisering kan de viktigaste kärnorna i hörselvägen representera varje positiv topp i ABR. Signalen som passerar från hörselnerven till NM/NA och sedan till NL kan definiera vågor I, II respektive III i kläckande kyckling ABR. Dessutom kan den senare förekommande fjärde toppen av kyckling ABR representera en övre hjärnstam eller midhjärna hörselstruktur. Karakteriseringen av aviära ABR bör också överväga skillnaden mellan precocial och altricial fåglar. Mognaden av hörselsvar varierar mellan arter och påverkas också av andra kritiska egenskaper som rovdjursbeteende och / eller vokalinlärning4. Oavsett är de beskrivna metoderna och teknikerna lätt att tillämpa på en mängd olika fågel- och ryggradsdjur.
Vikten av att bibehålla djurens kroppstemperatur illustreras i figur 2. När den inre kroppstemperaturen minskade ökade latensen för ABR-svar för samma stimulansintensitetsnivå. Detta är mer uttalat när kroppstemperaturen sjunker under 32 °C36,37. Den ungefär 1 ms latensökningen i ABR är mindre än vad som tidigare rapporterats i kyckling23. Katayama23 använde dock en 12 dagar gammal kläckning som kyldes och därefter värmdes under en 4-timmarsperiod. Uppgifterna i figur 2 registrerades under kylningsprocessen under en 20-minuters period. För att få bästa möjliga kvalitet och mest konsekventa registreringar måste djurets kroppstemperatur bibehållas och alla registreringar bör göras vid samma fysiologiska temperatur bland djuren.
Effekten av ålder på ABR är liten men viktig att tänka på. Även om endast latensen för vågor I och II i ABR var signifikant annorlunda, beror detta delvis på att endast tre unga kläckningar användes i figur 3; de andra tre presenterades inte med tre identifierbara ABR-toppar. ABR-amplitud och tröskelförskjutningar kan också vara uppenbara om man använder stora urvalsstorlekar eller jämför frekvensspecifika ABR. Denna åldersrelaterade effekt kan orsakas av vätska i kycklingens mellanörat. Sådana ledande förändringar leder till en markant ökning av ABR-trösklarna för både mänskliga och andra däggdjursmodeller38,39.
Med hjälp av två olika inspelningsmontage observerades liknande svar (figur 4A). Medan det vanligaste montaget placerar referenselektroden bakom det stimulusmottagande örat, kan det vara användbart att ha referenselektroden i nackvävnaden om det finns kirurgiska ingrepp som åtföljer ABR. Om tvåkanaliga ABR-inspelningar används bör referenselektroderna dock placeras separat och symmetriskt, vilket är svårt om referenselektroden placeras i nacken. Mastoidpositionen för referenselektroden rekommenderas för att standardisera så många aspekter av inspelningen som möjligt. Tvåkanals ABR-inspelning är ett effektivt verktyg som kräver lite extra förberedelse och resulterar i liknande svar mellan öronen. Mindre amplitudskillnader berodde sannolikt på hörlurarnas placering. Tvåkanalsinspelning möjliggör enkel jämförelse mellan ett experimentellt manipulerat öra eller hjärnhalva kontra en kontroll. Den här inställningen skulle också krävas för att testa binaurala ABR: er. Framtida experiment med kyckling ABR kan hänvisa till tidigare litteratur om inspelningskonfigurationer och montage34.
Denna metod har flera begränsningar. Som nämnts i steg 5.1 kan dålig spekulumplacering leda till en 40 dBSPL-förändring som svar. Detta kan orsaka en felaktig tolkning av ett manipulerat eller modifierat djur. Följande försiktighetsåtgärder rekommenderas: skaffa ett stort urval av kontrolldata innan du förvärvar ABR för manipulerade eller muterade modeller. Minska inte stimulansintensiteten med mer än 20 dBSPL mellan inspelningarna. Om amplituden eller latensen skiftar mer än förväntat, kontrollera djurets och spekulumpositionen. Upprepa den ABR-stimulansen för att observera förändringar. Om spekulumet har rört sig, förvärva tidigare tester igen. En annan begränsning är kalibreringen av ABR. Utan korrekt kalibrering för att registrera ljudtrycksnivån är intensiteten som presenteras för djuret okänd. När du mäter ljudutgången, använd samma spekulum som vid experimentell inspelning och en liten mikrofon inuti ett hålrum som approximerar djurets hörselgångslängd (~ 5 mm). Mät samma tonfrekvenser som används i experiment, eftersom kalibreringar är frekvensspecifika. Manualen för både hårdvaru- och mjukvarusystem kan komma med anvisningar för kalibrering. Det finns också ytterligare filter som linjärfas och minsta fasfilter, vilket kan förbättra klick- och ton burst ABR43. Dessa filter användes inte i den aktuella studien. Ytterligare överväganden, som uppgångs- och falltiden för ett tonsprängt spektralkuvert som förändras som en funktion av frekvensen eller ändrar stignings- och falltiden för klickstimuli undersöktes inte heller. Det här är bra framtida undersökningar när tillförlitliga och konsekventa ABR kan förvärvas.
Jämförelsen av kläckningskyllan med andra fågelmodeller är lovande. Undulater och östra skrikugglor visar också tre positiva mikrovolttoppar inom de första 6 ms av ABR13,22. Hos olika arter av hackspettar ses också tre toppar, men deras latens är senare i tiden. Dessutom är intervallet för bästa frekvenskänslighet hos hackspettar mellan 1500 och 4000 Hz, vilket är något högre än kycklingens bästa tröskel vid 1000 Hz. Hos den vuxna kycklingen är den bästa känsligheten vid 2000 Hz35, så det kan bli förbättrad hörsel av höga frekvenser när kycklingkläckningar utvecklas till vuxna. Den utvecklingen kommer att skilja sig åt mellan fågelarter, med hänsyn till djurets altriciala eller precocious utveckling4.
De experimentella metoder som beskrivs här kan hjälpa till att bestämma vilka faktorer som leder till nackdelar eller förändringar i hörselsvar och trösklar, samt studier i olika stadier av embryonal utveckling. Genetisk manipulation, åldrande och bullerexponering är alla kända manipulationer hos djur och andra fågelmodeller 24,25,44,45. Dessa metoder bör utvidgas till kycklingmodellen nu när tekniker som in-ovo elektroporering möjliggör uttryck av proteiner som är fokalt och tidsmässigt styrda på ena sidan av den auditiva hjärnstammen12,46. Detta möjliggör direkt jämförelse av ABR från det genetiskt manipulerade örat till det kontralaterala kontrollörat med hjälp av ett tvåkanals inspelningsparadigm.
Sammantaget är ABR för kläckande kycklingar en användbar forskningsmetod, nästan identisk med mått på hörselfunktion i mänskliga och andra däggdjursmodeller. Det är också en icke-invasiv, in vivo-metod . Bortsett från anestesiinjektion och subdermal elektrodplacering på några millimeter krävs ingen annan fysisk manipulation. En kläckning kan teoretiskt testas flera gånger under en utvecklingstid på dagar eller veckor om den hålls i en lämplig miljö. Detta protokoll beskriver inte bara de nödvändiga stegen och inspelningsparametrarna för den kläckande kycklingen ABR, men det föreslår egenskaper hos en aviär ABR som kan informera ytterligare testning av auditiv hjärnstamsfunktion.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av NIH/NIDCD R01 DC017167
1/8 inch B&K Microphone | Brüel & Kjær | 4138 | Type 4138-A-015 also works |
Auditory Evoked Potential Universal Smart Box | Intelligent Hearing Systems | M011110 | |
Custom Sound Isolation Chamber | GK Soundbooth Inc | N/A | Custom built |
DC Power Supply | CSI/Speco | PSV-5 | |
ER3 Insert Earphone | Intelligent Hearing Systems | M015302 | Used as sound transducer |
Euthasol | Virbac | 710101 | Controlled Substance; euthanasia solution |
Insulin Syringe (29 G) | Comfort Point | 26028 | |
Ketamine | Covetrus | 11695-0703-1 | Controlled Substance |
Power Supply | Powervar | 93051-55R | |
Rectal Probe | YSI | 401 (10-09010) | Any 400 series probe will work with the YSI temperatuer monitor |
Subdermal needles | Rhythmlink | RLSND107-1.5 | |
Temperature Monitor | YSI | 73ATA 7651 | Works with any 400 series rectal probe |
Xylazine | Anased | 59399-110-20 | Used with ketamine and water for anesthetic |