Vi har brugt standard auditiv hjernestammerespons (ABR) teknikker og anvendt dem på rugekyllinger, en tidlig fuglemodel for auditiv funktion. Protokollen skitserer dyreforberedelse og ABR-erhvervelsesteknikker i detaljer med trin, der kan oversættes til andre fugle- eller gnavermodeller.
Det auditive hjernestammerespons (ABR) er et uvurderligt assay inden for klinisk audiologi, ikke-menneskelige dyr og menneskelig forskning. På trods af den udbredte anvendelse af ABAR’er til måling af auditiv neural synkronisering og estimering af hørefølsomhed i andre hvirveldyrsmodelsystemer er metoder til registrering af ABAR’er i kyllingen ikke blevet rapporteret i næsten fire årtier. Kyllinger giver en robust dyreforskningsmodel, fordi deres auditive system er næsten funktionel modning i sene embryonale og tidlige udklækningsstadier. Vi har demonstreret metoder, der bruges til at fremkalde en eller to-kanals ABR-optagelser ved hjælp af subdermale nåleelektrodearrays i kyllingens hatchlings. Uanset elektrodeoptagelseskonfiguration (dvs. montage) omfattede ABR-optagelser 3-4 positive topbølgeformer inden for de første 6 ms af en suprathreshold klikstimulus. Peak-to-trough bølgeformamplituder varierede fra 2-11 μV ved højintensitetsniveauer, med positive toppe, der udviste forventede latensintensitetsfunktioner (dvs. stigning i latenstid som en funktion af nedsat intensitet). Standardiseret øretelefonposition var afgørende for optimale optagelser, da løs hud kan okkludere øregangen, og dyrebevægelse kan løsne stimulustransduceren. Peak amplituder var mindre, og latenstider var længere, da dyrenes kropstemperatur sænkede, hvilket understøttede behovet for at opretholde fysiologisk kropstemperatur. For unge hatchlings (<3 timer efter luge dag 1) blev tærsklerne forhøjet med ~ 5 dB, spids latenstider steg ~ 1-2 ms, og top til trug amplituder blev reduceret ~ 1 μV sammenlignet med ældre hatchlings. Dette tyder på et potentielt ledende problem (dvs. væske i mellemørehulen) og bør overvejes for unge unge unger. Samlet set muliggør de ABR-metoder, der er skitseret her, nøjagtig og reproducerbar registrering af in vivo-auditiv funktion hos kyllinger, der kan anvendes på forskellige udviklingsstadier. Sådanne resultater sammenlignes let med menneskelige og pattedyrs modeller af høretab, aldring eller andre auditive relaterede manipulationer.
Undersøgelsen af fremkaldte neurale reaktioner på lydstimuli går tilbage over et halvt århundrede1. Det auditive hjernestammerespons (ABR) er et fremkaldt potentiale, der er blevet udnyttet som et mål for auditiv funktion hos både ikke-menneskelige dyr og mennesker i årtier. Den menneskelige ABR præsenterer med fem til syv bølgeformtoppe, der traditionelt er mærket med romertal (I-VII)2. Disse toppe analyseres ud fra deres latenstid (forekomststid i millisekunder) og amplitude (top-til-trugstørrelse i mikrovolt) af de neurale reaktioner. ABR er medvirkende til at evaluere funktionen og integriteten af hørenerven samt hjernestammen og høretærskelfølsomheden. Underskud i det auditive system resulterer i fraværende, reducerede, langvarige eller unormale ABR-latenstider og amplituder. Bemærkelsesværdigt nok er disse parametre næsten identiske hos mennesker og andre dyr, hvilket gør det til en konsekvent objektiv test af auditiv funktion på tværs af hvirveldyrsmodeller3.
Et sådant modelsystem er kyllingen, og det er især nyttigt af forskellige årsager. Fugle kan klassificeres som altricial eller precocial4. Altricial fugle lukker med sanser, der stadig udvikler sig; for eksempel viser slørugler ikke en konsistent ABR før fire dage efter luge5. Tidlige dyr som kyllingen lukker med næsten modne sanser. Hørelsens begyndelse sker i embryonal udvikling, således at det auditive system dage før luge (embryonal dag 21) er nær funktionel modning 6,7,8. Altricial fugle og de fleste pattedyrsmodeller er modtagelige for ydre faktorer, der påvirker udviklingen og kræver husdyrhold, indtil hørelsen er moden. Kylling ABER’er kan udføres samme dag som lugen, hvilket giver afkald på behovet for fodring eller et beriget miljø.
Den embryonale kylling har været en velunderstuderet model for fysiologi og udvikling, især i den auditive hjernestamme. Specifikke strukturer omfatter kylling cochlear kernen, opdelt i nucleus magnocellularis (NM) og nucleus angularis (NA), og fuglekorreleret af den mediale overlegne oliven kendt som nucleus laminaris (NL) 6,7. ABR er ideel til at fokusere på central auditiv funktion før niveauet af forhjerne og cortex. Oversættelse mellem in vivo ABR-målinger og in vitro-neuronale undersøgelser af udvikling8, fysiologi9, tonotopi10 og genetik11,12 giver ideelle forskningsmuligheder, der understøtter undersøgelser af den samlede auditive funktion.
Selvom ABR er blevet grundigt undersøgt i pattedyrsmodeller, har der været mindre fokus for fugle. Tidligere aviær ABR-undersøgelser omfatter karakteriseringer af undulaten13, spætte14, måge15, dykkerfugle16, zebrafinke17, daglige rovfugle18, kanydefugl19, tre uglearter 5,20,21,22 og kylling23. I betragtning af de næsten fire årtier siden den sidste grundige karakterisering af kyllingenS ABR har mange af de tidligere anvendte udstyr og teknikker ændret sig. Indsigter fra studier i andre fuglemodeller kan være med til at udvikle moderne ABR-metoder til kyllinger og samtidig fungere som en sammenligning med kyllingens ABR. Dette papir vil skitsere den eksperimentelle opsætning og design for at muliggøre ABR-registrering i rugekyllinger, der også kan anvendes på embryonale udviklingsstadier og andre små gnaver- og fuglemodeller. I betragtning af kyllingens tidlige udvikling kan udviklingsmanipulationer desuden udføres uden omfattende husdyrhold. Manipulationer til et udviklende embryo kan evalueres kun få timer efter, at dyret lukker med næsten modne høreevner.
Fuglens auditive hjernestamme er godt undersøgt, og mange strukturer er analoge med pattedyrets auditive vej. Den auditive nerve giver excitatoriske input til de to førsteordens centrale kerner, cochlear nucleus magnocellularis (NM) og angularis (NA). NM sender en excitatorisk projektion bilateralt til sit auditive mål, nucleus laminaris (NL)7. NL projekter til nucleus mesencephalicus lateralis, pars dorsalis (MLd)40,41. NL projekterer også til den overlegne olivariekerne (SON), som giver feedbackhæmning til NM, NA og NL42. Dette mikrokredsløb med lavere auditiv hjernestamme er udsøgt bevaret for den funktion, det tjener, lydlokalisering og binaural hørelse33. Fuglens øvre auditive hjernestammeområder har også kerner, der er analoge med pattedyrets laterale lemniscus og ringere colliculus i midterhjernen. I betragtning af disse ligheder er sammensætningen af den aviære ABR op til den auditive midterhjerne sammenlignelig på tværs af alle hvirveldyr.
Mens flere fuglearter viser tre positive toppe inden for 6 ms efter stimulusstart, har korrelationen mellem ABR-toppe med centrale auditive strukturer en vis variation. Bølge I kan med rimelighed antages at være det første neurale respons fra den perifere basilære papilla og auditive nerve og viser ringe variabilitet blandt individer (figur 1C). Efterfølgende bølgeidentifikation er mindre sikker og kan variere fra art til art. Kuokkanen et al.17 fastslog for nylig, at bølge III af sløruglens ABR genereres af NL; Det er således rimeligt at hævde, at bølge II stammer fra NM og NA af cochlear nucleus20. Uglen Wave III blev imidlertid defineret som den positive top, der genererede 3 ms efter stimulusstart. Dette svarer til bølge II som defineret i hatchling chicken ABR. I ladeuglen ABR blev bølger I og II kombineret.
Mens den rugende kylling normalt præsenterede tre toppe inden for 6 ms, blev der lejlighedsvis observeret en fjerde top (f.eks . Se figur 1A). Populationsdata, større stikprøvestørrelse og yderligere eksperimentelle paradigmer ville være nødvendige for at understøtte en fjerde bølge og i nogle tilfælde en fembølge kylling ABR. Det mest konsistente fund var de tre toprepræsentationer, der er vist her.
Da ABR er defineret som et mål for neural synkronisering, kan de vigtigste kerner i den auditive vej repræsentere hver positivt gående top i ABR. Signalet, der passerer fra hørenerven til NM/NA og derefter til NL, kan definere henholdsvis bølge I, II og III i den rugende kylling ABR. Derudover kan den senere forekommende fjerde top af kyllingen ABR repræsentere en øvre hjernestamme eller midbrain auditiv struktur. Karakteriseringen af aviære AAR’er bør også overveje forskellen mellem prækociale og altriciale fugle. Modningen af auditive reaktioner vil variere mellem arter og påvirkes også af andre kritiske træk som rovdyradfærd og / eller vokal læring4. Uanset hvad anvendes de beskrevne metoder og teknikker let på en række fugle- og hvirveldyrarter.
Betydningen af at opretholde dyrs kropstemperatur er illustreret i figur 2. Da den indre kropstemperatur faldt, steg latenstiden for ABR-responser for det samme stimulusintensitetsniveau. Dette er mere udtalt, når kropstemperaturen falder til under 32 °C36,37. Den ca. 1 ms latenstid stigning i ABR er mindre end tidligere rapporteret i kylling23. Katayama23 brugte dog en 12 dage gammel udklækning, der blev afkølet og efterfølgende opvarmet over en periode på 4 timer. Dataene i figur 2 blev registreret under køleprocessen over en periode på 20 minutter. For at opnå den bedste kvalitet og mest konsistente optagelser skal dyrets kropstemperatur opretholdes, og alle optagelser skal ske ved samme fysiologiske temperatur blandt dyr.
Effekten af alder på ABR er lille, men vigtig at overveje. Mens kun latenstiden for bølger I og II i ABR var signifikant anderledes, skyldes det dels, at kun tre unge hatchlings blev brugt i figur 3; de tre andre præsenterede ikke med tre identificerbare ABR-toppe. ABR-amplitude og tærskelforskydninger kan også være tydelige, hvis der anvendes store prøvestørrelser eller sammenlignes frekvensspecifikke ABR’er. Denne aldersrelaterede effekt kan være forårsaget af væske i kyllingens mellemøre. Sådanne ledende ændringer fører til en markant stigning i ABR-tærsklerne for både menneskelige og andre pattedyrsmodeller38,39.
Ved hjælp af to forskellige optagelsesmontager blev der observeret lignende reaktioner (figur 4A). Mens den mest almindelige montage placerer referenceelektroden bag det stimulusmodtagende øre, kan det være nyttigt at have referenceelektroden i nakkevævet, hvis der er kirurgisk indgreb, der ledsager ABR. Hvis der anvendes tokanals ABR-optagelser, skal referenceelektrerne imidlertid placeres separat og symmetrisk, hvilket er vanskeligt, hvis referenceelektroden placeres i nakken. Mastoidpositionen for referenceelektroden anbefales at standardisere så mange aspekter af optagelse som muligt. To-kanals ABR-optagelse er et effektivt værktøj, der kræver lidt ekstra forberedelse og resulterer i lignende reaktioner mellem ørerne. Mindre amplitudeforskelle skyldtes sandsynligvis placeringen af øretelefonen. To-kanals optagelse giver mulighed for nem sammenligning mellem et eksperimentelt manipuleret øre eller hjernehalvdel versus en kontrol. Denne opsætning vil også være nødvendig for at teste binaurale ABAR’er. Fremtidige eksperimenter med kyllingen ABR kan henvise til tidligere litteratur om optagelseskonfigurationer og montager34.
Denne metode kommer med flere begrænsninger. Som nævnt i trin 5.1 kan dårlig spekulumplacering føre til et skift på 40 dBSPL som svar. Dette kan medføre en forkert fortolkning af et manipuleret eller modificeret dyr. Følgende forholdsregler anbefales: Indhent en stor stikprøve af kontroldata, før abR’erne for manipulerede eller mutante modeller erhverves. Sænk ikke stimulusintensiteten med mere end 20 dBSPL mellem optagelserne. Hvis amplituden eller latenstiden skifter mere end forventet, skal du kontrollere dyrets og spekulumpositionen. Gentag den ABR stimulus for at observere ændringer. Hvis spekulummet er flyttet, skal du generhverve tidligere tests. En anden begrænsning er kalibreringen af ABR’er. Uden korrekt kalibrering til registrering af lydtrykniveauet er intensiteten, der præsenteres for dyret, ukendt. Når du måler lydudgang, skal du bruge det samme spekulum som i eksperimentel optagelse og en lille mikrofon inde i et hulrum, der tilnærmer sig dyrets øregangslængde (~ 5 mm). Mål de samme tonefrekvenser, der anvendes i eksperimenter, da kalibreringer er frekvensspecifikke. Manualen til både hardware- og softwaresystemer kan komme med anvisninger til kalibrering. Der er også yderligere filtre såsom lineær fase og minimumsfasefiltre, som kan forbedre klik- og toneudbrudABR’er 43. Disse filtre blev ikke anvendt i denne undersøgelse. Yderligere overvejelser, som stignings- og faldtid for en toneudbrudsspektralkuvert, der ændrede sig som en funktion af frekvensen eller ændrede stignings- og faldtidspunktet for klikstimuli, blev heller ikke undersøgt. Dette er gode fremtidige undersøgelser, når pålidelige og konsekvente ABR’er kan erhverves.
Sammenligningen af hatchling kyllingen til andre fuglemodeller er lovende. Budgerigars og østlige skrigugler viser også tre positive mikrovolt toppe inden for de første 6 ms af ABR13,22. I forskellige arter af spætter ses også tre toppe, men deres latenstid er senere i tiden. Derudover er rækkevidden af den bedste frekvensfølsomhed i spætter mellem 1500 og 4000 Hz, hvilket er noget højere end kyllingens bedste tærskel ved 1000 Hz. Hos den voksne kylling er den bedste følsomhed ved 2000 Hz35, så der kan være forbedret hørelse af høje frekvenser, da kyllingklækkelinger udvikler sig til voksne. Denne udvikling vil variere mellem fuglearter under hensyntagen til dyrets altriciale eller tidlige udvikling4.
De eksperimentelle metoder, der er skitseret her, kan hjælpe med at bestemme, hvilke faktorer der fører til skade eller ændringer i auditive reaktioner og tærskler samt undersøgelser på forskellige stadier af embryonal udvikling. Genetisk manipulation, aldring og støjeksponering er alle kendte manipulationer hos dyr og andre fuglemodeller 24,25,44,45. Disse metoder bør udvides til kyllingemodellen nu, hvor teknikker som in-ovo elektroporation muliggør ekspression af proteiner, der er fokalt og tidsmæssigt kontrolleret på den ene side af den auditive hjernestamme12,46. Dette muliggør direkte sammenligning af APER’er fra det genetisk manipulerede øre til det kontralaterale kontroløre ved hjælp af et tokanals optagelsesparadigme.
Samlet set er ABR for rugekyllinger en nyttig forskningsmetode, der næsten er identisk med målinger af hørefunktion i humane og andre pattedyrsmodeller. Det er også en ikke-invasiv in vivo-metode . Bortset fra bedøvelsesinjektion og subdermal elektrodeplacering på få millimeter kræves der ingen anden fysisk manipulation. En hatchling kan teoretisk testes flere gange i løbet af en udviklingstid på dage eller uger, hvis den holdes i et passende miljø. Denne protokol fastlægger ikke kun de nødvendige trin og registreringsparametre for hatchling kylling ABR, men den foreslår egenskaber ved en aviær ABR, der kan informere yderligere test i auditiv hjernestammefunktion.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde understøttes af NIH/NIDCD R01 DC017167
1/8 inch B&K Microphone | Brüel & Kjær | 4138 | Type 4138-A-015 also works |
Auditory Evoked Potential Universal Smart Box | Intelligent Hearing Systems | M011110 | |
Custom Sound Isolation Chamber | GK Soundbooth Inc | N/A | Custom built |
DC Power Supply | CSI/Speco | PSV-5 | |
ER3 Insert Earphone | Intelligent Hearing Systems | M015302 | Used as sound transducer |
Euthasol | Virbac | 710101 | Controlled Substance; euthanasia solution |
Insulin Syringe (29 G) | Comfort Point | 26028 | |
Ketamine | Covetrus | 11695-0703-1 | Controlled Substance |
Power Supply | Powervar | 93051-55R | |
Rectal Probe | YSI | 401 (10-09010) | Any 400 series probe will work with the YSI temperatuer monitor |
Subdermal needles | Rhythmlink | RLSND107-1.5 | |
Temperature Monitor | YSI | 73ATA 7651 | Works with any 400 series rectal probe |
Xylazine | Anased | 59399-110-20 | Used with ketamine and water for anesthetic |