الكي الكامل الدائرة للضفيرة الوعائية الداكنة حول القزحية للزرق المستحث جراحيا في القوارض
Summary
الهدف من هذا البروتوكول هو توصيف نموذج جديد للتنكس العصبي الزرق على أساس الكي الحراري 360 درجة للضفيرة الوعائية الحوفية ، مما يؤدي إلى ارتفاع ضغط الدم العيني تحت الحاد.
Abstract
الجلوكوما ، السبب الرئيسي الثاني للعمى في جميع أنحاء العالم ، هو مجموعة غير متجانسة من اضطرابات العين التي تتميز بتلف هيكلي في العصب البصري وتنكس خلايا العقدة الشبكية (RGC) ، مما يؤدي إلى خلل بصري عن طريق مقاطعة نقل المعلومات البصرية من العين إلى الدماغ. ارتفاع ضغط العين هو عامل الخطر الأكثر أهمية. وهكذا ، تم تطوير عدة نماذج من ارتفاع ضغط الدم في العين في القوارض إما من خلال الأساليب الجينية أو التجريبية للتحقيق في أسباب وآثار المرض. من بين هؤلاء ، تم الإبلاغ عن بعض القيود مثل الغزو الجراحي ، والتقييم الوظيفي غير الكافي ، ومتطلبات التدريب المكثف ، والامتداد المتغير للغاية لتلف الشبكية. يميز العمل الحالي طريقة بسيطة ومنخفضة التكلفة وفعالة للحث على ارتفاع ضغط الدم العيني في القوارض ، بناء على الكي في درجة حرارة منخفضة ودائرة كاملة للضفيرة الوعائية الحوفية ، وهو مكون رئيسي لتصريف الخلط المائي. يوفر النموذج الجديد ارتفاع ضغط الدم تحت الحاد سهل تقنيا وغير جراحي وقابل للتكرار ، ويرتبط ب RGC التدريجي وتنكس العصب البصري ، ومعدل استرداد سريري فريد بعد الجراحة يسمح بإجراء دراسات وظيفية في الجسم الحي من خلال كل من الطرق الفيزيولوجية الكهربية والسلوكية.
Introduction
تفهم الأدبيات الطبية الجلوكوما على أنها مجموعة غير متجانسة من اعتلالات الأعصاب البصرية التي تتميز بالتنكس التدريجي لخلايا العقدة الشبكية (RGCs) ، والتشعبات ، والسوما ، والمحاور العصبية ، مما يؤدي إلى الحجامة الهيكلية (الحفر) للقرص البصري والتدهور الوظيفي للعصب البصري ، مما يؤدي إلى الإصابة في الحالات غير المنضبطة عن طريق مقاطعة نقل المعلومات البصرية من العين إلى الدماغ1. الجلوكوما هو حاليا السبب الأكثر شيوعا للعمى الذي لا رجعة فيه في جميع أنحاء العالم ، ومن المتوقع أن يصل إلى ما يقرب من 111.8 مليون شخص فيعام 2040 2 ، مما يؤثر بعمق على نوعية حياة المرضى (QoL) ويؤدي إلى مخاوف اجتماعية واقتصادية كبيرة3.
ارتفاع ضغط العين (IOP) هو واحد من أهم عوامل الخطر القابلة للتعديل والوحيدة لتطوير وتطور الجلوكوما. من بين الأنواع المتعددة من الجلوكوما ، ترتبط جميعها ، باستثناء الجلوكوما التوتر الطبيعي (NTG) ، بارتفاع IOP في وقت ما في التاريخ السريري للمرض. على الرغم من التقدم السريري والجراحي الملحوظ لاستهداف IOP وإبطاء أو إيقاف تطور المرض ، لا يزال المرضى يفقدون البصر بسبب الجلوكوما 4,5. لذلك ، فإن الفهم الشامل للفيزيولوجيا المرضية المعقدة والمتعددة العوامل لهذا المرض أمر حتمي لتطوير علاجات أكثر فعالية ، خاصة لتوفير الحماية العصبية ل RGCs.
من بين مجموعة متنوعة من الأساليب التجريبية لفهم آليات المرض ، تشبه النماذج الحيوانية القائمة على ارتفاع ضغط الدم العيني (OHT) إلى حد كبير الجلوكوما البشرية. تعتبر نماذج القوارض مفيدة بشكل خاص لأنها منخفضة التكلفة ، ويسهل التعامل معها ، ويمكن التلاعب بها وراثيا ، ولها عمر قصير ، وتقدم ميزات تشريحية وفسيولوجية للعين مماثلة للبشر ، مثل إنتاج الخلط المائي والصرف6،7،8،9،10،11،12،13. تشمل النماذج المستخدمة حاليا تصلب الشبكة التربيقية بعد حقن محلول ملحي مفرط التوتر في الأوردة فوق الصلبة14 ، والحقن داخل الغرفة للميكروبيدات 15 أو المواد اللزجةالمرنة 16 ، وكي الأوردة الدوامة 17 ، والتخثير الضوئي للشبكة التربيقية باستخدام ليزر الأرجون 18 ، والخيط المحيطي 19 ، واستخدام نموذج معدل وراثيا ل OHT المرتبط بالعمر (الفئران DBA / 2J) 8. ومع ذلك ، فإن الغزو ، وعتامة القرنية بعد الجراحة ، واضطراب الجزء الأمامي ، ومنحنيات التعلم الواسعة ، والمعدات باهظة الثمن ، و IOPs المتغيرة للغاية بعد العملية الجراحية ، هي من بين عدد قليل من المزالق المبلغ عنها المرتبطة بالنماذج الحالية ، مما يجعل تطوير نموذج بديل ل OHT طلبا للتغلب على هذه المشاكل20،21،22.
يضفي البروتوكول الحالي الطابع الرسمي على إجراء جراحي جديد للحث على OHT كوكيل للجلوكوما ، بناء على كي الضفيرة الحوفي (LPC) في القوارض23. هذا نموذج سهل وقابل للتكرار ويمكن الوصول إليه وغير جراحي يوفر كفاءة عالية وتقلبا منخفضا لارتفاع IOP ، ويرتبط بمعدل مرتفع بشكل فريد من التعافي السريري الكامل ، وبالتالي يوفر تقييما وظيفيا في الجسم الحي في عدد أقل من الحيوانات المستخدمة في كل تجربة. تحفز تقنية الجراحة OHT تحت الحاد مع العودة التدريجية إلى مستويات خط الأساس في غضون أيام قليلة ، والتي تمثل هجوم ارتفاع ضغط الدم الذي يظهر في الجلوكوما الحادة ذات الزاوية المغلقة. علاوة على ذلك ، يتبع انتعاش IOP في النموذج تنكس عصبي مستمر للزرق ، وهو أمر مفيد للدراسات الميكانيكية المستقبلية للانحطاط الثانوي ل RGCs ، والذي يحدث في العديد من حالات الجلوكوما البشرية على الرغم من التحكم الكافي في IOP.
Protocol
Representative Results
Discussion
الكي الضفيرة القزحية (LPC) هو نموذج جديد لما بعد التربيق مع ميزة أنه يستهدف الهياكل الوعائية التي يمكن الوصول إليها بسهولة والتي لا تتطلب تشريح الملتحمة أو الوتر17,28. بشكل مختلف عن نموذج الكي في الأوردة الدوامة ، وهو نموذج OHT مشهور يعتمد على الضعف الجراحي للتصر…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نعترف بفنيي المختبرات لدينا خوسيه. نيلسون دوس سانتوس ، دايان ماندرينو توريس ، خوسيه فرانسيسكو تيبورسيو ، جيلدو بريتو دي سوزا ، ولوتشيانو كافالكانتي فيريرا. تم تمويل هذا البحث من قبل FAPERJ و CNPq و CAPES.
Materials
| Acetone | Isofar | 201 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Active electrode for electroretinography | Hansol Medical Co | – | Stainless steel needle 0.25 mm × 15 mm |
| Anestalcon | Novartis Biociências S/A | MS-1.0068.1087 | Proxymetacaine hydrochloride 0.5% |
| Calcium chloride | Vetec | 560 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Cautery Low Temp Fine Tip 10/bx | Bovie Medical Corporation | AA00 | Low-temperature ophthalmic cautery |
| Cetamin | Syntec do Brasil Ltda | 000200-3-000003 | Ketamine hydrochloride 10% |
| DAKO | Dako North America | S3023 | Antifade mounting medium |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 28718-90-3 | diamidino-2-phenylindole; blue fluorescent nuclear counterstain; emission at 452±3 nm |
| Ecofilm | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0298.0487 | Carmellose sodium 0.5% |
| EPON Resin | Polysciences, Inc. | – | Epoxy resin used for electron microscopy, composed of a mixture of four reagents: Poly/Bed 812 Resin (CAT#08791); DDSA – Dodecenylsuccinic Anhydride (CAT#00563); NMA – Nadic Methyl Anhydride (CAT#00886); DMP-30 – 2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol (CAT#00553) |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16110 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Hyabak | União Química Farmacêutica Nacional S/A | MS-8042140002 | Sodium hyaluronate 0.15% |
| Icare Tonolab | Icare Finland Oy | TV02 (model number) | Rebound handheld tonometer |
| IgG donkey anti-mouse antibody + Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A31570 | Secondary antibody solution |
| LCD monitor 23 inches | Samsung Electronics Co. Ltd. | S23B550 | Model LS23B550, for electroretinogram recording |
| LSM 510 Meta | Carl Zeiss | – | Confocal epifluorescence microscope |
| Maxiflox | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0298.0489 | Ciprofloxacin 3.5 mg/g |
| MEB-9400K | Nihon Kohden Corporation | – | System for electroretinogram recording |
| monoclonal IgG1 mouse anti-Brn3a | MilliporeSigma | MAB-1585 | Brn3a primary antibody solution |
| Neuropack Manager v08.33 | Nihon Kohden Corporation | – | Software for electroretinogram signal processing |
| Optomotry | CerebralMechanics | – | System for optomotor response analysis |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19100 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Potassium ferrocyanide | Electron Microscopy Sciences | 20150 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Reference and ground electrodes for electroretinography | Chalgren Enterprises | 110-63 | Stainless steel needles 0.4 mm × 37 mm |
| Sodium cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 12300 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Ster MD | União Química Farmacêutica Nacional S/A | MS-1.0497.1287 | Prednisolone acetate 0.12% |
| Terolac | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0497.1286 | Ketorolac trometamol 0.5% |
| Terramicina | Laboratórios Pfizer Ltda | MS-1.0216.0024 | Oxytetracycline hydrochloride 30 mg/g + polymyxin B 10,000 U/g |
| Tono-Pen XL | Reichert Technologies | 230635 | Digital applanation handheld tonometer |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher Scientific | T3605 | Far red-fluorescent nuclear counterstain; emission at 661 nm |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | Non-ionic surfactant |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Xilazin | Syntec do Brasil Ltda | 7899 | Xylazine hydrochloride 2% |
| Carl Zeiss | – | Stereo microscope for surgery and retinal dissection |
References
- Weinreb, R. N., Aung, T., Medeiros, F. A. The Pathophysiology and Treatment of Glaucoma A Review. JAMA. 311 (8), 1901-1911 (2014).
- Tham, Y. C., et al. Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: A systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).
- Quaranta, L., et al. Quality of Life in Glaucoma: A Review of the Literature. Advances in Therapy. 33 (6), 959-981 (2016).
- Heijl, A., et al. Reduction of intraocular pressure and glaucoma progression: results from the Early Manifest Glaucoma Trial. Archives of Ophthalmology. 120 (10), 1268-1279 (2002).
- Susanna, R., De Moraes, C. G., Cioffi, G. A., Ritch, R. Why Do People (Still) Go Blind from Glaucoma. Translational Vision Science & Technology. 4 (2), 1 (2015).
- Fujikawa, K., et al. VAV2 and VAV3 as candidate disease genes for spontaneous glaucoma in mice and humans. PLoS One. 5 (2), 9050 (2010).
- Mao, M., Hedberg-Buenz, A., Koehn, D., John, S. W., Anderson, M. G. Anterior segment dysgenesis and early-onset glaucoma in nee mice with mutation of Sh3pxd2b. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2679-2688 (2011).
- John, S. W., et al. Essential iris atrophy, pigment dispersion, and glaucoma in DBA/2J mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (6), 951-962 (1998).
- Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Ocular hypertension in mice with a targeted type I collagen mutation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (4), 1581-1585 (2003).
- Chou, T. H., Tomarev, S., Porciatti, V. Transgenic mice expressing mutated Tyr437His human myocilin develop progressive loss of retinal ganglion cell electrical responsiveness and axonopathy with normal iop. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (9), 5602-5609 (2014).
- vander Zypen, E. Experimental morphological study on structure and function of the filtration angel of the rat eye. Ophthalmologica. 174 (5), 285-298 (1977).
- Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Aqueous humor dynamics in mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (12), 5168-5173 (2003).
- Morrison, J. C., Fraunfelder, F. W., Milne, S. T., Moore, C. G. Limbal microvasculature of the rat eye. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 751-756 (1995).
- Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Experimental Eye Research. 64 (1), 85-96 (1997).
- Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: A paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (1), 207-216 (2010).
- Zhu, M. D., Cai, F. Y. Development of experimental chronic intraocular hypertension in the rabbit. Australian and New Zealand Journal of Ophthalmology. 20 (3), 225-234 (1992).
- Shareef, S. R., Garcia-Valenzuela, E., Salierno, A., Walsh, J., Sharma, S. C. Chronic ocular hypertension following episcleral venous occlusion in rats. Experimental Eye Research. 61 (3), 379-382 (1995).
- Levkovitch-Verbin, H., et al. Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43 (2), 402-410 (2002).
- Zhao, D., et al. Characterization of the Circumlimbal Suture Model of Chronic IOP Elevation in Mice and Assessment of Changes in Gene Expression of Stretch Sensitive Channels. Frontiers in Neuroscience. 11, (2017).
- Biswas, S., Wan, K. H. Review of rodent hypertensive glaucoma models. Acta Ophthalmologica. 97 (3), 331-340 (2019).
- Pitha, I., et al. Sustained Dorzolamide Release Prevents Axonal and Retinal Ganglion Cell Loss in a Rat Model of IOP-Glaucoma. Translational Vision Science & Technology. 7 (2), 13 (2018).
- Grozdanic, S. D., et al. Temporary elevation of the intraocular pressure by cauterization of vortex and episcleral veins in rats causes functional deficits in the retina and optic nerve. Experimental Eye Research. 77 (1), 27-33 (2003).
- Lani, R., et al. A subacute model of glaucoma based on limbal plexus cautery in pigmented rats. Scientific Reports. 9 (1), 16286 (2019).
- vander Merwe, E. L., Kidson, S. H. The three-dimensional organisation of the post-trabecular aqueous outflow pathway and limbal vasculature in the mouse. Experimental Eye Research. 125, 226-235 (2014).
- Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (12), 4611-4616 (2004).
- Sasovetz, D. Ketamine hydrochloride: an effective general anesthetic for use in electroretinography. Annals of Ophthalmology. 10 (11), 1510-1514 (1978).
- Stabio, M. E., et al. A novel map of the mouse eye for orienting retinal topography in anatomical space. The Journal of Comparative Neurology. 526 (11), 1749-1759 (2018).
- Blanco, R., et al. A Chronic Ocular-Hypertensive Rat Model induced by Injection of the Sclerosant Agent Polidocanol in the Aqueous Humor Outflow Pathway. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3209 (2019).
- Paranhos, A., Prata, J. A., de Mello, P. A., da Silva, F. A. Post-Trabecular Glaucomas with Elevated Episcleral Venous Pressure. Mechanisms of the Glaucomas. , 139-157 (2008).
- Ou, Y., Jo, R. E., Ullian, E. M., Wong, R. O. L., Della Santina, L. Selective Vulnerability of Specific Retinal Ganglion Cell Types and Synapses after Transient Ocular Hypertension. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of The Society for Neuroscience. 36 (35), 9240-9252 (2016).
