Impiego di scienziati della comunità per condurre campionamenti genetici non distruttivi di rare popolazioni di farfalle
Summary
Qui, presentiamo un protocollo semplice per il campionamento genetico non invasivo delle popolazioni di farfalle basato sulla raccolta sul campo dei detriti residui di uova. Può essere utilizzato per confermare l’identità della specie e quantificare la variazione genetica. Questo protocollo può essere facilmente adattato a gruppi più ampi per il coinvolgimento scientifico della comunità.
Abstract
Il declino globale degli insetti continua ad accelerare. Un campionamento genetico efficace è fondamentale per far progredire la comprensione di molti taxa e colmare le lacune di conoscenza esistenti. Questo protocollo rappresenta un metodo dimostrato per il campionamento non distruttivo di farfalle rare per la struttura genetica della popolazione o le analisi dei codici a barre del DNA. Utilizza il corion delle ovaie di farfalla tratteggiate per produrre una quantità e una qualità di DNA sufficientemente elevate per il sequenziamento genico di successo per confermare l’identità della specie e quantificare la variazione genetica. Può essere particolarmente utile quando altre tecniche di campionamento dei tessuti sono poco pratiche o non disponibili. Sebbene sviluppato per un lepidottero, potrebbe comunque essere facilmente adattato per l’uso con altre specie di insetti. È stato specificamente progettato con facilità d’uso come obiettivo per aiutare a massimizzare l’ampia implementazione da parte di individui di diversa esperienza e livelli di abilità, come scienziati della comunità, professionisti della conservazione e studenti, e per l’uso su vaste aree geografiche per facilitare un ampio campionamento della popolazione. I dati generati possono aiutare a informare le decisioni tassonomiche e di elencazione, le azioni di conservazione e gestione e migliorare la ricerca ecologica di base.
Introduction
Un campionamento genetico efficace della popolazione di taxa di insetti rari, in declino e / o elencati è spesso fondamentale per aiutare a informare le azioni di conservazione e gestione. I metodi di campionamento dei tessuti letali o dannosi sono abitualmente utilizzati per molte analisi genetiche. Tuttavia, questi metodi sono indesiderabili o non consentiti perché possono causare danni alle popolazioni esistenti vulnerabili o avere un impatto negativo sul comportamento e sulla forma fisica. Varie tecniche di campionamento non letali o non invasive che coinvolgono tessuti come gambe intere, tagli di antenne o ali, esuvie larvali o emolinfa da secrezioni difensive e altri prodotti, come il frassino, sono state adatte per la ricerca genetica sugli insetti 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . La fattibilità complessiva e l’applicabilità di queste varie tecniche di campionamento dei tessuti variano significativamente in base alla biologia, all’ecologia, al comportamento, alle dimensioni e alla rarità dell’organismo focale, della situazione e degli individui che raccolgono il materiale. Ad esempio, le gambe intere o i ritagli di appendici richiedono la cattura temporanea e un’attenta manipolazione di diversi individui di una fase di vita appropriata, in genere da parte di personale esperto. Allo stesso modo, le fonti di tessuto, come le esuvie larvali o le frass, sono probabilmente pratiche solo se gli organismi sono in cattività o temporaneamente trattenuti per un periodo adeguato.
Per le domande di ricerca poste a livello di popolazione, come quelle riguardanti la potenziale differenziazione tassonomica o la struttura genetica, è spesso richiesto il campionamento su una scala temporale o geografica più ampia (cioè regionale o continentale). Di conseguenza, alcune fonti di tessuto non invasive possono essere completamente impraticabili o per lo meno inefficienti da raccogliere in quantità. La raccolta di campioni su tali scale può inoltre essere logisticamente o finanziariamente impraticabile o proibitiva per i singoli ricercatori o anche per i team sul campo più piccoli. Mentre l’impegno diretto degli scienziati della comunità è stato sempre più adottato dalla comunità di ricerca per aiutare ad affrontare molte di queste sfide e accelerare la raccolta basata sui big data, l’adozione è stata limitata per gli studi che coinvolgono il campionamento non distruttivo, non invasivo o eDNA10,11,12.
Per aiutare a superare alcune di queste potenziali limitazioni, abbiamo dimostrato che il corion delle ovaie delle farfalle tratteggiate potrebbe produrre una quantità e una qualità di DNA sufficientemente elevate per il sequenziamento genico di successo per confermare l’identità della specie e quantificare la variazione genetica. Successivamente abbiamo testato vari protocolli di raccolta utilizzando questa tecnica13. Questo lavoro pilota è servito come base per ulteriori perfezionamenti metodologici. Questo documento descrive in dettaglio il risultante protocollo di raccolta sul campo rivisto semplice ma completo implementato per gli scienziati della comunità e altro personale non esperto. Questo protocollo fa parte di un’analisi della struttura della popolazione a livello di gamma della farfalla elfa ghiacciata (Callophrys irus) per aiutare a informare le future azioni di conservazione e una determinazione federale di una possibile inclusione ai sensi dell’Endangered Species Act degli Stati Uniti. Sebbene potenzialmente più laborioso di alcuni metodi non invasivi, la mancanza del necessario contatto con l’organismo e la facilità d’uso lo rendono un modello potenzialmente praticabile che può essere applicato ad altri programmi di ricerca genetica di popolazione mirati a una selezione di insetti comuni e quelli di interesse per la conservazione, che lasciano residui di detriti di uova da ninfe o larve appena schiuse. Il linguaggio protocollare qui presentato è stato specificamente sviluppato per le farfalle della famiglia Lycaenidae e per l’uso da parte di non esperti definiti qui come scienziati della comunità o altri individui (ad esempio, biologi di agenzia, stagisti) con esperienza entomologica limitata.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive un metodo sul campo per il campionamento non distruttivo di farfalle rare per la struttura genetica della popolazione o le analisi dei codici a barre del DNA. I vantaggi complessivi di questo protocollo sono specificamente progettati per aiutare a massimizzare l’ampia implementazione da parte di individui di diversa esperienza e livelli di abilità come scienziati della comunità, professionisti della conservazione e studenti. Questi includono costi complessivi relativamente bassi, forniture e attrezzature facili da acquisire, un metodo semplice e accessibile senza numerosi passaggi eccessivamente complessi e una facile implementazione su un’ampia area geografica. Si rivolge inoltre al materiale organico residuo che elimina la necessità di catturare o manipolare temporaneamente e, nel processo, potenzialmente danneggiare gli organismi viventi per acquisire campioni genetici. Inoltre, estende il periodo potenziale disponibile per la raccolta dei campioni oltre la fenologia tradizionale o la durata di vita di una particolare fase della vita, migliorando la flessibilità e l’opportunità complessiva di raccolta per aiutare a massimizzare il numero di campioni.
Mentre il taxon focale per questo sforzo era la farfalla elfica ghiacciata, uno specialista di habitat diffuso ma in declino, questo protocollo può essere applicato più ampiamente a molti altri insetti, compresi quelli di interesse per la conservazione. Allo stesso modo, mentre il protocollo mira alla raccolta di uova schiuse come fonte di materiale genetico, può essere facilmente adattato ad altri campioni potenzialmente più tradizionali (ad esempio, zampe, frammenti di ali, clip antennali) o persino a interi organismi. Tuttavia, questo aspetto è anche una potenziale limitazione del protocollo. Sebbene la stragrande maggioranza dei passaggi sia progettata per essere relativamente semplice e veloce da realizzare, la ricerca completa di macchie di piante ospiti larvali per le uova da schiusa, che individualmente hanno in genere un diametro di <1,0 mm, richiede tempo e lavoro. Tuttavia, un'attività di campionamento così estesa è particolarmente ideale per una rete più ampia di partecipanti come gli scienziati della comunità.
Come per altri progetti sul campo, un’attenta preparazione è essenziale. Ciò include la conduzione di un inventario completo delle forniture necessarie per garantire che non manchino articoli, che qualsiasi lavoro di preparazione richiesto sia stato completato e che siano ben organizzati, imballati in modo sicuro e pronti per la distribuzione sul campo. Inoltre, tutto il personale sul campo, in particolare quelli che conducono la raccolta dei tessuti, dovrebbero rivedere il protocollo di raccolta in dettaglio prima di qualsiasi evento di raccolta e rivolgere eventuali domande alle persone che supervisionano il progetto. Una volta sul campo, la parte del protocollo relativa alla raccolta dei campioni richiede una meticolosa attenzione ai dettagli. Ciò include la localizzazione e l’ispezione attenta di tutti gli ovuli per assicurarsi che siano schiusi e quindi appropriati per la raccolta, la pulizia accurata delle pinze, la sostituzione dei guanti per contribuire a ridurre il trascinamento di tessuto tra gli eventi di campionamento e la garanzia che i campioni di tessuto siano completamente immersi nel tampone di lisi all’interno di ogni provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Infine, è essenziale registrare dati accurati e dettagliati, che include il collegamento dell’etichetta identificativa univoca assegnata dalla provetta della microcentrifuga con il campione specifico prelevato e tutte le altre informazioni di raccolta pertinenti. Mentre questo passaggio è di routine nella ricerca scientifica, spesso deve essere accuratamente chiarito e rafforzato per un pubblico scientifico della comunità.
Qui, dimostriamo il potenziale sfruttamento degli scienziati della comunità per la raccolta di campioni non letali da specie piccole, rare e minacciate. Tuttavia, ci sono alcune potenziali limitazioni da tenere a mente quando si analizzano i dati genetici risultanti. Ad esempio, mentre il raggruppamento di campioni da un singolo cerotto aumenta le possibilità di recuperare abbastanza DNA per il rilevamento, introduce anche potenzialmente eterozigosi. Inoltre, poiché il protocollo prevede la raccolta del corion dagli ovai schiusi, solo le farfalle femminili, che rappresentano il DNA dei genitori, possono essere campionate all’interno di una popolazione. Tuttavia, poiché non erano disponibili dati genetici precedenti a livello di popolazione per C. irus, le conoscenze acquisite non possono che giovare alla conservazione e alla gestione delle specie. Ad esempio, mentre sarebbe necessario un disegno di studio approfondito e dettagliato e un’attenta selezione dei marcatori per valutare adeguatamente la struttura della popolazione, il protocollo di campionamento qui delineato e l’uso del codice a barre del DNA della subunità 1 (CO1) della citocromo c ossidasi potrebbero essere utilizzati per rilevare la presenza di taxa rari o in pericolo. Ulteriori discussioni sull’utilità e l’applicazione del sequenziamento del DNA dal campionamento non letale qui descritte sono dettagliate da Storer et. al.14.
Oltre all’obiettivo primario di raccogliere campioni per l’analisi genetica, il protocollo sottolinea anche che i partecipanti scattano fotografie digitali dettagliate di tutti i siti di campo, i luoghi di raccolta, le piante ospiti larvali presenti e qualsiasi altro elemento dell’habitat circostante che potrebbe essere rilevante. Tale documentazione aiuta a fornire una valutazione generale dell’habitat utile per illustrare le condizioni del sito esistenti come la fenologia delle piante, la densità delle risorse ospiti e la storia di gestione (ad esempio, il recente incendio prescritto). Tali informazioni sono particolarmente utili per i progetti in cui i campioni sul campo sono prelevati in un periodo di tempo più ampio per consentire confronti ambientali più dettagliati.
Infine, poiché il declino globale degli insetti continua ad accelerare, sono assolutamente necessari sforzi di valutazione e monitoraggio delle specie ampliati15,16. L’uso di un impegno partecipativo più diffuso da parte di scienziati della comunità, studenti (ad esempio, stagisti e borsisti del Fish and Wildlife Service degli Stati Uniti) e professionisti della conservazione offre opzioni sempre più praticabili per un’ampia raccolta di dati di molti tipi, compresi i campioni di DNA. Di conseguenza, i dati generati da questo protocollo hanno molti possibili usi. Questi includono aiutare a informare le azioni di conservazione (ad esempio, pianificazione, recupero e gestione), elencare le decisioni o le valutazioni dello stato delle specie e la ricerca ecologica, della popolazione e tassonomica.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare David Cuthrell, Amanda Dillon, Steve Fuller, Neil Gifford, Heidi Holman, Dean Jue, Sally Jue, Daniel Kennedy, Genevieve Kozak, Rebecca Longenecker, Maureen McClung, Matt Moran, Robin Niver, Brenda Smith, Hunter Trowbridge e Jessup Weichelt per l’aiuto con vari aspetti del progetto, tra cui logistica, coordinamento, permessi e / o raccolta di campioni. Questa ricerca è stata finanziata attraverso una sovvenzione del Fish and Wildlife Service degli Stati Uniti (Federal Award Identification Number F20AC00356) amministrato dal Wildlife Management Institute (grant SA 2021-01).
Materials
| 14 quart Igloo Playmate Cooler | Amazon | NA | portable cooler Amount per deployable unit: 1 cooler |
| 250 DNeasy Mini Spin Columns, Proteinase K, Buffers, Collection Tubes (2 mL) | Qiagen | 69506 | Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit Amount per deployable unit: NA |
| Andwin Scientific Supplier Diversity Partner LAB MARKERS BLACK | FisherSci | NC9280166 | ethanol proof lab marker Amount per deployable unit: 2 markers |
| Cardboard shipping box | shipping box Amount per deployable unit: as needed |
||
| Eisco Polyethylene Wash Bottles, LDPE | FisherSci | S14091 | lab grade spray or squirt bottle (for ethanol or alcohol) Amount per deployable unit: 1 bottle |
| FedEx U.S. express airbill | FedEx | NA | shipping return label Amount per deployable unit: 2 labels |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | FisherSci | NC9386261 | sterile 1.5 mL microcentrifuge tubes Amount per deployable unit: 128 tubes |
| Forceps, #4a, very fine yet extra strong tips (33 mm), 4-3/8" (111 mm) long | Bioquip | 4523 | straight tip forceps Amount per deployable unit: 2 straight forceps |
| Forceps, #7, curved tips (13 mm), very fine points, 4-1/2" (114 mm) long | Bioquip | 4527 | curved tip forceps Amount per deployable unit: 2 curved forceps |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | FisherSci | 06-666A | kimwipes (or other sterile wipe) Amount per deployable unit: 1 box |
| Laminated Illustrated field collection protocol | NA | NA | abbreviated protocol Amount per deployable unit: 1 protocol |
| Laminated list of materials | NA | NA | supply list Amount per deployable unit: 1 list |
| Lily Sugar 'N Cream The Original Solid Yarn, 2.5 oz, Medium 4 Gauge, 100% Cotton – Hot Pink – Machine Wash & Dry | Amazon | NA | pink yarn (to secure to forceps for visibility) Amount per deployable unit: 2 yards |
| Loupe by Bausch & Lomb, 10x Coddington Magnifier | Amazon | NA | hand lens Amount per deployable unit: 2 hand lenses |
| MyGift Clear Plastic 2-Tier Trays Craft Supply Storage Box/First Aid Carrying Case w/Top Handle & Latch Lock | Amazon | NA | supply storage box Amount per deployable unit: 1 box |
| Nitrile, Disposable Gloves, L, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU14 | nitrile lab gloves (large) Amount per deployable unit: 1 box |
| Nitrile, Disposable Gloves, M, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU13 | nitrile lab gloves (medium) Amount per deployable unit: 1 box |
| Qiagen, Inc. BUFFER ATL (200 ML) | Qiagen | 19076 | Qiagen ATL lysis buffer Amount per deployable unit: 180 µl/tube; 128 tubes |
| Rite In The Rain Weatherproof Side Spiral Notebook, Yellow Cover, Universal Page Pattern (No. 373-MX), 11 x 8.75 x 0.5 | Amazon | NA | weatherproof field notebook Amount per deployable unit: 1 notebook |
| Showgard Professional Stamp Tongs 6" 904 Round Tip Tweezers | Amazon | NA | 6" spade tip forceps Amount per deployable unit: 2 long spade forceps |
| Texwipe PolySat Pre-Wetted Wipers | FisherSci | 18-366-231 | alcohol wipes Amount per deployable unit: 100 wipes |
| Thermo Scientific CryoBoxes | FisherSci | 12-565-227 | 64 well microcentrifuge tubes collection/storage boxes Amount per deployable unit: 2 boxes |
| packing material Amount per deployable unit: as needed |
References
- Donald, H. M., Wood, C. W., Benowitz, K. M., Johnson, R. A., Drodie, E. D. Nondestructive sampling of insect DNA from defensive secretion. Molecular Ecology Resources. 12 (5), 856-860 (2012).
- Feinstein, J. DNA sequence from butterfly frass and exuviae. Conservation Genetics. 5 (1), 103-104 (2004).
- Hamm, C. A., Aggarwal, D., Landis, D. A. Evaluating the impact of non-lethal DNA sampling on two butterflies, Vanessa cardui and Satyrodes Eurydice. Journal of Insect Conservation. 14, 11-18 (2010).
- Holehouse, K. A., Hammond, R. L., Bourke, A. F. G. Non-lethal sampling of DNA from bumblebees for conservation genetics. Insectes Sociaux. 50 (3), 277-285 (2003).
- Lushai, G., et al. Application of molecular techniques to non-lethal tissue samples of endangered butterfly population (Parnassius apollo L.) in Norway for conservation management. Biological Conservation. 94 (1), 43-50 (2000).
- Monroe, E. M., Lynch, C., Soluk, D. A., Britten, H. B. Nonlethal tissue sampling techniques and microsatellite markers used for first report of genetic diversity in two populations of the endangered Somatochlora hineana (Odonata: Corduliidae). Annals of the Entomological Society of America. 103 (6), 1012-1017 (2010).
- Oi, C. A., López-Uribe, M. M., Cervini, M., Del Lama, M. A. Non-lethal method of DNA sampling in euglossine bees supported by mark-recapture experiments and microsatellite genotyping. Journal of Insect Conservation. 17 (5), 1071-1079 (2013).
- Scriven, J. J., Woodall, L. C., Goulson, D. Nondestructive DNA sampling from bumblebee feces. Molecular Ecology Resources. 13 (2), 225-229 (2013).
- Watts, P. C., Thompson, D. J., Daguet, C., Kemp, S. J. Exuviae as a reliable source of DNA for population-genetic analysis of odonates. Odonatologica. 34 (2), 183-187 (2005).
- Andrews, K., et al. All hands on deck: local ecological knowledge and expert volunteers contribute to the first delisting of a marine fish species under the Endangered Species Act. Citizen Science: Theory and Practice. 4 (1), 37 (2019).
- Buxton, A., Groombridge, J., Griffiths, G. Comparison of two citizen scientist methods for collecting pond water samples for environmental DNA studies. Citizen Science: Theory and Practice. 3 (2), 2 (2018).
- Granroth-Wilding, H., et al. Non-invasive genetic monitoring involving citizen science enables reconstruction of current pack dynamics in a re-establishing wolf population. BMC Ecology. 17 (1), 44 (2017).
- . DNeasy Blood & Tissue Kit Quick Start Protocol Available from: https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=63e22fd7-6eed-4bcb-8097-7ec77bcd4de6&lang=en (2016)
- Storer, C., Daniels, J., Xiao, L., Rossetti, K. Using noninvasive genetic sampling to survey rare butterfly populations. Insects. 10 (10), 311 (2019).
- Wagner, D. L., et al. Insect decline in the Anthropocene: Death by a thousand cuts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 20239891 (2021).
- Montgomery, G. A., et al. Is the insect apocalypse upon us? How to find out. Biological Conservation. 241, 108327 (2020).
