희귀 나비 개체군의 비파괴 유전자 샘플링을 수행하기 위해 지역 사회 과학자 배치
Summary
여기에서는 잔류 알 파편의 현장 수집을 기반으로 한 나비 개체군의 비침습적 유전자 샘플링을 위한 간단한 프로토콜을 제시합니다. 종의 정체성을 확인하고 유전 적 변이를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 커뮤니티 과학 참여를 위해 더 광범위한 그룹에 쉽게 적용할 수 있습니다.
Abstract
전 세계 곤충 감소는 계속 가속화되고 있습니다. 효과적인 유전자 샘플링은 많은 분류군에 대한 이해를 높이고 기존 지식 격차를 해결하는 데 매우 필요합니다. 이 프로토콜은 집단 유전 구조 또는 DNA 바코드 분석을 위해 희귀 나비를 비파괴적으로 샘플링하는 입증된 방법을 나타냅니다. 부화 한 나비 난자의 chorion을 사용하여 종의 정체성을 확인하고 유전 적 변이를 정량화하기 위해 성공적인 유전자 시퀀싱을 위해 충분히 많은 양과 품질의 DNA를 산출합니다. 다른 조직 샘플링 기술이 비실용적이거나 사용할 수 없을 때 특히 유용할 수 있습니다. 나비목을 위해 개발되었지만 그럼에도 불구하고 다른 곤충 종과 함께 사용하기 위해 쉽게 적응할 수 있습니다. 지역 사회 과학자, 보존 실무자 및 학생과 같은 다양한 경험과 기술 수준의 개인이 광범위한 구현을 극대화하고 광범위한 인구 샘플링을 용이하게하기 위해 넓은 지리적 영역에서 사용하기 위해 사용하기 쉽도록 특별히 설계되었습니다. 생성 된 데이터는 분류 및 목록 결정, 보존 및 관리 조치를 알리고 기본 생태 연구를 향상시키는 데 도움이 될 수 있습니다.
Introduction
희귀, 감소 및/또는 등재된 곤충 분류군의 효과적인 개체군 유전자 샘플링은 종종 보존 및 관리 조치를 알리는 데 중요합니다. 치명적이거나 유해한 조직 샘플링 방법은 많은 유전자 분석에 일상적으로 사용됩니다. 그러나 이러한 방법은 취약한 현존하는 개체군에 해를 끼치거나 행동 및 체력에 부정적인 영향을 미칠 수 있기 때문에 바람직하지 않거나 허용되지 않습니다. 전체 다리, 안테나 또는 날개 깎기, 유충 삼출물 또는 방어 분비물 및 frass와 같은 기타 제품의 혈액 림프와 같은 조직을 포함하는 다양한 비살상 또는 비침습적 샘플링 기술이 곤충 유전 연구에 적합했습니다.1,2,3,4,5,6,7,8,9 . 이러한 다양한 조직 샘플링 기술의 전반적인 타당성 및 적용 가능성은 생물학, 생태학, 행동, 크기 및 초점 유기체의 희귀도, 상황 및 물질을 수집하는 개인에 따라 크게 다릅니다. 예를 들어, 전체 다리 또는 부속기 예지물은 일반적으로 숙련 된 직원이 적절한 생활 단계의 여러 개인을 일시적으로 포착하고 조심스럽게 다루어야합니다. 유사하게, 애벌레 exuviae 또는 frass와 같은 조직 소스는 유기체가 포로 상태에 있거나 적절한 기간 동안 일시적으로 보유되어있는 경우에만 실용적 일 수 있습니다.
잠재적 인 분류 학적 분화 또는 유전 적 구조에 관한 질문과 같이 인구 수준에서 묻는 연구 질문의 경우 더 넓은 시간적 또는 지리적 규모 (즉, 지역 또는 대륙)에서 샘플링이 필요한 경우가 많습니다. 결과적으로, 특정 비침습적 조직 공급원은 완전히 비실용적이거나 최소한 대량으로 수집하는 것이 비효율적일 수 있습니다. 이러한 규모의 샘플 수집은 개별 연구자 또는 소규모 현장 팀이 수행하는 것이 물류 또는 재정적으로 비실용적이거나 금지 될 수 있습니다. 이러한 많은 문제를 해결하고 빅 데이터 기반 수집을 가속화하기 위해 연구 커뮤니티에서 커뮤니티 과학자의 직접적인 참여를 점점 더 많이 채택하고 있지만 비파괴적, 비침습적 또는 eDNA 샘플링10,11,12와 관련된 연구의 채택은 제한적이었습니다.
이러한 잠재적 한계 중 일부를 극복하기 위해 우리는 부화 한 나비 난자의 융모막이 종의 정체성을 확인하고 유전 적 변이를 정량화하기 위해 성공적인 유전자 시퀀싱을 위해 충분히 많은 양과 품질의 DNA를 산출 할 수 있음을 입증했습니다. 우리는 이어서 이 기술을 사용하여 다양한 수집 프로토콜을 테스트했습니다 13. 이 파일럿 작업은 추가 방법 론적 개선을위한 기초가되었습니다. 이 백서는 커뮤니티 과학자 및 기타 비전문가 인력을 위해 출시된 간단하면서도 포괄적인 수정된 현장 수집 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 서리로 덥은 꼬마 요정 나비 (Callophrys irus)의 광범위한 인구 구조 분석의 일부로, 향후 보존 조치와 미국 멸종 위기 종법에 따른 등재 가능성에 대한 연방 결정을 알리는 데 도움이됩니다. 일부 비 침습적 방법보다 잠재적으로 노동 집약적이지만 필요한 유기체 접촉이 부족하고 사용 편의성이 없기 때문에 일반적으로 일반적인 곤충과 보존 우려가있는 곤충을 대상으로하는 다른 집단 유전 연구 프로그램에 적용 할 수있는 잠재적으로 실행 가능한 모델입니다 최근에 부화 한 님프 또는 유충에서 잔여 알 파편을 남깁니다. 여기에 제시된 프로토콜 언어는 Lycaenidae 가족의 나비를 위해 특별히 개발되었으며 여기에 정의 된 비전문가가 지역 사회 과학자 또는 곤충 학적 경험이 제한된 다른 개인 (예 : 기관 생물 학자, 인턴)이 사용하기 위해 개발되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 개체군 유전 구조 또는 DNA 바코드 분석을 위해 희귀 나비를 비파괴적으로 샘플링하는 현장 방법을 설명합니다. 이 프로토콜의 전반적인 이점은 지역 사회 과학자, 보존 실무자 및 학생과 같은 다양한 경험과 기술 수준의 개인이 광범위한 구현을 극대화하는 데 도움이 되도록 특별히 설계되었습니다. 여기에는 상대적으로 낮은 전체 비용, 구입하기 쉬운 소모품 및 장비, 지나치게 복잡한 단계가 없는 간단하고 접근하기 쉬운 방법, 광범위한 지리적 영역에 대한 쉬운 배포가 포함됩니다. 또한 일시적으로 포획하거나 조작할 필요가 없는 잔류 유기 물질을 표적으로 삼고 그 과정에서 유전자 샘플을 획득하기 위해 살아있는 유기체에 잠재적으로 해를 끼칠 수 있습니다. 또한 샘플 수집에 사용할 수 있는 잠재적 기간을 기존의 계통학 또는 특정 수명 단계의 수명을 넘어 연장하여 유연성과 전반적인 수집 기회를 향상시켜 샘플 수를 최대화하는 데 도움이 됩니다.
이 노력의 초점 분류군은 널리 퍼져 있지만 감소하는 서식지 전문가 인 서리로 덥은 꼬마 요정 나비 였지만,이 프로토콜은 보존 우려를 포함한 다른 많은 곤충에보다 광범위하게 적용될 수 있습니다. 유사하게, 프로토콜은 유전 물질의 원천으로서 부화 된 알의 수집을 목표로하지만, 잠재적으로 더 전통적인 다른 샘플 (예 : 다리, 날개 조각, 안테나 클립) 또는 전체 유기체에 쉽게 적용 할 수 있습니다. 그러나 이러한 측면은 프로토콜의 잠재적인 제한이기도 합니다. 대부분의 단계는 비교적 간단하고 빠르게 달성하도록 설계되었지만 일반적으로 직경이 <1.0mm인 부화 알을 찾기 위해 유충 숙주 식물 패치를 포괄적으로 검색하는 것은 시간과 노동 집약적입니다. 그럼에도 불구하고 이러한 광범위한 샘플링 활동은 지역 사회 과학자와 같은 대규모 참가자 네트워크에 특히 이상적입니다.
다른 현장 기반 프로젝트와 마찬가지로 신중한 준비가 필수적입니다. 여기에는 품목이 누락되지 않았는지, 필요한 준비 작업이 완료되었는지, 잘 조직되고 안전하게 포장되어 현장 배치를 위해 준비되었는지 확인하는 데 필요한 소모품의 전체 인벤토리를 수행하는 것이 포함됩니다. 또한 모든 현장 직원, 특히 조직 수집을 수행하는 직원은 수집 이벤트 전에 수집 프로토콜을 자세히 검토하고 프로젝트를 감독하는 개인에게 질문을 해결해야 합니다. 일단 현장에 들어가면 프로토콜의 샘플 수집 부분은 세부 사항에 세심한주의가 필요합니다. 여기에는 오바가 부화되어 수집에 적합한지 확인하기 위해 모든 난자를 찾고 주의 깊게 검사하고, 집게를 철저히 청소하고, 샘플링 이벤트 사이의 조직 캐리오버를 줄이는 데 도움이 되도록 장갑을 교체하고, 조직 샘플이 각 1.5mL 미세 원심분리 튜브 내의 용해 완충액에 완전히 잠기도록 하는 것이 포함됩니다. 마지막으로, 정확하고 상세한 데이터를 기록하는 것이 필수적이며, 여기에는 마이크로 원심분리 튜브에서 할당된 고유 ID 라벨과 채취한 특정 샘플 및 기타 모든 관련 수집 정보를 연결하는 것이 포함됩니다. 이 단계는 과학 연구에서 일상적이지만 커뮤니티 과학 청중을 위해 철저히 명확하고 강화해야 하는 경우가 많습니다.
여기에서 우리는 작고 희귀하며 멸종 위기에 처한 종에서 치명적이지 않은 샘플 수집을 위해 지역 사회 과학자들의 잠재적 활용을 보여줍니다. 그러나 결과 유전자 데이터를 분석할 때 명심해야 할 몇 가지 잠재적인 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, 단일 패치에서 샘플을 풀링하면 검출을 위해 충분한 DNA를 회수할 가능성이 높아지지만 잠재적으로 이형접합성도 도입될 수 있습니다. 또한 프로토콜은 부화 된 난자에서 chorion을 수집하는 것을 포함하기 때문에 부모 DNA를 나타내는 암컷 나비 만 개체군 내에서 샘플링 할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 C. irus에 대한 이전 인구 수준의 유전 데이터가 없었기 때문에 얻은 통찰력은 종 보존 및 관리에만 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 인구 구조를 적절하게 평가하려면 철저하고 상세한 연구 설계와 신중한 마커 선택이 필요하지만 여기에 설명된 샘플링 프로토콜과 시토크롬 c 산화효소 서브유닛 1(CO1) DNA 바코드의 사용을 사용하여 희귀하거나 멸종 위기에 처한 분류군의 발생을 감지할 수 있습니다. 여기에 설명된 비치명적 샘플링에서 DNA 시퀀싱의 유용성 및 적용에 대한 추가 논의는 Storer et에 의해 자세히 설명되어 있습니다. 앨리.14.
유전자 분석을 위한 샘플 수집의 주요 목표 외에도 프로토콜은 참가자가 모든 현장 사이트, 수집 위치, 존재하는 유충 숙주 식물 및 관련성이 있을 수 있는 주변 서식지의 기타 요소에 대한 상세한 디지털 사진을 찍는 것을 강조합니다. 이러한 문서는 식물 계통학, 숙주 자원 밀도 및 관리 이력(예: 최근에 규정된 화재)과 같은 기존 현장 조건을 설명하는 데 유용한 일반적인 서식지 평가를 제공하는 데 도움이 됩니다. 이러한 정보는 보다 자세한 환경 비교를 가능하게 하기 위해 더 넓은 시간 기간에 걸쳐 현장 샘플을 채취하는 프로젝트에 특히 유용합니다.
마지막으로, 전 세계 곤충 감소가 계속 가속화됨에 따라 확대 된 종 평가 및 모니터링 노력이 매우 필요합니다15,16. 지역 사회 과학자, 학생 (예 : 미국 어류 및 야생 동물 서비스 인턴 및 동료) 및 보존 실무자의보다 광범위한 참여 참여를 사용하면 DNA 샘플을 포함한 다양한 유형의 광범위한 데이터 수집을위한 점점 더 실행 가능한 옵션이 제공됩니다. 따라서이 프로토콜에서 생성 된 데이터는 많은 용도로 사용할 수 있습니다. 여기에는 보존 조치 (예 : 계획, 복구 및 관리), 결정 또는 종 상태 평가 나열, 생태, 인구 및 분류 학적 연구에 대한 정보 제공이 포함됩니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 데이비드 커스렐, 아만다 딜런, 스티브 풀러, 닐 기포드, 하이디 홀먼, 딘 주, 샐리 주, 다니엘 케네디, 제네비브 코작, 레베카 롱제네커, 모린 맥클렁, 맷 모란, 로빈 니버, 브렌다 스미스, 헌터 트로브리지, 제섭 와이첼트에게 물류, 조정, 허가 및/또는 샘플 수집을 포함한 프로젝트의 다양한 측면에 도움을 준 것에 대해 감사드립니다. 이 연구는 야생 동물 관리 연구소(보조금 SA 20-00356)에서 관리하는 미국 어류 및 야생 동물 관리국(연방 수상 식별 번호 F2021AC00356)의 보조금을 통해 자금을 지원받았습니다.
Materials
| 14 quart Igloo Playmate Cooler | Amazon | NA | portable cooler Amount per deployable unit: 1 cooler |
| 250 DNeasy Mini Spin Columns, Proteinase K, Buffers, Collection Tubes (2 mL) | Qiagen | 69506 | Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit Amount per deployable unit: NA |
| Andwin Scientific Supplier Diversity Partner LAB MARKERS BLACK | FisherSci | NC9280166 | ethanol proof lab marker Amount per deployable unit: 2 markers |
| Cardboard shipping box | shipping box Amount per deployable unit: as needed |
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| Eisco Polyethylene Wash Bottles, LDPE | FisherSci | S14091 | lab grade spray or squirt bottle (for ethanol or alcohol) Amount per deployable unit: 1 bottle |
| FedEx U.S. express airbill | FedEx | NA | shipping return label Amount per deployable unit: 2 labels |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | FisherSci | NC9386261 | sterile 1.5 mL microcentrifuge tubes Amount per deployable unit: 128 tubes |
| Forceps, #4a, very fine yet extra strong tips (33 mm), 4-3/8" (111 mm) long | Bioquip | 4523 | straight tip forceps Amount per deployable unit: 2 straight forceps |
| Forceps, #7, curved tips (13 mm), very fine points, 4-1/2" (114 mm) long | Bioquip | 4527 | curved tip forceps Amount per deployable unit: 2 curved forceps |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | FisherSci | 06-666A | kimwipes (or other sterile wipe) Amount per deployable unit: 1 box |
| Laminated Illustrated field collection protocol | NA | NA | abbreviated protocol Amount per deployable unit: 1 protocol |
| Laminated list of materials | NA | NA | supply list Amount per deployable unit: 1 list |
| Lily Sugar 'N Cream The Original Solid Yarn, 2.5 oz, Medium 4 Gauge, 100% Cotton – Hot Pink – Machine Wash & Dry | Amazon | NA | pink yarn (to secure to forceps for visibility) Amount per deployable unit: 2 yards |
| Loupe by Bausch & Lomb, 10x Coddington Magnifier | Amazon | NA | hand lens Amount per deployable unit: 2 hand lenses |
| MyGift Clear Plastic 2-Tier Trays Craft Supply Storage Box/First Aid Carrying Case w/Top Handle & Latch Lock | Amazon | NA | supply storage box Amount per deployable unit: 1 box |
| Nitrile, Disposable Gloves, L, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU14 | nitrile lab gloves (large) Amount per deployable unit: 1 box |
| Nitrile, Disposable Gloves, M, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU13 | nitrile lab gloves (medium) Amount per deployable unit: 1 box |
| Qiagen, Inc. BUFFER ATL (200 ML) | Qiagen | 19076 | Qiagen ATL lysis buffer Amount per deployable unit: 180 µl/tube; 128 tubes |
| Rite In The Rain Weatherproof Side Spiral Notebook, Yellow Cover, Universal Page Pattern (No. 373-MX), 11 x 8.75 x 0.5 | Amazon | NA | weatherproof field notebook Amount per deployable unit: 1 notebook |
| Showgard Professional Stamp Tongs 6" 904 Round Tip Tweezers | Amazon | NA | 6" spade tip forceps Amount per deployable unit: 2 long spade forceps |
| Texwipe PolySat Pre-Wetted Wipers | FisherSci | 18-366-231 | alcohol wipes Amount per deployable unit: 100 wipes |
| Thermo Scientific CryoBoxes | FisherSci | 12-565-227 | 64 well microcentrifuge tubes collection/storage boxes Amount per deployable unit: 2 boxes |
| packing material Amount per deployable unit: as needed |
References
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