Inentingsstrategieën om plantenwortels te infecteren met door de bodem overgedragen micro-organismen
Summary
Dit protocol presenteert een gedetailleerde samenvatting van strategieën om plantenwortels te enten met bodemmicroben. Voor de schimmels Verticillium longisporum en Verticillium dahliae worden drie verschillende wortelinfectiesystemen beschreven. Mogelijke toepassingen en mogelijke downstream analyses worden belicht en voor- of nadelen worden per systeem besproken.
Abstract
De rhizosfeer herbergt een zeer complexe microbiële gemeenschap waarin plantenwortels voortdurend worden uitgedaagd. Wortels staan in nauw contact met een grote verscheidenheid aan micro-organismen, maar studies naar bodemgedragen interacties lopen nog steeds achter op die op bovengrondse organen. Hoewel sommige inentingsstrategieën voor het infecteren van modelplanten met modelwortelpathogenen in de literatuur worden beschreven, blijft het moeilijk om een uitgebreid methodologisch overzicht te krijgen. Om dit probleem aan te pakken, worden precies drie verschillende wortelinentingssystemen beschreven die kunnen worden toegepast om inzicht te krijgen in de biologie van wortel-microbe interacties. Ter illustratie werden Verticillium-soorten (namelijk V. longisporum en V. dahliae) gebruikt als wortelindringende modelpathogenen. De methoden kunnen echter gemakkelijk worden aangepast aan andere wortelkoloniserende microben – zowel pathogeen als gunstig. Door het xyleem van de plant te koloniseren, vertonen vasculaire bodemschimmels zoals Verticillium spp. een unieke levensstijl. Na wortelinvasie verspreiden ze zich acropetaal via de xyleemvaten, bereiken ze de scheut en veroorzaken ze ziektesymptomen. Drie representatieve plantensoorten werden gekozen als modelgastheren: Arabidopsis thaliana, economisch belangrijk koolzaad (Brassica napus) en tomaat (Solanum lycopersicum). Stap-voor-stap protocollen worden gegeven. Representatieve resultaten van pathogeniciteitstests, transcriptionele analyses van markergenen en onafhankelijke bevestigingen door reporterconstructen worden getoond. Verder komen de voor- en nadelen van elk inentingssysteem uitgebreid aan bod. Deze bewezen protocollen kunnen helpen bij het bieden van benaderingen voor onderzoeksvragen over wortel-microbe interacties. Weten hoe planten omgaan met microben in de bodem is cruciaal voor het ontwikkelen van nieuwe strategieën om de landbouw te verbeteren.
Introduction
Natuurlijke bodems worden bewoond door een verbazingwekkend aantal microben die neutraal, schadelijk of gunstig kunnen zijn voor planten1. Veel plantpathogenen worden door de grond gedragen, omringen de wortels en vallen het ondergrondse orgaan aan. Deze micro-organismen behoren tot een grote verscheidenheid aan clades: schimmels, oomyceten, bacteriën, nematoden, insecten en sommige virussen 1,2. Zodra de omgevingsomstandigheden infectie bevorderen, zullen gevoelige planten ziek worden en de gewasopbrengsten afnemen. De effecten van klimaatverandering, zoals de opwarming van de aarde en weersextremen, zullen het aandeel van door de bodem overgedragen plantpathogenen vergroten3. Daarom zal het steeds belangrijker worden om deze destructieve microben en hun impact op de voedsel- en diervoederproductie, maar ook op natuurlijke ecosystemen te bestuderen. Bovendien zijn er microbiële mutualisten in de bodem die nauw interageren met wortels en de groei, ontwikkeling en immuniteit van planten bevorderen. Wanneer ze geconfronteerd worden met ziekteverwekkers, kunnen planten actief specifieke tegenstanders in de rhizosfeer rekruteren die de overleving van de gastheer kunnen ondersteunen door pathogenente onderdrukken 4,5,6,7. Mechanistische details en routes die betrokken zijn bij gunstige wortel-microbe interacties zijn echter vaak nog onbekend6.
Het is daarom essentieel om het algemene begrip van wortel-microbe interacties uit te breiden. Betrouwbare methoden voor het inenten van wortels met bodemgebonden micro-organismen zijn nodig om modelstudies uit te voeren en de bevindingen over te brengen naar landbouwtoepassingen. Gunstige interacties in de bodem worden bijvoorbeeld bestudeerd met Serendipita indica (voorheen bekend als Piriformospora indica), stikstofbindende Rhizobium spp., of mycorrhizaschimmels, terwijl bekende bodemgedragen plantpathogenen Ralstonia solanacearum, Phytophthora spp., Fusarium spp. en Verticillium spp.1 omvatten. De laatste twee zijn schimmelgeslachten die wereldwijd verspreid zijn en vaatziekten veroorzaken2. Verticillium spp. (Ascomycota) kan honderden plantensoorten infecteren – grotendeels tweezaadlobbigen, waaronder kruidachtige eenjarigen, houtachtige vaste planten en veel gewasplanten 2,8. Schimmeldraden van Verticillium komen de wortel binnen en groeien zowel intercellulair als intracellulair naar de centrale cilinder om de xyleemvaten te koloniseren 2,9. In deze vaten blijft de schimmel het grootste deel van zijn levenscyclus. Omdat het xyleemsap voedselarm is en plantaardige afweermiddelen bevat, moet de schimmel zich aanpassen aan deze unieke omgeving. Dit wordt bereikt door de afscheiding van kolonisatie-gerelateerde eiwitten die de ziekteverwekker in staat stellen om te overleven in zijn gastheer10,11. Na het bereiken van de wortelvasculatuur kan de schimmel zich acropetaal in de xyleemvaten verspreiden naar het gebladerte, wat leidt tot systemische kolonisatie van de gastheer 9,12. Op dit punt wordt de plant negatief beïnvloed in de groei 9,10,13. Zo komen groeiachterstand en gele bladeren voor, evenals voortijdige senescentie 13,14,15,16.
Een lid van dit geslacht is Verticillium longisporum, dat sterk is aangepast aan brassicaceous gastheren, zoals het agronomisch belangrijke koolzaad, bloemkool en de modelplant Arabidopsis thaliana12. Verschillende studies combineerden V. longisporum en A. thaliana om uitgebreide inzichten te krijgen in door de bodem overgedragen vaatziekten en de resulterende wortelafweerreacties 13,15,16,17. Eenvoudige gevoeligheidstests kunnen worden gerealiseerd met behulp van het V. longisporum / A. thaliana-modelsysteem en er zijn gevestigde genetische bronnen beschikbaar voor beide organismen. Nauw verwant aan V. longisporum is de ziekteverwekker Verticillium dahliae. Hoewel beide schimmelsoorten een vergelijkbaar vasculair levensstijl- en invasieproces uitvoeren, zijn hun voortplantingsefficiëntie van wortels tot bladeren en de uitgelokte ziektesymptomen bij A. thaliana verschillend: terwijl V. longisporum meestal vroege veroudering induceert, resulteert V. dahliae-infectie in verwelking18. Onlangs presenteerde een methodologische samenvatting verschillende wortelinentingsstrategieën voor het infecteren van A. thaliana met V. longisporum of V. dahliae, wat hielp bij het plannen van experimentele opstellingen19. In het veld veroorzaakt V. longisporum af en toe aanzienlijke schade bij de productie van koolzaad12, terwijl V. dahliae een zeer breed gastheerbereik heeft dat bestaat uit verschillende gekweekte soorten, zoals wijnstok, aardappel en tomaat8. Dit maakt beide pathogenen economisch interessante modellen om te bestuderen.
De volgende protocollen gebruiken dus zowel V. longisporum als V. dahliae als modelwortelpathogenen om mogelijke benaderingen voor wortelinentingen te illustreren. Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), koolzaad (Brassica napus) en tomaat (Solanum lycopersicum) werden gekozen als model gastheren. Gedetailleerde beschrijvingen van de methodologieën zijn te vinden in de onderstaande tekst en de bijbehorende video. Voor- en nadelen voor elk inentingssysteem worden besproken. Al met al kan deze protocolverzameling helpen om een geschikte methode te vinden voor specifieke onderzoeksvragen in de context van wortel-microbe interacties.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vanwege de enorme opbrengstverliezen veroorzaakt door fytopathogenen in de bodem1, is een verbetering van landbouwstrategieën of gewasvariëteiten vereist. Het beperkte inzicht in de pathogenese van bodemziekten belemmert de ontwikkeling van resistentere planten. Onderliggende pathomechanismen moeten worden onderzocht, waarvoor een robuust methodologisch platform nodig is. Gerapporteerde inentingsprocedures hebben aangetoond dat multifactoriële gebeurtenissen in wortel-microbe interacties goed k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen Tim Iven en Jaqueline Komorek voor eerder werk aan deze methoden, de groep van Wolfgang Dröge-Laser (Afdeling Farmaceutische Biologie, Universiteit van Würzburg, Duitsland) voor het leveren van de apparatuur en de middelen die nodig zijn voor dit werk, en Wolfgang Dröge-Laser evenals Philipp Kreisz (beide Universiteit van Würzburg) voor kritische proeflezing van het manuscript. Deze studie werd ondersteund door de “Deutsche Forschungsgemeinschaft” (DFG, DR273/15-1,2).
Materials
| Agar (Gelrite) | Carl Roth | Nr. 0039 | all systems described require Gelrite |
| Arabidopsis thaliana wild-type | NASC stock | Col-0 (N1092) | |
| Autoclave | Systec | VE-100 | |
| BlattFlaeche | Datinf GmbH | BlattFlaeche | software to determine leaf areas |
| Brassica napus wild-type | see Floerl et al., 2008 | rapid-cycling rape | genome ACaacc |
| Cefotaxime sodium | Duchefa | C0111 | |
| Chicanery flask 500 mL | Duran Group / neoLab | E-1090 | Erlenmeyer flask with four baffles |
| Collection tubes 50 mL | Sarstedt | 62.547.254 | 114 x 28 mm |
| Czapek Dextrose Broth medium | Duchefa | C1714 | |
| Digital camera | Nikon | D3100 18-55 VR | |
| Exsiccator (Desiccator ) | Duran Group | 200 DN, 5.8 L | Seal with lid to hold chlorine gas |
| Fluorescence Microscope | Leica | Leica TCS SP5 II | |
| HCl | Carl Roth | P074.3 | |
| KNO3 | Carl Roth | P021.1 | ≥ 99 % |
| KOH | Carl Roth | 6751 | |
| Leukopor | BSN medical GmbH | 2454-00 AP | non-woven tape 2.5 cm x 9.2 m |
| MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) | Carl Roth | 4256.2 | Pufferan ≥ 99 % |
| MgSO4 | Carl Roth | T888.1 | Magnesiumsulfate-Heptahydrate |
| Murashige & Skoog medium (MS) | Duchefa | M0222 | MS including vitamins |
| NaClO | Carl Roth | 9062.1 | |
| Percival growth chambers | CLF Plant Climatics GmbH | AR-66L2 | |
| Petri-dishes | Sarstedt | 82.1473.001 | size ØxH: 92 × 16 mm |
| Plastic cups (500 mL, transparent) | Pro-pac, salad boxx | 5070 | size: 108 × 81 × 102 mm |
| Pleated cellulose filter | Hartenstein | FF12 | particle retention level 8–12 μm |
| poly klima growth chamber | poly klima GmbH | PK 520 WLED | |
| Potato Dextrose Broth medium | SIGMA Aldrich | P6685 | for microbiology |
| Pots | Pöppelmann GmbH | TO 7 D or TO 9,5 D | Ø 7 cm resp. Ø 9.5 cm |
| PromMYB51::YFP | see Poncini et al., 2017 | MYB51 reporter line | YFP (i.e. 3xmVenus with NLS) |
| Reaction tubes 2 mL | Sarstedt | 72.695.400 | PCR Performance tested |
| Rotary (orbital) shaker | Edmund Bühler | SM 30 C control | |
| Sand (bird sand) | Pet Bistro, Müller Holding | 786157 | |
| Soil | Einheitserde spezial | SP Pikier (SP ED 63 P) | |
| Solanum lycopersicum wild-type | see Chavarro-Carrero et al., 2021 | Type: Moneymaker | |
| Thoma cell counting chamber | Marienfeld | 642710 | depth 0.020 mm; 0.0025 mm2 |
| Ultrapure water (Milli-Q purified water) | MERK | IQ 7003/7005 | water obtained after purification |
| Verticillium dahliae | see Reusche et al., 2014 | isolate JR2 | |
| Verticillium longisporum | Zeise and von Tiedemann, 2002 | strain Vl43 |
References
- Mendes, R., Garbeva, P., Raaijmakers, J. M. The rhizosphere microbiome: significance of plant beneficial, plant pathogenic, and human pathogenic microorganisms. FEMS Microbiology Review. 37 (5), 634-663 (2013).
- Yadeta, K. A., Thomma, B. P. H. J. The xylem as battleground for plant hosts and vascular wilt pathogens. Frontiers in Plant Science. 4, 97 (2013).
- Delgado-Baquerizo, M., et al. The proportion of soil-borne pathogens increases with warming at the global scale. Nature Climate Change. 10 (6), 550-554 (2020).
- Berendsen, R. L., et al. Disease-induced assemblage of a plant-beneficial bacterial consortium. The ISME Journal. 12 (6), 1496-1507 (2018).
- Yuan, J., et al. Root exudates drive the soil-borne legacy of aboveground pathogen infection. Microbiome. 6 (1), 156 (2018).
- Liu, H., et al. Evidence for the plant recruitment of beneficial microbes to suppress soil-borne pathogens. New Phytologist. 229 (5), 2873-2885 (2021).
- Wang, H., Liu, R., You, M. P., Barbetti, M. J., Chen, Y. Pathogen biocontrol using plant growth-promoting bacteria (PGPR): role of bacterial diversity. Microorganisms. 9 (9), 1988 (2021).
- Inderbitzin, P., Subbarao, K. V. Verticillium systematics and evolution: how confusion impedes Verticillium wilt management and how to resolve it. Phytopathology. 104 (6), 564-574 (2014).
- Eynck, C., Koopmann, B., Grunewaldt-Stoecker, G., Karlowsky, P., von Tiedemann, A. Differential interactions of Verticillium longisporum und V. dahliae with Brassica napus with molecular and histological techniques. European Journal of Plant Pathology. 118 (3), 259-274 (2007).
- Floerl, S., et al. Defence reactions in the apoplastic proteome of oilseed rape (Brassica napus var. napus) attenuate Verticillium longisporum growth but not disease symptoms. BMC Plant Biology. 8, 129 (2008).
- Leonard, M., et al. Verticillium longisporum elicits media-dependent secretome responses with capacity to distinguish between plant-related environments. Frontiers in Microbiology. 11, 1876 (2020).
- Depotter, J. R. L., et al. Verticillium longisporum, the invisible threat to oilseed rape and other brassicaceous plant hosts. Molecular Plant Pathology. 17 (7), 1004-1016 (2016).
- Fröschel, C., et al. A gain-of-function screen reveals redundant ERF transcription factors providing opportunities for resistance breeding toward the vascular fungal pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 32 (9), 1095-1109 (2019).
- Zhou, L., Hu, Q., Johansson, A., Dixelius, C. Verticillium longisporum and V. dahliae: infection and disease in Brassica napus. Plant Pathology. 55 (1), 137-144 (2006).
- Ralhan, A., et al. The vascular pathogen Verticillium longisporum requires a jasmonic acid-independent COI1 function in roots to elicit disease symptoms in Arabidopsis shoots. Plant Physiology. 159 (3), 1192-1203 (2012).
- Reusche, M., et al. Stabilization of cytokinin levels enhances Arabidopsis resistance against Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 850-860 (2013).
- Iven, T., et al. Transcriptional activation and production of tryptophan-derived secondary metabolites in Arabidopsis roots contributes to the defense against the fungal vascular pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant. 5 (6), 1389-1402 (2012).
- Reusche, M., et al. Infections with the vascular pathogens Verticillium longisporum and Verticillium dahliae induce distinct disease symptoms and differentially affect drought stress tolerance of Arabidopsis thaliana. Environmental and Experimental Botany. 108, 23-37 (2014).
- Fröschel, C. In-depth evaluation of root infection systems using the vascular fungus Verticillium longisporum as soil-borne model pathogen. Plant Methods. 17 (1), 57 (2021).
- Karapapa, V. K., Bainbridge, B. W., Heale, J. B. Morphological and molecular characterization of Verticillium longisporum comb, nov., pathogenic to oilseed rape. Mycological Research. 101 (11), 1281-1294 (1997).
- Poncini, L., et al. In roots of Arabidopsis thaliana, the damage-associated molecular pattern AtPep1 is a stronger elicitor of immune signalling than flg22 or the chitin heptamer. PLoS One. 12 (10), 1-21 (2017).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Fradin, E. F., et al. Genetic dissection of Verticillium wilt resistance mediated by tomato Ve1. Plant Physiology. 150 (1), 320-332 (2009).
- Singh, S., et al. The plant host Brassica napus induces in the pathogen Verticillium longisporum the expression of functional catalase peroxidase which is required for the late phase of disease. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (4), 569-581 (2012).
- Zeise, K., von Tiedemann, A. Application of RAPD-PCR for virulence type analysis within Verticillium dahliae and Verticillium longisporum. Journal of Phytopathology. 150 (10), 557-563 (2002).
- Fröschel, C., et al. Plant roots employ cell-layer-specific programs to respond to pathogenic and beneficial microbes. Cell Host & Microbe. 29 (2), 299-310 (2021).
- Gigolashvili, T., et al. The transcription factor HIG1/MYB51 regulates indolic glucosinolate biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 50 (5), 886-901 (2007).
- Back, M. A., Haydock, P. P. J., Jenkinson, P. Disease complexes involving plant parasitic nematodes and soilborne pathogens. Plant Pathology. 51 (6), 683-697 (2002).
- Behrens, F. H., et al. Suppression of abscisic acid biosynthesis at the early infection stage of Verticillium longisporum in oilseed rape (Brassica napus). Molecular Plant Pathology. 20 (12), 1645-1661 (2019).
- Vorholt, J. A., Vogel, C., Carlström, C. I., Müller, D. B. Establishing causality: opportunities of synthetic communities for plant microbiome research. Cell Host & Microbe. 22 (2), 142-155 (2017).
