אסטרטגיות חיסון להדבקת שורשי צמחים במיקרואורגניזמים הנישאים בקרקע
Summary
פרוטוקול זה מציג סיכום מפורט של אסטרטגיות לחיסון שורשי צמחים עם מיקרובים הנישאים באדמה. דוגמאות לפטריות Verticillium longisporum ו-Verticillium dahliae, מתוארות שלוש מערכות שונות של זיהום שורשים. יישומים פוטנציאליים וניתוחים אפשריים במורד הזרם מודגשים, ויתרונות או חסרונות נדונים עבור כל מערכת.
Abstract
בריזוספירה יש קהילה מיקרוביאלית מורכבת ביותר שבה שורשי הצמח מאותגרים כל הזמן. שורשים נמצאים במגע הדוק עם מגוון רחב של מיקרואורגניזמים, אך מחקרים על אינטראקציות הנישאות בקרקע עדיין נמצאים מאחורי אלה המבוצעות על איברים מעל פני הקרקע. אף על פי שכמה אסטרטגיות חיסון להדבקת צמחי מודל בפתוגנים שורשיים לדוגמה מתוארות בספרות, עדיין קשה לקבל סקירה מתודולוגית מקיפה. כדי להתמודד עם בעיה זו, מתוארות במדויק שלוש מערכות חיסון שורשים שונות שניתן ליישם כדי לקבל תובנות על הביולוגיה של אינטראקציות שורש-מיקרובים. לשם המחשה, מיני Verticillium (כלומר, V. longisporum ו – V. dahliae) שימשו כפתוגנים פולשי שורשים. עם זאת, ניתן להתאים את השיטות בקלות לחיידקים אחרים המתיישבים בשורשים – הן פתוגניים והן מועילים. על ידי התיישבות הצמח xylem, פטריות הנישאות בקרקע כלי דם כגון Verticillium spp. מציגות אורח חיים ייחודי. לאחר פלישת השורשים, הם מתפשטים דרך כלי הקסילם באופן אקרופטלי, מגיעים לירי ומעוררים תסמיני מחלה. שלושה מיני צמחים מייצגים נבחרו כמארחים לדוגמה: אראבידופסיס תליאנה, אונס זרעי שמן חשוב מבחינה כלכלית (Brassica napus) ועגבניות (Solanum lycopersicum). פרוטוקולים שלב אחר שלב ניתנים. מוצגות תוצאות מייצגות של מבחני פתוגניות, ניתוחי שעתוק של גנים של סמנים ואישורים בלתי תלויים על ידי מבנים מדווחים. יתר על כן, היתרונות והחסרונות של כל מערכת חיסונים נדונים ביסודיות. הפרוטוקולים המוכחים האלה יכולים לסייע במתן גישות לשאלות מחקר על יחסי גומלין בין שורש למיקרובים. הכרת האופן שבו צמחים מתמודדים עם מיקרובים בקרקע היא חיונית לפיתוח אסטרטגיות חדשות לשיפור החקלאות.
Introduction
קרקעות טבעיות מאוכלסות על ידי מספר מדהים של מיקרובים שיכולים להיות ניטרליים, מזיקים או מועילים לצמחים1. פתוגנים צמחיים רבים נישאים באדמה, מקיפים את השורשים ותוקפים את האיבר התת-קרקעי. מיקרואורגניזמים אלה שייכים למגוון רחב של קלדות: פטריות, אומיצטים, חיידקים, נמטודות, חרקים וכמה וירוסים 1,2. ברגע שתנאי הסביבה מעדיפים זיהום, צמחים רגישים יחלו ותנובת היבולים תרד. ההשפעות של שינויי האקלים, כגון התחממות כדור הארץ וקיצוניות מזג האוויר, יגדילו את שיעור הפתוגנים הצמחיים הנישאים בקרקע3. לכן, יהיה חשוב יותר ויותר לחקור את המיקרובים ההרסניים האלה ואת השפעתם על ייצור מזון ומזון, אך גם על מערכות אקולוגיות טבעיות. בנוסף, ישנם הדדים מיקרוביאליים באדמה שמקיימים אינטראקציה הדוקה עם שורשים ומקדמים צמיחה, התפתחות וחסינות של צמחים. כאשר הם מתמודדים עם פתוגנים, צמחים יכולים לגייס באופן פעיל יריבים ספציפיים בריזוספירה שיכולים לתמוך בהישרדות המארח על ידי דיכוי פתוגנים 4,5,6,7. עם זאת, פרטים מכניסטיים ומסלולים המעורבים באינטראקציות מועילות בין שורש למיקרובים עדיין אינם ידועים6.
לכן, חיוני להרחיב את ההבנה הכללית של אינטראקציות שורש-מיקרובים. יש צורך בשיטות אמינות לחיסון שורשים עם מיקרואורגניזמים הנישאים בקרקע כדי לבצע מחקרי מודל ולהעביר את הממצאים ליישומים חקלאיים. אינטראקציות מועילות בקרקע נחקרות, למשל, עם סרנדיפיטה אינדיקה (שנקראה בעבר Piriformospora indica), ריזוביום spp. מקבע חנקן, או פטריות מיקוריזאליות, בעוד שפתוגנים ידועים של צמחים הנישאים בקרקע כוללים את Ralstonia solanacearum, Phytophthora spp., Fusarium spp., ו– Verticillium spp.1. שני האחרונים הם סוגים פטרייתיים המופצים ברחבי העולם וגורמים למחלות כלי דם2. Verticillium spp. (Ascomycota) יכול להדביק מאות מיני צמחים – בעיקר דיקוטילדונים, כולל חד-שנתיים עשבוניים, רב-שנתיים עציים וצמחי יבול רבים 2,8. ההיפאה של Verticillium נכנסת לשורש וגדלה הן באופן בין-תאי והן תוך-תאית לכיוון הגליל המרכזי כדי ליישב את כלי הקסילם 2,9. בכלים אלה, הפטרייה נשארת במשך רוב מחזור החיים שלה. מכיוון שמוהל הקסילם דל בחומרים מזינים ונושא תרכובות להגנת הצומח, הפטרייה חייבת להתאים את עצמה לסביבה ייחודית זו. זה נעשה על ידי הפרשה של חלבונים הקשורים להתיישבות המאפשרים לפתוגן לשרוד בפונדקאישלו 10,11. לאחר ההגעה לשורש כלי הדם, הפטרייה יכולה להתפשט בתוך כלי הקסילם באופן אקרופטאלי לעלווה, מה שמוביל להתיישבות מערכתית של המארח 9,12. בשלב זה, הצמח מושפע לרעה בגידול 9,10,13. לדוגמה, פעלולים ועלים צהובים מופיעים, כמו גם תסיסה מוקדמת 13,14,15,16.
אחד החברים בסוג זה הוא Verticillium longisporum, המותאם מאוד לפונדקאים פלסיקאיים, כגון אונס זרעי השמן החשובים מבחינה אגרונומית, כרובית, וצמח המודל Arabidopsis thaliana12. מספר מחקרים שילבו את V. longisporum ו- A. thaliana כדי לקבל תובנות נרחבות על מחלות כלי דם הנישאות בקרקע ותגובות הגנת השורשים הנובעות מכך 13,15,16,17. ניתן לממש בדיקות רגישות פשוטות על ידי שימוש במערכת המודל V. longisporum / A. thaliana ומשאבים גנטיים מבוססים היטב זמינים עבור שני האורגניזמים. קרוב ל– V. longisporum הוא הפתוגן Verticillium dahliae. אף על פי ששני המינים הפטרייתיים מבצעים סגנון חיים ופלישה דומה של כלי דם, יעילות ההתפשטות שלהם משורשים לעלים ותסמיני המחלה המתעוררים ב-A. thaliana שונים: בעוד ש-V. longisporum בדרך כלל גורם לסנסנציה מוקדמת, זיהום V. dahliae גורם ל-18. לאחרונה, סיכום מתודולוגי הציג אסטרטגיות שונות לחיסון שורשים להדבקת A. thaliana עם V. longisporum או V. dahliae, וסייע בתכנון מערכי ניסוי19. בשטח, V. longisporum גורם מדי פעם לנזק משמעותי בייצור אונס זרעי שמן12, בעוד של-V. dahliae יש טווח פונדקאים רחב מאוד הכולל מספר מינים מעובדים, כגון גפן, תפוח אדמה ועגבנייה8. זה הופך את שני הפתוגנים למודלים מעניינים מבחינה כלכלית למחקר.
לפיכך, הפרוטוקולים הבאים משתמשים הן ב – V. longisporum והן ב – V. dahliae כפתוגנים שורשיים לדוגמה כדי להדגים גישות אפשריות לחיסונים שורשיים. אראבידופסיס (Arabidopsis thaliana), אונס זרעי שמן (Brassica napus) ועגבנייה (Solanum lycopersicum) נבחרו כמארחים לדוגמה. תיאורים מפורטים של המתודולוגיות ניתן למצוא בטקסט שלהלן ובסרטון הנלווה. נדונים יתרונות וחסרונות לכל מערכת חיסונים. יחד, אוסף פרוטוקולים זה יכול לסייע בזיהוי שיטה מתאימה לשאלות מחקר ספציפיות בהקשר של אינטראקציות שורש-מיקרוב.
Protocol
Representative Results
Discussion
בשל הפסדי היבול העצומים הנגרמים על ידי פיטופתוגנים הנישאים בקרקע1, נדרש שיפור של אסטרטגיות חקלאיות או זני יבולים. התובנה המוגבלת לגבי הפתוגנזה של מחלות המועברות בקרקע מעכבת את התפתחותם של צמחים עמידים יותר. יש לחקור את הפתומכניזמים הבסיסיים, שעבורם נדרשת פלטפורמה מתודולוגית…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לטים איבן וז’קלין קומורק על עבודה קודמת על שיטות אלה, לקבוצה של וולפגנג דרוגה-לייזר (המחלקה לביולוגיה פרמצבטית, אוניברסיטת וירצבורג, גרמניה) על שסיפקו את הציוד והמשאבים הדרושים לעבודה זו, ואת וולפגנג דרוגה-לייזר וכן את פיליפ קרייש (שניהם מאוניברסיטת וירצבורג) על הגהה ביקורתית של כתב היד. מחקר זה נתמך על ידי “Deutsche Forschungsgemeinschaft” (DFG, DR273/15-1,2).
Materials
| Agar (Gelrite) | Carl Roth | Nr. 0039 | all systems described require Gelrite |
| Arabidopsis thaliana wild-type | NASC stock | Col-0 (N1092) | |
| Autoclave | Systec | VE-100 | |
| BlattFlaeche | Datinf GmbH | BlattFlaeche | software to determine leaf areas |
| Brassica napus wild-type | see Floerl et al., 2008 | rapid-cycling rape | genome ACaacc |
| Cefotaxime sodium | Duchefa | C0111 | |
| Chicanery flask 500 mL | Duran Group / neoLab | E-1090 | Erlenmeyer flask with four baffles |
| Collection tubes 50 mL | Sarstedt | 62.547.254 | 114 x 28 mm |
| Czapek Dextrose Broth medium | Duchefa | C1714 | |
| Digital camera | Nikon | D3100 18-55 VR | |
| Exsiccator (Desiccator ) | Duran Group | 200 DN, 5.8 L | Seal with lid to hold chlorine gas |
| Fluorescence Microscope | Leica | Leica TCS SP5 II | |
| HCl | Carl Roth | P074.3 | |
| KNO3 | Carl Roth | P021.1 | ≥ 99 % |
| KOH | Carl Roth | 6751 | |
| Leukopor | BSN medical GmbH | 2454-00 AP | non-woven tape 2.5 cm x 9.2 m |
| MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) | Carl Roth | 4256.2 | Pufferan ≥ 99 % |
| MgSO4 | Carl Roth | T888.1 | Magnesiumsulfate-Heptahydrate |
| Murashige & Skoog medium (MS) | Duchefa | M0222 | MS including vitamins |
| NaClO | Carl Roth | 9062.1 | |
| Percival growth chambers | CLF Plant Climatics GmbH | AR-66L2 | |
| Petri-dishes | Sarstedt | 82.1473.001 | size ØxH: 92 × 16 mm |
| Plastic cups (500 mL, transparent) | Pro-pac, salad boxx | 5070 | size: 108 × 81 × 102 mm |
| Pleated cellulose filter | Hartenstein | FF12 | particle retention level 8–12 μm |
| poly klima growth chamber | poly klima GmbH | PK 520 WLED | |
| Potato Dextrose Broth medium | SIGMA Aldrich | P6685 | for microbiology |
| Pots | Pöppelmann GmbH | TO 7 D or TO 9,5 D | Ø 7 cm resp. Ø 9.5 cm |
| PromMYB51::YFP | see Poncini et al., 2017 | MYB51 reporter line | YFP (i.e. 3xmVenus with NLS) |
| Reaction tubes 2 mL | Sarstedt | 72.695.400 | PCR Performance tested |
| Rotary (orbital) shaker | Edmund Bühler | SM 30 C control | |
| Sand (bird sand) | Pet Bistro, Müller Holding | 786157 | |
| Soil | Einheitserde spezial | SP Pikier (SP ED 63 P) | |
| Solanum lycopersicum wild-type | see Chavarro-Carrero et al., 2021 | Type: Moneymaker | |
| Thoma cell counting chamber | Marienfeld | 642710 | depth 0.020 mm; 0.0025 mm2 |
| Ultrapure water (Milli-Q purified water) | MERK | IQ 7003/7005 | water obtained after purification |
| Verticillium dahliae | see Reusche et al., 2014 | isolate JR2 | |
| Verticillium longisporum | Zeise and von Tiedemann, 2002 | strain Vl43 |
References
- Mendes, R., Garbeva, P., Raaijmakers, J. M. The rhizosphere microbiome: significance of plant beneficial, plant pathogenic, and human pathogenic microorganisms. FEMS Microbiology Review. 37 (5), 634-663 (2013).
- Yadeta, K. A., Thomma, B. P. H. J. The xylem as battleground for plant hosts and vascular wilt pathogens. Frontiers in Plant Science. 4, 97 (2013).
- Delgado-Baquerizo, M., et al. The proportion of soil-borne pathogens increases with warming at the global scale. Nature Climate Change. 10 (6), 550-554 (2020).
- Berendsen, R. L., et al. Disease-induced assemblage of a plant-beneficial bacterial consortium. The ISME Journal. 12 (6), 1496-1507 (2018).
- Yuan, J., et al. Root exudates drive the soil-borne legacy of aboveground pathogen infection. Microbiome. 6 (1), 156 (2018).
- Liu, H., et al. Evidence for the plant recruitment of beneficial microbes to suppress soil-borne pathogens. New Phytologist. 229 (5), 2873-2885 (2021).
- Wang, H., Liu, R., You, M. P., Barbetti, M. J., Chen, Y. Pathogen biocontrol using plant growth-promoting bacteria (PGPR): role of bacterial diversity. Microorganisms. 9 (9), 1988 (2021).
- Inderbitzin, P., Subbarao, K. V. Verticillium systematics and evolution: how confusion impedes Verticillium wilt management and how to resolve it. Phytopathology. 104 (6), 564-574 (2014).
- Eynck, C., Koopmann, B., Grunewaldt-Stoecker, G., Karlowsky, P., von Tiedemann, A. Differential interactions of Verticillium longisporum und V. dahliae with Brassica napus with molecular and histological techniques. European Journal of Plant Pathology. 118 (3), 259-274 (2007).
- Floerl, S., et al. Defence reactions in the apoplastic proteome of oilseed rape (Brassica napus var. napus) attenuate Verticillium longisporum growth but not disease symptoms. BMC Plant Biology. 8, 129 (2008).
- Leonard, M., et al. Verticillium longisporum elicits media-dependent secretome responses with capacity to distinguish between plant-related environments. Frontiers in Microbiology. 11, 1876 (2020).
- Depotter, J. R. L., et al. Verticillium longisporum, the invisible threat to oilseed rape and other brassicaceous plant hosts. Molecular Plant Pathology. 17 (7), 1004-1016 (2016).
- Fröschel, C., et al. A gain-of-function screen reveals redundant ERF transcription factors providing opportunities for resistance breeding toward the vascular fungal pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 32 (9), 1095-1109 (2019).
- Zhou, L., Hu, Q., Johansson, A., Dixelius, C. Verticillium longisporum and V. dahliae: infection and disease in Brassica napus. Plant Pathology. 55 (1), 137-144 (2006).
- Ralhan, A., et al. The vascular pathogen Verticillium longisporum requires a jasmonic acid-independent COI1 function in roots to elicit disease symptoms in Arabidopsis shoots. Plant Physiology. 159 (3), 1192-1203 (2012).
- Reusche, M., et al. Stabilization of cytokinin levels enhances Arabidopsis resistance against Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 850-860 (2013).
- Iven, T., et al. Transcriptional activation and production of tryptophan-derived secondary metabolites in Arabidopsis roots contributes to the defense against the fungal vascular pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant. 5 (6), 1389-1402 (2012).
- Reusche, M., et al. Infections with the vascular pathogens Verticillium longisporum and Verticillium dahliae induce distinct disease symptoms and differentially affect drought stress tolerance of Arabidopsis thaliana. Environmental and Experimental Botany. 108, 23-37 (2014).
- Fröschel, C. In-depth evaluation of root infection systems using the vascular fungus Verticillium longisporum as soil-borne model pathogen. Plant Methods. 17 (1), 57 (2021).
- Karapapa, V. K., Bainbridge, B. W., Heale, J. B. Morphological and molecular characterization of Verticillium longisporum comb, nov., pathogenic to oilseed rape. Mycological Research. 101 (11), 1281-1294 (1997).
- Poncini, L., et al. In roots of Arabidopsis thaliana, the damage-associated molecular pattern AtPep1 is a stronger elicitor of immune signalling than flg22 or the chitin heptamer. PLoS One. 12 (10), 1-21 (2017).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Fradin, E. F., et al. Genetic dissection of Verticillium wilt resistance mediated by tomato Ve1. Plant Physiology. 150 (1), 320-332 (2009).
- Singh, S., et al. The plant host Brassica napus induces in the pathogen Verticillium longisporum the expression of functional catalase peroxidase which is required for the late phase of disease. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (4), 569-581 (2012).
- Zeise, K., von Tiedemann, A. Application of RAPD-PCR for virulence type analysis within Verticillium dahliae and Verticillium longisporum. Journal of Phytopathology. 150 (10), 557-563 (2002).
- Fröschel, C., et al. Plant roots employ cell-layer-specific programs to respond to pathogenic and beneficial microbes. Cell Host & Microbe. 29 (2), 299-310 (2021).
- Gigolashvili, T., et al. The transcription factor HIG1/MYB51 regulates indolic glucosinolate biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 50 (5), 886-901 (2007).
- Back, M. A., Haydock, P. P. J., Jenkinson, P. Disease complexes involving plant parasitic nematodes and soilborne pathogens. Plant Pathology. 51 (6), 683-697 (2002).
- Behrens, F. H., et al. Suppression of abscisic acid biosynthesis at the early infection stage of Verticillium longisporum in oilseed rape (Brassica napus). Molecular Plant Pathology. 20 (12), 1645-1661 (2019).
- Vorholt, J. A., Vogel, C., Carlström, C. I., Müller, D. B. Establishing causality: opportunities of synthetic communities for plant microbiome research. Cell Host & Microbe. 22 (2), 142-155 (2017).
