Стратегии инокуляции для заражения корней растений почвенными микроорганизмами
Summary
Этот протокол представляет собой подробное резюме стратегий прививки корней растений почвенными микробами. На примере грибов Verticillium longisporum и Verticillium dahliae описаны три различные системы корневой инфекции. Выделяются потенциальные области применения и возможные последующие анализы, а также обсуждаются преимущества или недостатки для каждой системы.
Abstract
Ризосфера содержит очень сложное микробное сообщество, в котором корни растений постоянно оспариваются. Корни находятся в тесном контакте с широким спектром микроорганизмов, но исследования почвенных взаимодействий все еще отстают от тех, которые проводятся на надземных органах. Хотя некоторые стратегии прививки для заражения модельных растений модельными корневыми патогенами описаны в литературе, по-прежнему трудно получить всесторонний методологический обзор. Для решения этой проблемы точно описаны три различные системы корневой инокуляции, которые могут быть применены для получения понимания биологии взаимодействия корней и микробов. Например, виды Verticillium (а именно V . longisporum и V. dahliae) использовались в качестве патогенов модели вторжения корней. Однако методы могут быть легко адаптированы к другим корневым колонизирующим микробам – как патогенным, так и полезным. Колонизируя растение ксилемы, сосудистые почвенные грибы, такие как Verticillium spp., демонстрируют уникальный образ жизни. После корневой инвазии они распространяются через сосуды ксилемы акропетально, достигают побега и вызывают симптомы заболевания. В качестве модельных хозяев были выбраны три репрезентативных вида растений: Arabidopsis thaliana, экономически важный масличный рапс (Brassica napus) и томат (Solanum lycopersicum). Приведены пошаговые протоколы. Показаны репрезентативные результаты анализов патогенности, транскрипционного анализа маркерных генов и независимых подтверждений репортерными конструкциями. Кроме того, подробно обсуждаются преимущества и недостатки каждой системы прививки. Эти проверенные протоколы могут помочь в предоставлении подходов к исследовательским вопросам взаимодействия корневого микроба. Знание того, как растения справляются с микробами в почве, имеет решающее значение для разработки новых стратегий улучшения сельского хозяйства.
Introduction
Естественные почвы населены удивительным количеством микробов, которые могут быть нейтральными, вредными или полезными для растений1. Многие патогены растений переносятся через почву, окружают корни и атакуют подземный орган. Эти микроорганизмы относятся к самым разнообразным кладам: грибы, оомицеты, бактерии, нематоды, насекомые и некоторые вирусы 1,2. Как только условия окружающей среды благоприятствуют инфекции, восприимчивые растения станут больными, а урожайность сельскохозяйственных культур снизится. Последствия изменения климата, такие как глобальное потепление и экстремальные погодные условия, увеличат долю почвенных патогенов растений3. Поэтому становится все более важным изучать эти разрушительные микробы и их влияние на производство продуктов питания и кормов, а также на природные экосистемы. Кроме того, в почве есть микробные мутуалисты, которые плотно взаимодействуют с корнями и способствуют росту, развитию и иммунитету растений. При столкновении с патогенами растения могут активно вербовать специфических противников в ризосфере, которые могут поддерживать выживание хозяина, подавляя патогены 4,5,6,7. Тем не менее, механистические детали и пути, участвующие в полезных взаимодействиях корневого микроба, часто все еще неизвестны6.
Поэтому важно расширить общее понимание взаимодействия корневого микроба. Надежные методы инокуляции корней почвенными микроорганизмами необходимы для проведения модельных исследований и передачи полученных результатов сельскохозяйственному применению. Полезные взаимодействия в почве изучаются, например, с Serendipita indica (ранее известной как Piriformospora indica), азотфиксирующим Rhizobium spp. или микоризными грибами, в то время как известные почвенные патогены растений включают Ralstonia solanacearum, Phytophthora spp., Fusarium spp. и Verticillium spp.1. Последние два являются грибковыми родами, которые распространены глобально и вызывают сосудистые заболевания2. Verticillium spp. (Ascomycota) может заражать сотни видов растений – в основном двудольных, включая травянистых однолетников, древесные многолетники и многие сельскохозяйственные растения 2,8. Гифы Verticillium входят в корень и растут как межклеточными, так и внутриклеточными по направлению к центральному цилиндру для колонизации сосудов ксилемы 2,9. В этих сосудах грибок остается на протяжении большей части своего жизненного цикла. Поскольку сок ксилемы беден питательными веществами и несет защитные соединения растений, гриб должен адаптироваться к этой уникальной среде. Это достигается путем секреции связанных с колонизацией белков, которые позволяют патогену выживать в своем хозяине10,11. Достигнув корневой сосудистой системы, грибок может распространяться внутри сосудов ксилемы акропетально к листве, что приводит к системной колонизации хозяина 9,12. На данный момент на растение негативно влияет рост 9,10,13. Например, происходит задержка роста и желтые листья, а также преждевременное старение 13,14,15,16.
Одним из представителей этого рода является Verticillium longisporum, который хорошо приспособлен к медным хозяевам, таким как агрономически важный рапс, цветная капуста и модельное растение Arabidopsis thaliana12. Несколько исследований объединили V. longisporum и A. thaliana, чтобы получить обширное представление о сосудистых заболеваниях, передаваемых через почву, и результирующих реакциях защиты корней 13,15,16,17. Простое тестирование чувствительности может быть реализовано с использованием модельной системы V. longisporum / A. thaliana, и для обоих организмов доступны хорошо зарекомендовавшие себя генетические ресурсы. С V. longisporum тесно связан возбудитель Verticillium dahliae. Хотя оба вида грибов выполняют сходный сосудистый образ жизни и процесс инвазии, их эффективность размножения от корней до листьев и симптомы заболевания у A. thaliana различны: в то время как V. longisporum обычно вызывает раннее старение, инфекция V. dahliae приводит к увяданию18. Недавно в методологическом резюме были представлены различные стратегии корневой прививки для заражения A. thaliana V. longisporum или V. dahliae, помогающие в планировании экспериментальных установок19. В полевых условиях V. longisporum иногда наносит значительный ущерб производству масличного рапса12, тогда как V. dahliae имеет очень широкий диапазон хозяев, включающий несколько культивируемых видов, таких как виноградная лоза, картофель и помидор8. Это делает оба патогена экономически интересными моделями для изучения.
Таким образом, следующие протоколы используют как V. longisporum , так и V. dahliae в качестве модельных корневых патогенов для иллюстрации возможных подходов к корневым прививкам. Арабидопсис (Arabidopsis thaliana), масличный рапс (Brassica napus) и помидор (Solanum lycopersicum) были выбраны в качестве модельных хозяев. Подробное описание методологий можно найти в тексте ниже и в сопроводительном видео. Обсуждаются преимущества и недостатки для каждой системы инокуляции. Взятый вместе, этот набор протоколов может помочь определить подходящий метод для конкретных исследовательских вопросов в контексте взаимодействия корневого микроба.
Protocol
Representative Results
Discussion
Из-за огромных потерь урожая, вызванных почвенными фитопатогенами1, требуется улучшение стратегий ведения сельского хозяйства или сортов сельскохозяйственных культур. Ограниченное понимание патогенеза почвенных заболеваний препятствует развитию более устойчивых раст?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают признательность Тиму Ивену и Жаклин Коморек за предыдущую работу над этими методами, группе Вольфганга Дрёге-Лазера (кафедра фармацевтической биологии, Вюрцбургский университет, Германия) за предоставление оборудования и ресурсов, необходимых для этой работы, и Вольфганга Дрёге-Лазера, а также Филиппа Крейса (оба Вюрцбургского университета) за критическую корректуру рукописи. Это исследование было поддержано “Deutsche Forschungsgemeinschaft” (DFG, DR273/15-1,2).
Materials
| Agar (Gelrite) | Carl Roth | Nr. 0039 | all systems described require Gelrite |
| Arabidopsis thaliana wild-type | NASC stock | Col-0 (N1092) | |
| Autoclave | Systec | VE-100 | |
| BlattFlaeche | Datinf GmbH | BlattFlaeche | software to determine leaf areas |
| Brassica napus wild-type | see Floerl et al., 2008 | rapid-cycling rape | genome ACaacc |
| Cefotaxime sodium | Duchefa | C0111 | |
| Chicanery flask 500 mL | Duran Group / neoLab | E-1090 | Erlenmeyer flask with four baffles |
| Collection tubes 50 mL | Sarstedt | 62.547.254 | 114 x 28 mm |
| Czapek Dextrose Broth medium | Duchefa | C1714 | |
| Digital camera | Nikon | D3100 18-55 VR | |
| Exsiccator (Desiccator ) | Duran Group | 200 DN, 5.8 L | Seal with lid to hold chlorine gas |
| Fluorescence Microscope | Leica | Leica TCS SP5 II | |
| HCl | Carl Roth | P074.3 | |
| KNO3 | Carl Roth | P021.1 | ≥ 99 % |
| KOH | Carl Roth | 6751 | |
| Leukopor | BSN medical GmbH | 2454-00 AP | non-woven tape 2.5 cm x 9.2 m |
| MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) | Carl Roth | 4256.2 | Pufferan ≥ 99 % |
| MgSO4 | Carl Roth | T888.1 | Magnesiumsulfate-Heptahydrate |
| Murashige & Skoog medium (MS) | Duchefa | M0222 | MS including vitamins |
| NaClO | Carl Roth | 9062.1 | |
| Percival growth chambers | CLF Plant Climatics GmbH | AR-66L2 | |
| Petri-dishes | Sarstedt | 82.1473.001 | size ØxH: 92 × 16 mm |
| Plastic cups (500 mL, transparent) | Pro-pac, salad boxx | 5070 | size: 108 × 81 × 102 mm |
| Pleated cellulose filter | Hartenstein | FF12 | particle retention level 8–12 μm |
| poly klima growth chamber | poly klima GmbH | PK 520 WLED | |
| Potato Dextrose Broth medium | SIGMA Aldrich | P6685 | for microbiology |
| Pots | Pöppelmann GmbH | TO 7 D or TO 9,5 D | Ø 7 cm resp. Ø 9.5 cm |
| PromMYB51::YFP | see Poncini et al., 2017 | MYB51 reporter line | YFP (i.e. 3xmVenus with NLS) |
| Reaction tubes 2 mL | Sarstedt | 72.695.400 | PCR Performance tested |
| Rotary (orbital) shaker | Edmund Bühler | SM 30 C control | |
| Sand (bird sand) | Pet Bistro, Müller Holding | 786157 | |
| Soil | Einheitserde spezial | SP Pikier (SP ED 63 P) | |
| Solanum lycopersicum wild-type | see Chavarro-Carrero et al., 2021 | Type: Moneymaker | |
| Thoma cell counting chamber | Marienfeld | 642710 | depth 0.020 mm; 0.0025 mm2 |
| Ultrapure water (Milli-Q purified water) | MERK | IQ 7003/7005 | water obtained after purification |
| Verticillium dahliae | see Reusche et al., 2014 | isolate JR2 | |
| Verticillium longisporum | Zeise and von Tiedemann, 2002 | strain Vl43 |
References
- Mendes, R., Garbeva, P., Raaijmakers, J. M. The rhizosphere microbiome: significance of plant beneficial, plant pathogenic, and human pathogenic microorganisms. FEMS Microbiology Review. 37 (5), 634-663 (2013).
- Yadeta, K. A., Thomma, B. P. H. J. The xylem as battleground for plant hosts and vascular wilt pathogens. Frontiers in Plant Science. 4, 97 (2013).
- Delgado-Baquerizo, M., et al. The proportion of soil-borne pathogens increases with warming at the global scale. Nature Climate Change. 10 (6), 550-554 (2020).
- Berendsen, R. L., et al. Disease-induced assemblage of a plant-beneficial bacterial consortium. The ISME Journal. 12 (6), 1496-1507 (2018).
- Yuan, J., et al. Root exudates drive the soil-borne legacy of aboveground pathogen infection. Microbiome. 6 (1), 156 (2018).
- Liu, H., et al. Evidence for the plant recruitment of beneficial microbes to suppress soil-borne pathogens. New Phytologist. 229 (5), 2873-2885 (2021).
- Wang, H., Liu, R., You, M. P., Barbetti, M. J., Chen, Y. Pathogen biocontrol using plant growth-promoting bacteria (PGPR): role of bacterial diversity. Microorganisms. 9 (9), 1988 (2021).
- Inderbitzin, P., Subbarao, K. V. Verticillium systematics and evolution: how confusion impedes Verticillium wilt management and how to resolve it. Phytopathology. 104 (6), 564-574 (2014).
- Eynck, C., Koopmann, B., Grunewaldt-Stoecker, G., Karlowsky, P., von Tiedemann, A. Differential interactions of Verticillium longisporum und V. dahliae with Brassica napus with molecular and histological techniques. European Journal of Plant Pathology. 118 (3), 259-274 (2007).
- Floerl, S., et al. Defence reactions in the apoplastic proteome of oilseed rape (Brassica napus var. napus) attenuate Verticillium longisporum growth but not disease symptoms. BMC Plant Biology. 8, 129 (2008).
- Leonard, M., et al. Verticillium longisporum elicits media-dependent secretome responses with capacity to distinguish between plant-related environments. Frontiers in Microbiology. 11, 1876 (2020).
- Depotter, J. R. L., et al. Verticillium longisporum, the invisible threat to oilseed rape and other brassicaceous plant hosts. Molecular Plant Pathology. 17 (7), 1004-1016 (2016).
- Fröschel, C., et al. A gain-of-function screen reveals redundant ERF transcription factors providing opportunities for resistance breeding toward the vascular fungal pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 32 (9), 1095-1109 (2019).
- Zhou, L., Hu, Q., Johansson, A., Dixelius, C. Verticillium longisporum and V. dahliae: infection and disease in Brassica napus. Plant Pathology. 55 (1), 137-144 (2006).
- Ralhan, A., et al. The vascular pathogen Verticillium longisporum requires a jasmonic acid-independent COI1 function in roots to elicit disease symptoms in Arabidopsis shoots. Plant Physiology. 159 (3), 1192-1203 (2012).
- Reusche, M., et al. Stabilization of cytokinin levels enhances Arabidopsis resistance against Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 850-860 (2013).
- Iven, T., et al. Transcriptional activation and production of tryptophan-derived secondary metabolites in Arabidopsis roots contributes to the defense against the fungal vascular pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant. 5 (6), 1389-1402 (2012).
- Reusche, M., et al. Infections with the vascular pathogens Verticillium longisporum and Verticillium dahliae induce distinct disease symptoms and differentially affect drought stress tolerance of Arabidopsis thaliana. Environmental and Experimental Botany. 108, 23-37 (2014).
- Fröschel, C. In-depth evaluation of root infection systems using the vascular fungus Verticillium longisporum as soil-borne model pathogen. Plant Methods. 17 (1), 57 (2021).
- Karapapa, V. K., Bainbridge, B. W., Heale, J. B. Morphological and molecular characterization of Verticillium longisporum comb, nov., pathogenic to oilseed rape. Mycological Research. 101 (11), 1281-1294 (1997).
- Poncini, L., et al. In roots of Arabidopsis thaliana, the damage-associated molecular pattern AtPep1 is a stronger elicitor of immune signalling than flg22 or the chitin heptamer. PLoS One. 12 (10), 1-21 (2017).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Fradin, E. F., et al. Genetic dissection of Verticillium wilt resistance mediated by tomato Ve1. Plant Physiology. 150 (1), 320-332 (2009).
- Singh, S., et al. The plant host Brassica napus induces in the pathogen Verticillium longisporum the expression of functional catalase peroxidase which is required for the late phase of disease. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (4), 569-581 (2012).
- Zeise, K., von Tiedemann, A. Application of RAPD-PCR for virulence type analysis within Verticillium dahliae and Verticillium longisporum. Journal of Phytopathology. 150 (10), 557-563 (2002).
- Fröschel, C., et al. Plant roots employ cell-layer-specific programs to respond to pathogenic and beneficial microbes. Cell Host & Microbe. 29 (2), 299-310 (2021).
- Gigolashvili, T., et al. The transcription factor HIG1/MYB51 regulates indolic glucosinolate biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 50 (5), 886-901 (2007).
- Back, M. A., Haydock, P. P. J., Jenkinson, P. Disease complexes involving plant parasitic nematodes and soilborne pathogens. Plant Pathology. 51 (6), 683-697 (2002).
- Behrens, F. H., et al. Suppression of abscisic acid biosynthesis at the early infection stage of Verticillium longisporum in oilseed rape (Brassica napus). Molecular Plant Pathology. 20 (12), 1645-1661 (2019).
- Vorholt, J. A., Vogel, C., Carlström, C. I., Müller, D. B. Establishing causality: opportunities of synthetic communities for plant microbiome research. Cell Host & Microbe. 22 (2), 142-155 (2017).
