Nadir Kelebek Popülasyonlarının Tahribatsız Genetik Örneklemesini Yapmak için Topluluk Bilim Adamlarını Görevlendirmek
Summary
Burada, artık yumurta kalıntılarının sahada toplanmasına dayanan kelebek popülasyonlarının noninvaziv genetik örneklemesi için basit bir protokol sunuyoruz. Tür kimliğini doğrulamak ve genetik çeşitliliği ölçmek için kullanılabilir. Bu protokol, toplum bilimi katılımı için daha geniş gruplara kolayca uyarlanabilir.
Abstract
Küresel böcek düşüşleri hızlanmaya devam ediyor. Etkili genetik örnekleme, birçok taksonun anlaşılmasını ilerletmek ve mevcut bilgi boşluklarını gidermek için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, popülasyon genetik yapısı veya DNA barkodlama analizleri için nadir kelebekleri tahribatsız bir şekilde örneklemek için kanıtlanmış bir yöntemi temsil eder. Tür kimliğini doğrulamak ve genetik çeşitliliği ölçmek için başarılı gen dizilimi için yeterince yüksek miktarda ve kaliteli DNA elde etmek için yumurtadan çıkmış kelebek ovalarının koryonunu kullanır. Diğer doku örnekleme teknikleri pratik olmadığında veya kullanılamadığında özellikle yararlı olabilir. Bir lepidopteran için geliştirilmiş olsa da, yine de diğer böcek türleriyle kullanım için kolayca uyarlanabilir. Topluluk bilimcileri, koruma uygulayıcıları ve öğrenciler gibi farklı deneyim ve beceri seviyelerine sahip bireyler tarafından geniş uygulamayı en üst düzeye çıkarmaya yardımcı olmak ve geniş nüfus örneklemesini kolaylaştırmak için geniş coğrafi alanlarda kullanılmak üzere kullanım kolaylığı ile özel olarak tasarlanmıştır. Üretilen veriler, taksonomik ve listeleme kararlarını, koruma ve yönetim eylemlerini bilgilendirmeye ve temel ekolojik araştırmaları geliştirmeye yardımcı olabilir.
Introduction
Nadir, azalan ve / veya listelenen böcek taksonlarının etkili popülasyon genetik örneklemi, koruma ve yönetim eylemlerini bilgilendirmeye yardımcı olmak için genellikle kritik öneme sahiptir. Ölümcül veya zararlı doku örnekleme yöntemleri birçok genetik analiz için rutin olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, bu yöntemler istenmeyen veya izin verilmemektedir, çünkü savunmasız mevcut popülasyonlara zarar verebilir veya davranış ve zindeliği olumsuz yönde etkileyebilir. Tüm bacaklar, anten veya kanat kırpıntıları, larva eksüviya veya savunma sekresyonlarından ve frass gibi diğer ürünlerden hemolenf gibi dokuları içeren çeşitli ölümcül olmayan veya invaziv olmayan örnekleme teknikleri, böcek genetik araştırmaları için uygundur 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Bu çeşitli doku örnekleme tekniklerinin genel fizibilitesi ve uygulanabilirliği, odak organizmanın, durumun ve materyali toplayan bireylerin biyolojisine, ekolojisine, davranışına, boyutuna ve nadirliğine bağlı olarak önemli ölçüde değişir. Örneğin, tüm bacaklar veya ek kırpıntılar, tipik olarak deneyimli personel tarafından, uygun bir yaşam evresindeki birkaç kişinin geçici olarak yakalanmasını ve dikkatli bir şekilde kullanılmasını gerektirir. Benzer şekilde, larva eksüviae veya frass gibi doku kaynaklarının, organizmalar esaret altında veya yeterli bir süre geçici olarak tutulduklarında pratik olmaları muhtemeldir.
Potansiyel taksonomik farklılaşma veya genetik yapı ile ilgili olanlar gibi popülasyon düzeyinde sorulan araştırma soruları için, daha geniş bir zamansal veya coğrafi ölçekte (yani, bölgesel veya kıtasal) örnekleme genellikle gereklidir. Sonuç olarak, bazı invaziv olmayan doku kaynakları tamamen pratik olmayabilir veya en azından miktar olarak toplanması verimsiz olabilir. Bu ölçeklerde numune toplama, bireysel araştırmacılar veya hatta daha küçük saha ekipleri için lojistik veya finansal olarak pratik olmayabilir veya engelleyici olabilir. Topluluk bilim adamlarının doğrudan katılımı, bu zorlukların çoğunun ele alınmasına ve büyük veri odaklı toplamanın hızlandırılmasına yardımcı olmak için araştırma topluluğu tarafından giderek daha fazla benimsenmiş olsa da, tahribatsız, invaziv olmayan veya eDNA örneklemesi 10,11,12’yi içeren çalışmalar için benimseme sınırlandırılmıştır.
Bu potansiyel sınırlamaların bazılarının üstesinden gelmeye yardımcı olmak için, yumurtadan çıkmış kelebek ovasından elde edilen koryonun, tür kimliğini doğrulamak ve genetik çeşitliliği ölçmek için başarılı gen dizilimi için yeterince yüksek miktarda ve kalitede DNA üretebileceğini gösterdik. Daha sonra bu tekniği kullanarak çeşitli toplama protokollerini test ettik13. Bu pilot çalışma, daha fazla metodolojik iyileştirme için temel oluşturdu. Bu makale, topluluk bilimcileri ve diğer uzman olmayan personel için ortaya çıkan basit ama kapsamlı revize edilmiş saha toplama protokolünü ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Bu protokol, gelecekteki koruma eylemlerini bilgilendirmeye yardımcı olmak için buzlu elfin kelebeğinin (Callophrys irus) geniş bir popülasyon yapısı analizinin ve ABD Nesli Tükenmekte Olan Türler Yasası kapsamında muhtemelen listelenmenin federal bir kararının bir parçasıdır. Bazı invaziv olmayan yöntemlerden potansiyel olarak daha fazla emek yoğun olmasına rağmen, gerekli organizma temasının olmaması ve kullanım kolaylığı, onu hem yaygın böceklerin hem de koruma kaygısı olanların bir seçimini hedefleyen diğer popülasyon genetik araştırma programlarına uygulanabilecek potansiyel olarak uygulanabilir bir model haline getirmektedir. Burada sunulan protokol dili, özellikle Lycaenidae familyasındaki kelebekler için ve burada topluluk bilimcileri veya sınırlı entomolojik deneyime sahip diğer bireyler (örneğin, ajans biyologları, stajyerler) olarak tanımlanan uzman olmayanlar tarafından kullanılmak üzere geliştirilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, popülasyon genetik yapısı veya DNA barkodlama analizleri için nadir kelebekleri tahribatsız bir şekilde örneklemek için bir alan yöntemini açıklamaktadır. Bu protokolün genel faydaları, topluluk bilimcileri, koruma uygulayıcıları ve öğrenciler gibi farklı deneyim ve beceri seviyelerine sahip bireyler tarafından geniş uygulamayı en üst düzeye çıkarmaya yardımcı olmak için özel olarak tasarlanmıştır. Bunlar arasında nispeten düşük genel maliyet, edinilmesi kolay sarf malzemeleri ve ekipman, çok sayıda aşırı karmaşık adım olmadan basit ve ulaşılabilir bir yöntem ve geniş bir coğrafi alanda kolay dağıtım yer almaktadır. Ek olarak, geçici olarak yakalama veya manipüle etme ihtiyacını ortadan kaldıran ve bu süreçte genetik örnekler elde etmek için canlı organizmalara potansiyel olarak zarar veren artık organik materyali hedefler. Ayrıca, numune toplama için mevcut potansiyel süreyi geleneksel fenolojinin veya belirli bir yaşam aşamasının ömrünün ötesine uzatarak, numune sayılarını en üst düzeye çıkarmaya yardımcı olmak için esnekliği ve genel toplama fırsatını arttırır.
Bu çabanın odak taksonu, yaygın fakat azalan bir habitat uzmanı olan buzlu elfin kelebeği iken, bu protokol, koruma kaygısı da dahil olmak üzere diğer birçok böceğe daha geniş bir şekilde uygulanabilir. Benzer şekilde, protokol genetik materyalin kaynağı olarak yumurtadan çıkmış yumurtaların toplanmasını hedeflerken, potansiyel olarak daha geleneksel olan diğer örneklere (örneğin, bacaklar, kanat parçaları, anten klipsleri) ve hatta tüm organizmalara kolayca uyarlanabilir. Bununla birlikte, bu yön aynı zamanda protokolün potansiyel bir sınırlamasıdır. Adımların büyük çoğunluğu nispeten basit ve hızlı bir şekilde gerçekleştirilecek şekilde tasarlanmış olsa da, larva konakçı bitkilerin yamalarını, bireysel olarak tipik olarak <1.0 mm çapında olan kuluçkalık yumurtalar için kapsamlı bir şekilde araştırmak zaman ve emek yoğundur. Bununla birlikte, bu tür kapsamlı örnekleme aktivitesi, toplum bilimcileri gibi daha geniş bir katılımcı ağı için özellikle idealdir.
Diğer saha bazlı projelerde olduğu gibi, dikkatli bir hazırlık şarttır. Bu, hiçbir öğenin eksik olmamasını, gerekli hazırlık çalışmalarının tamamlanmasını ve iyi organize edilmiş, güvenli bir şekilde paketlenmiş ve saha dağıtımına hazır olmalarını sağlamak için gereken malzemelerin tam bir envanterinin yapılmasını içerir. Buna ek olarak, tüm saha personeli, özellikle doku toplamayı yürütenler, herhangi bir toplama etkinliğinden önce toplama protokolünü ayrıntılı olarak gözden geçirmeli ve projeyi denetleyen kişilere herhangi bir soruyu yöneltmelidir. Sahaya girdikten sonra, protokolün numune toplama kısmı detaylara titizlikle dikkat edilmesini gerektirir. Bu, yumurtadan çıktıklarından ve dolayısıyla toplanmaya uygun olduklarından emin olmak için herhangi bir ovanın yerini belirlemeyi ve dikkatlice incelemeyi, forsepsleri iyice temizlemeyi, örnekleme olayları arasında doku taşınmasını azaltmaya yardımcı olmak için eldivenlerin değiştirilmesini ve doku örneklerinin her 1,5 mL mikrosantrifüj tüpü içindeki lizis tamponuna tamamen batırılmasını sağlamayı içerir. Son olarak, mikrosantrifüj tüpünden atanan benzersiz kimlik etiketini, alınan spesifik numune ve diğer tüm ilgili toplama bilgileriyle ilişkilendirmeyi içeren doğru ve ayrıntılı verilerin kaydedilmesi esastır. Bu adım bilimsel araştırmalarda rutin olsa da, genellikle bir topluluk bilimi izleyicisi için iyice açıklığa kavuşturulması ve güçlendirilmesi gerekir.
Burada, topluluk bilim adamlarının küçük, nadir ve tehdit altındaki türlerden ölümcül olmayan numune toplama potansiyelinden yararlanma potansiyelini gösteriyoruz. Bununla birlikte, ortaya çıkan genetik verileri analiz ederken akılda tutulması gereken bazı potansiyel sınırlamalar vardır. Örneğin, tek bir yamadan örneklerin bir araya getirilmesi, tespit için yeterli DNA’nın geri kazanılma şansını arttırırken, potansiyel olarak heterozigotluğu da beraberinde getirir. Ek olarak, protokol koryonun taranmış ovadan toplanmasını içerdiğinden, sadece ebeveyn DNA’sını temsil eden dişi kelebekler bir popülasyon içinde örneklenebilir. Bununla birlikte, C. irus için daha önce popülasyon düzeyinde genetik veri bulunmadığından, elde edilen bilgiler yalnızca türlerin korunmasına ve yönetimine fayda sağlayabilir. Örneğin, popülasyon yapısını yeterince değerlendirmek için kapsamlı, ayrıntılı bir çalışma tasarımı ve dikkatli bir belirteç seçimi gerekli olsa da, burada özetlenen örnekleme protokolü ve sitokrom c oksidaz alt birimi 1 (CO1) DNA barkodlamasının kullanılması, nadir veya tehlikede olan taksonların oluşumunu tespit etmek için kullanılabilir. Burada açıklanan ölümcül olmayan örneklemeden DNA diziliminin yararı ve uygulaması hakkında ek tartışmalar Storer et tarafından detaylandırılmıştır. al.14.
Genetik analiz için örnekler toplamanın birincil amacının ötesinde, protokol ayrıca katılımcıların tüm saha alanlarının, toplama yerlerinin, larva konakçı bitkilerin ve çevredeki habitatın ilgili olabilecek diğer unsurlarının ayrıntılı dijital fotoğraflarını çektiğini vurgulamaktadır. Bu tür belgeler, bitki fenolojisi, konakçı kaynak yoğunluğu ve yönetim geçmişi (örneğin, yakın zamanda öngörülen yangın) gibi mevcut saha koşullarını göstermek için yararlı olan genel bir habitat değerlendirmesi sağlamaya yardımcı olur. Bu tür bilgiler, daha ayrıntılı çevresel karşılaştırmalar sağlamak için saha örneklerinin daha geniş bir zamansal süre boyunca alındığı projeler için özellikle yararlıdır.
Son olarak, küresel böcek düşüşleri hızlanmaya devam ettikçe, genişletilmiş türlerin değerlendirilmesi ve izlenmesi çabalarına kritik olarak ihtiyaç duyulmaktadır15,16. Topluluk bilim adamlarından, öğrencilerden (örneğin, ABD Balık ve Yaban Hayatı Hizmeti stajyerleri ve arkadaşları) ve koruma uygulayıcılarından daha yaygın katılımcı katılımın kullanılması, DNA örnekleri de dahil olmak üzere birçok türde kapsamlı veri toplama için giderek daha uygun seçenekler sunmaktadır. Buna göre, bu protokolden üretilen verilerin birçok olası kullanımı vardır. Bunlar, koruma eylemlerini (örneğin, planlama, kurtarma ve yönetim) bilgilendirmeye yardımcı olmayı, kararları veya tür durumu değerlendirmelerini listelemeyi ve ekolojik, popülasyon ve taksonomik araştırmaları içerir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, David Cuthrell, Amanda Dillon, Steve Fuller, Neil Gifford, Heidi Holman, Dean Jue, Sally Jue, Daniel Kennedy, Genevieve Kozak, Rebecca Longenecker, Maureen McClung, Matt Moran, Robin Niver, Brenda Smith, Hunter Trowbridge ve Jessup Weichelt’e lojistik, koordinasyon, izin ve / veya örnek toplama dahil olmak üzere projenin çeşitli yönleriyle ilgili yardımları için teşekkür etmek istiyor. Bu araştırma, Yaban Hayatı Yönetim Enstitüsü (hibe SA 2021-01) tarafından yönetilen ABD Balık ve Yaban Hayatı Servisi’nden (Federal Ödül Kimlik Numarası F20AC00356) bir hibe ile finanse edilmiştir.
Materials
| 14 quart Igloo Playmate Cooler | Amazon | NA | portable cooler Amount per deployable unit: 1 cooler |
| 250 DNeasy Mini Spin Columns, Proteinase K, Buffers, Collection Tubes (2 mL) | Qiagen | 69506 | Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit Amount per deployable unit: NA |
| Andwin Scientific Supplier Diversity Partner LAB MARKERS BLACK | FisherSci | NC9280166 | ethanol proof lab marker Amount per deployable unit: 2 markers |
| Cardboard shipping box | shipping box Amount per deployable unit: as needed |
||
| Eisco Polyethylene Wash Bottles, LDPE | FisherSci | S14091 | lab grade spray or squirt bottle (for ethanol or alcohol) Amount per deployable unit: 1 bottle |
| FedEx U.S. express airbill | FedEx | NA | shipping return label Amount per deployable unit: 2 labels |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | FisherSci | NC9386261 | sterile 1.5 mL microcentrifuge tubes Amount per deployable unit: 128 tubes |
| Forceps, #4a, very fine yet extra strong tips (33 mm), 4-3/8" (111 mm) long | Bioquip | 4523 | straight tip forceps Amount per deployable unit: 2 straight forceps |
| Forceps, #7, curved tips (13 mm), very fine points, 4-1/2" (114 mm) long | Bioquip | 4527 | curved tip forceps Amount per deployable unit: 2 curved forceps |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | FisherSci | 06-666A | kimwipes (or other sterile wipe) Amount per deployable unit: 1 box |
| Laminated Illustrated field collection protocol | NA | NA | abbreviated protocol Amount per deployable unit: 1 protocol |
| Laminated list of materials | NA | NA | supply list Amount per deployable unit: 1 list |
| Lily Sugar 'N Cream The Original Solid Yarn, 2.5 oz, Medium 4 Gauge, 100% Cotton – Hot Pink – Machine Wash & Dry | Amazon | NA | pink yarn (to secure to forceps for visibility) Amount per deployable unit: 2 yards |
| Loupe by Bausch & Lomb, 10x Coddington Magnifier | Amazon | NA | hand lens Amount per deployable unit: 2 hand lenses |
| MyGift Clear Plastic 2-Tier Trays Craft Supply Storage Box/First Aid Carrying Case w/Top Handle & Latch Lock | Amazon | NA | supply storage box Amount per deployable unit: 1 box |
| Nitrile, Disposable Gloves, L, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU14 | nitrile lab gloves (large) Amount per deployable unit: 1 box |
| Nitrile, Disposable Gloves, M, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU13 | nitrile lab gloves (medium) Amount per deployable unit: 1 box |
| Qiagen, Inc. BUFFER ATL (200 ML) | Qiagen | 19076 | Qiagen ATL lysis buffer Amount per deployable unit: 180 µl/tube; 128 tubes |
| Rite In The Rain Weatherproof Side Spiral Notebook, Yellow Cover, Universal Page Pattern (No. 373-MX), 11 x 8.75 x 0.5 | Amazon | NA | weatherproof field notebook Amount per deployable unit: 1 notebook |
| Showgard Professional Stamp Tongs 6" 904 Round Tip Tweezers | Amazon | NA | 6" spade tip forceps Amount per deployable unit: 2 long spade forceps |
| Texwipe PolySat Pre-Wetted Wipers | FisherSci | 18-366-231 | alcohol wipes Amount per deployable unit: 100 wipes |
| Thermo Scientific CryoBoxes | FisherSci | 12-565-227 | 64 well microcentrifuge tubes collection/storage boxes Amount per deployable unit: 2 boxes |
| packing material Amount per deployable unit: as needed |
References
- Donald, H. M., Wood, C. W., Benowitz, K. M., Johnson, R. A., Drodie, E. D. Nondestructive sampling of insect DNA from defensive secretion. Molecular Ecology Resources. 12 (5), 856-860 (2012).
- Feinstein, J. DNA sequence from butterfly frass and exuviae. Conservation Genetics. 5 (1), 103-104 (2004).
- Hamm, C. A., Aggarwal, D., Landis, D. A. Evaluating the impact of non-lethal DNA sampling on two butterflies, Vanessa cardui and Satyrodes Eurydice. Journal of Insect Conservation. 14, 11-18 (2010).
- Holehouse, K. A., Hammond, R. L., Bourke, A. F. G. Non-lethal sampling of DNA from bumblebees for conservation genetics. Insectes Sociaux. 50 (3), 277-285 (2003).
- Lushai, G., et al. Application of molecular techniques to non-lethal tissue samples of endangered butterfly population (Parnassius apollo L.) in Norway for conservation management. Biological Conservation. 94 (1), 43-50 (2000).
- Monroe, E. M., Lynch, C., Soluk, D. A., Britten, H. B. Nonlethal tissue sampling techniques and microsatellite markers used for first report of genetic diversity in two populations of the endangered Somatochlora hineana (Odonata: Corduliidae). Annals of the Entomological Society of America. 103 (6), 1012-1017 (2010).
- Oi, C. A., López-Uribe, M. M., Cervini, M., Del Lama, M. A. Non-lethal method of DNA sampling in euglossine bees supported by mark-recapture experiments and microsatellite genotyping. Journal of Insect Conservation. 17 (5), 1071-1079 (2013).
- Scriven, J. J., Woodall, L. C., Goulson, D. Nondestructive DNA sampling from bumblebee feces. Molecular Ecology Resources. 13 (2), 225-229 (2013).
- Watts, P. C., Thompson, D. J., Daguet, C., Kemp, S. J. Exuviae as a reliable source of DNA for population-genetic analysis of odonates. Odonatologica. 34 (2), 183-187 (2005).
- Andrews, K., et al. All hands on deck: local ecological knowledge and expert volunteers contribute to the first delisting of a marine fish species under the Endangered Species Act. Citizen Science: Theory and Practice. 4 (1), 37 (2019).
- Buxton, A., Groombridge, J., Griffiths, G. Comparison of two citizen scientist methods for collecting pond water samples for environmental DNA studies. Citizen Science: Theory and Practice. 3 (2), 2 (2018).
- Granroth-Wilding, H., et al. Non-invasive genetic monitoring involving citizen science enables reconstruction of current pack dynamics in a re-establishing wolf population. BMC Ecology. 17 (1), 44 (2017).
- . DNeasy Blood & Tissue Kit Quick Start Protocol Available from: https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=63e22fd7-6eed-4bcb-8097-7ec77bcd4de6&lang=en (2016)
- Storer, C., Daniels, J., Xiao, L., Rossetti, K. Using noninvasive genetic sampling to survey rare butterfly populations. Insects. 10 (10), 311 (2019).
- Wagner, D. L., et al. Insect decline in the Anthropocene: Death by a thousand cuts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 20239891 (2021).
- Montgomery, G. A., et al. Is the insect apocalypse upon us? How to find out. Biological Conservation. 241, 108327 (2020).
