Topische toepassing Bioassay om insecticide toxiciteit voor muggen en fruitvliegen te kwantificeren
Summary
We beschrijven de methodologie en het belang van de actuele toepassing bioassay om de gevoeligheid voor insecticiden bij muggen en fruitvliegen te meten. De gepresenteerde test is high-throughput, maakt gebruik van insectenmassa – waardoor een massa-gerelativeerde letale dosis in plaats van concentratie kan worden berekend – en heeft waarschijnlijk een lagere variabiliteit dan andere vergelijkbare methoden.
Abstract
Het voortdurende gebruik van insecticiden voor de volksgezondheid en de landbouw heeft geleid tot wijdverspreide resistentie tegen insecticiden en het belemmeren van bestrijdingsmethoden. Insecticideresistentiebewaking van muggenpopulaties wordt meestal gedaan via Centers for Disease Control and Prevention (CDC) flesbioassays of buistests van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO). Deze methoden kunnen echter resulteren in een hoge mate van variabiliteit in sterftegegevens als gevolg van variabel insecticidecontact met het insect, het relatief kleine aantal geteste organismen, uitgebreide variatie in massa tussen populaties en voortdurend veranderende omgevingsomstandigheden, wat leidt tot variabele uitkomsten. Dit artikel presenteert de actuele toepassing bioassay, aangepast als een fenotypische bioassay met hoge doorvoer voor zowel muggen als fruitvliegen, om grote aantallen insecten te testen langs een reeks insecticideconcentraties.
Deze test 1) zorgt voor een consistente behandeling en insecticide contact met elk organisme, 2) produceert zeer specifieke dosis-responscurven die rekening houden met verschillen in gemiddelde massa tussen stammen en geslachten (wat met name belangrijk is voor in het veld verzamelde organismen), en 3) maakt de berekening van statistisch rigoureuze mediane letale doses mogelijk (LD50 ), die nodig zijn voor vergelijkingen van resistentieratio’s – een alternatieve surveillancebenadering van diagnostische dosissterfte, die ook wordt gebruikt voor larvicideresistentiesurveillance. Deze test zal een aanvullend hulpmiddel zijn voor het nauwkeurig fenotyperen van muggenpopulaties en is, zoals geïllustreerd met behulp van fruitvliegen, gemakkelijk aan te passen voor gebruik met andere insecten. We beweren dat deze test zal helpen de kloof tussen genotypische en fenotypische insecticideresistentie bij meerdere insectensoorten te vullen.
Introduction
Muggen zijn verantwoordelijk voor meer dan 700.000 sterfgevallen per jaar als gevolg van de ziekten die ze op mensen overbrengen, met meer dan de helft van die sterfgevallen als gevolg van malaria alleenal 1. De belangrijkste preventieve methode tegen overdracht van malaria en andere door vectoren overgedragen ziekten is het gebruik van insecticiden, vaak in de vorm van langdurige insecticidenetten of binnenshuis-restsproeien2. Insecticideresistentie is echter wijdverspreid onder muggen en andere insectenvectoren, evenals landbouwongedierte 3,4. Om de weerstand effectief te beheersen, is bewaking van cruciaal belang5. Hiervoor zijn zeer nauwkeurige detectiemethoden met hoge doorvoerweerstand nodig. Momenteel zijn de meest wijdverspreide insecticideresistentiebewakingstools voor muggen de WHO-buistest6 en de CDC-flesbioassay7. Voor fruitvliegen is de residuele contacttoepassingsmethode (vergelijkbaar met de CDC-flesbioassay) een veelgebruikte insecticide bioassay 8,9,10. De variabiliteit in gegevens van deze methoden is echter meestal hoog, met metingen van dezelfde laboratoriummumstam variërend van ~ 20-70% mortaliteit in CDC-flestests en 0-50% in WHO-buistests bij blootstelling aan subletale doseringen11. Een dergelijke variatie is verrassend omdat de beperkte genetische variatie in de meeste laboratoriumstammen naar verwachting zal leiden tot een beperkte variatie in de gevoeligheid voor insecticiden in de populatie. Niettemin is er nog steeds een hoge mate van variatie waargenomen in de bioassay-resultaten.
Potentiële bronnen van deze variatie kunnen het gevolg zijn van heterogene blootstelling aan insecticiden tussen monsters binnen de bioassay als gevolg van indirecte blootstelling aan insecticiden via het oppervlak, heterogene milieueffecten, normale biologische variatie tussen individuen van hetzelfde genotype en variatie in de massa van specimens van dezelfde populatie12 . Een zelden gebruikte methode met een hogere repliceerbaarheid is de topische toepassing bioassay. In deze test wordt het insecticide rechtstreeks toegepast op elk insect13,14, waardoor de factor van heterogene blootstelling van verschillende monsters binnen dezelfde test wordt verwijderd. Vanwege de trage doorvoer van deze methode wordt deze echter niet routinematig gebruikt als een insecticide gevoeligheidsbewakingsinstrument voor muggenpopulaties. Dit artikel presenteert een aangepast protocol voor de topische toepassingsbioassay dat blootstellingen met een hogere doorvoer mogelijk maakt en tegelijkertijd corrigeert voor variatie in insectenmassa, een parameter die correleert met veranderingen in de gevoeligheid voor insecticiden12. Een vermindering van lawaai en massa-geassocieerde variatie in sterftegegevens door variabele blootstelling aan insecticiden zou een nauwkeurigere technische weerstandsbewaking mogelijk maken11,15. Dergelijke gegevens kunnen worden gebruikt om fenotypische resistentie nauwkeuriger te associëren met genetische markers, fitnessparameters en / of vectorcompetentie. Daarnaast laten we zien hoe deze test gemakkelijk kan worden aangepast aan andere insectensoorten door gebruik te maken van de actuele toepassing bioassay op fruitvliegen, een kleinere insectensoort.
De belangrijkste beperking van de bovengenoemde restcontacttoepassingen is dat de blootstelling aan insecticiden binnen dezelfde test van monster tot monster kan variëren. In het geval van CDC-flesbioassays en de contactmethode kan de blootstelling aan insecticiden variëren tussen replicaties van dezelfde test. De insecten worden blootgesteld aan insecticide dat ofwel wordt gedistribueerd aan de binnenkant van een glazen fles (CDC-fles bioassay en contactmethode) of op geïmpregneerd papier (WHO-buistest). De concentratie van insecticide op beide oppervlakken (glas en papier) is bekend en vooraf bepaald door het screenen van verschillende soorten van bekende genotypen. De hoeveelheid die beschikbaar is om mogelijk door het insect te worden geabsorbeerd, kan echter sterk variëren, afhankelijk van het gebruikte oppervlak, de bestanddelen van het insecticidemengsel en hoe homogeen het insecticide over het oppervlaktemateriaal is verdeeld16,17. In de CDC-flesbioassay is de insecticidecoating aan de binnenkant van de fles afhankelijk van de procedures die door elk laboratorium en elke gebruiker worden gebruikt. In de WHO-buistest worden de met insecticide behandelde papieren centraal geproduceerd en dus hoogstwaarschijnlijk vrij homogeen in laboratoria. In de WHO-buistest stelt de blootstellingsbuis monsters echter in staat om te landen en te rusten op niet-insecticide-blootgesteld metaalgaas, wat leidt tot mogelijke heterogene blootstelling aan insecticiden tussen de monsters binnen elke test. De werkelijke hoeveelheid insecticide die via elke methode door monsters wordt opgepikt en geabsorbeerd, moet nog worden onderzocht18.
Bovendien worden de CDC-flesbioassay, WHO-buistest en contactmethode het meest gebruikt als drempeltests die slechts één vooraf bepaalde insecticideconcentratie testen. Deze aanpak kan de aanwezigheid van weerstand nauwkeurig detecteren en is waardevol voor weerstandsbewaking (vooral wanneer weerstand zich verspreidt). Drempeltests kunnen echter de sterkte van de weerstand niet kwantificeren, wat meer voorspellend zou kunnen zijn voor de effectiviteit van interventie-instrumenten. Als meerdere insecticideconcentraties worden gebruikt met deze methoden, kunnen ze worden gebruikt als intensiteitstests. Intensiteitstests voor de CDC-flesbioassay en de WHO-buistest zijn geïntroduceerd door 5x en 10x de vooraf bepaalde discriminerende doseringen te testen om deze kloof in surveillance aan te pakken 6,19. Hoewel ze meer mogelijkheden bieden om onderscheid te maken tussen resistente populaties, bieden 3-5 (vooraf bepaalde) doseringen een beperkte resolutie om dodelijke concentraties te berekenen. Bovendien worden muggen van verschillende groottes gebruikt in dergelijke testen. Toch is de massa belangrijk om te meten, omdat grotere exemplaren mogelijk een hogere dosis nodig hebben om te worden gedood, omdat de effectieve dosis per massa-eenheid veel lager zal zijn dan die van een kleiner organisme12. Het berekenen van een massagerelativeerde letale dosis (hoeveelheid insecticide per insectenmassa) zou een nuttiger metriek zijn dan de meer gebruikelijke dodelijke concentratie (bijv. Hoeveelheid insecticide per oppervlak) omdat het rekening houdt met de variatie van insectenmassa tussen geslachten, populaties en genotypen. Dergelijke gegevens zouden helpen de kloof tussen genotypische en fenotypische resistentie binnen het laboratorium en het veld te dichten en zouden ook een eenvoudige manier kunnen bieden om de benodigde toepassingsconcentratie te berekenen voor de behandeling van een populatie insecten met een bekende gemiddelde massa.
Het gebruik van massa-gerelativeerde dodelijke doseringen die 50% van de monsters doden (LD50) bevat ook verschillende andere voordelen. De beoordeling van de toxiciteit van een specifieke verbinding in mg/kg (= ng/mg) is standaard in de toxicologie voor mens en dier14 en LD50-waarden zijn te vinden op veiligheidsinformatiebladen. Dodelijke doseringen maken ook directe vergelijking van toxiciteit mogelijk tussen verschillende chemicaliën voor een bepaalde soort of dezelfde chemische stof voor verschillende soorten20, evenals hoogwaardige evaluatie van nieuwe insecticiden en chemicaliën13. Bovendien kan de LD50 zinvollere en nauwkeurigere resistentieverhoudingen bieden dan die afgeleid van diagnostische dosissterfteresultaten, wat kan resulteren in een overschatting van het resistentieniveau dat aanwezig is in een populatie. Daarom zou deze test geschikt zijn voor routinematige surveillanceprogramma’s door strengere resistentiemonitoring te bieden op basis van massagerelativeerde letale doses afgeleid van meer monsters dan aanbevolen voor andere bioassays21.
De topische toepassingsmethode is gebruikt bij de bewaking van de gevoeligheid van insecticiden voor muggen en vliegen als alternatief voor de standaard insecticide gevoeligheidsbioassays wanneer resistentie al bekend is of wordt vermoed22,23, evenals voor bewaking bij sommige plaaginsecten24 om resistentieprofielen en intrinsieke toxiciteit van insecticiden nauwkeuriger te beoordelen21 . In topische toepassing bioassays, wordt het insecticide toegepast op elk organisme, wat resulteert in minimale variatie in blootstelling aan insecticiden. Dit artikel presenteert een licht aangepaste en verbeterde methode die het mogelijk maakt om blootstelling aan insecticiden toe te passen op een groot aantal insecten in een korte periode, terwijl ook wordt gecontroleerd op insectenmassa22. Deze methode met een hogere doorvoer en een goede repliceerbaarheid zou een nuttig aanvullend hulpmiddel kunnen zijn voor routinematige bewaking van de gevoeligheid voor insecticiden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel presenteert een aangepast protocol voor de actuele toepassingstest voor muggen en fruitvliegen. Deze procedure kan gemakkelijk worden aangepast om in het veld en met andere organismen te worden gebruikt, omdat het minimale gespecialiseerde apparatuur vereist. Hieronder worden de kritieke stappen van dit protocol, mogelijke wijzigingen, advies voor probleemoplossing, beperkingen van de methode en het belang van deze methode behandeld.
Kritieke stappen in het protocol: Er zijn drie kritieke stappen in het protocol die, indien onjuist voltooid, de resultaten van de bioassay drastisch kunnen beïnvloeden: nauwkeurigheid van de insecticideconcentratie, knockdown van monsters en mortaliteitsbeoordeling.
Nauwkeurigheid van de insecticideconcentratie:
Het is uiterst belangrijk om nauwkeurige insecticide-oplossingen te hebben om reproduceerbare dosis-responscurven en zinvolle resultaten te verkrijgen. De volumetrische benadering van de bereiding van insecticide-oplossing komt vaker voor in de literatuur voor zowel CDC-flesbioassay7 als topische toepassingen 13,14,43. De gravimetrische benadering die hier wordt beschreven, is echter inherent nauwkeuriger vanwege de overweging van temperatuur door de opname van (temperatuurspecifieke) dichtheid, wat leidt tot een nauwkeuriger formuleringsvoorbereiding.
Specimen knockdown:
Het neerhalen van de monsters is een cruciaal onderdeel van deze methode en maakt de nauwkeurige toediening van het insecticide en gewichtsmetingen mogelijk. Het neerhalen van organismen bevat echter onvermijdelijk het risico op fysieke stress en schade, zoals eerder is aangetoond30. Wees daarom voorzichtig en bedachtzaam bij het neerhalen van de exemplaren om ervoor te zorgen dat i) elk exemplaar voor een vergelijkbare duur wordt neergeslagen, ii) de lengte van knockdown tot een minimum wordt beperkt en iii) de methode van knockdown consistent wordt gehouden voor alle exemplaren. Bovendien wordt geadviseerd om de knockdown-methode afzonderlijk te testen, voorafgaand aan het aanbrengen van insecticiden, om ervoor te zorgen dat de methode succesvol is en geen controlesterfte van meer dan 10% induceert. De eerste test kan langer duren voor een onervaren gebruiker, wat leidt tot langere knockdown-tijden. Wees daarom voorzichtig bij het interpreteren van de resultaten van de eerste assays.
Sterftebeoordeling:
Het beoordelen van sterfte kan een uitdaging zijn, vooral wanneer het insecticide niet volledig doodt, maar alleen de mug of vlieg neerhaalt of verminkt. Daarom is het belangrijk om je bewust te zijn van hoe het insecticide het doelorganisme beïnvloedt en een duidelijke definitie te hebben voor “dode” (of neergeslagen) organismen voordat je begint. Bovendien wordt aanbevolen om dezelfde persoon de mortaliteit tussen doses en replicaties te laten beoordelen om variatie te verminderen.
Protocolwijzigingen: Verschillende hieronder beschreven wijzigingen kunnen op dit protocol worden toegepast om de veelzijdigheid en toegankelijkheid ervan te verbeteren.
Aanpassing van de test aan kleinere of grotere insecten:
Bij gebruik van kleinere of grotere monsters wordt geadviseerd om respectievelijk een kleiner of groter dosisvolume insecticide toe te passen. Als voorbeeld hebben we het muggenprotocol aangepast aan fruitvliegen door de dosis van 0,5 μL te verlagen tot een dosis van 0,2 μL. Zorg ervoor dat de juiste spuitgrootte is gekozen voor het gekozen dosisvolume.
Aanpassing van de test aan veldinsecten:
Bij het gebruik van veldinsecten kan er meer variatie in insectengrootte zijn. Daarom zou het wegen van de insecten in kleinere groepen (bijvoorbeeld per kopje) worden aanbevolen in plaats van als een grote groep (bijvoorbeeld alle insecten die voor één experiment worden gebruikt). Dit kan helpen bij het vastleggen van de potentiële variatie in insecticide gevoeligheid geassocieerd met de verschillen in veldinsectenmassa.
Aanpassingen aan de uitrusting:
Insectenbehandelingstent: Het doseren van het monster kan worden voltooid onder een insectenbehandelingstent die eenvoudig is opgebouwd met PVC-buis en muskietengaas. Dit kan een alternatief zijn voor een afgesloten ruimte (bijv. Insectary) en helpen bij het elimineren van mogelijke insecticidebesmetting in gebieden waar insectenopfok kan optreden. Deze insectenbehandelingstent is eenvoudig te bouwen en goedkoop (~ $ 70). Als alternatief kan een kooi voor het hanteren van insecten worden gekocht (~ $ 425).
Koeltafel: IJspakken of dienbladen met ijs kunnen worden gebruikt om het monster neer te slaan en/of het monster neergeslagen te houden.
Incubator: Incubators worden aanbevolen voor het fokken van het monster en het houden van het monster gedurende 24 uur na de behandeling met insecticiden. Als er geen incubator beschikbaar is, kan deze worden gebouwd. Apparatuur die nodig is om de incubator te bouwen, omvat een geïsoleerde container, luchtbevochtiger, warmtekabels, vochtigheids- en temperatuurregelaar en een licht, dat zou moeten oplopen tot een totale kosten van ~ $ 170, in navolging van en voortbouwend op eerdere methoden44.
Bekers: Hoewel plastic bekers worden gebruikt om het behandelde monster te sorteren en vast te houden, zijn met was beklede papieren bekers of glazen containers geschikte alternatieven.
Modificatie van organismen en levensfasen:
Deze methode is zeer aanpasbaar voor gebruik met andere vectoren, insecten en / of geleedpotigen zoals Culex quinquefasciatus muggen32, huisvliegen32 en kakkerlakken45, evenals niet-volwassen levensfasen, zoals muggenlarven46.
Actuele wijziging van de toepassingslocatie:
Deze methode beschrijft het aanbrengen van het insecticide op de ventrale thorax en het buikgebied voor muggen (en de dorsum voor fruitvliegen). Andere toepassingslocaties kunnen echter worden gebruikt zolang de blootstellingslocatie consistent is. Consistentie is belangrijk omdat de gevoeligheid voor insecticiden kan variëren op basis van toepassingslocatie32.
Advies voor het oplossen van problemen: Deze methode kent verschillende stappen die in eerste instantie uitdagend zijn. Hieronder worden enkele van de meest voorkomende problemen beschreven die u kunt tegenkomen.
Lekkende/verdampende insecticide oplossingen:
Insecticiden worden vaak opgelost in aceton, een zeer vluchtige stof. Dit betekent dat aceton snel verdampt bij kamertemperatuur, waardoor de insecticideconcentraties in de loop van de tijd toenemen. Als de insecticide-oplossingen lijken te lekken of verdampen, maak de oplossingen dan opnieuw, zorg ervoor dat het deksel van de buis goed zit en controleer nogmaals of de opslagprotocollen correct worden gevolgd (bijv. Parafilm wordt gebruikt en de buizen worden rechtop opgeslagen). Als het lekken aanhoudt, probeer dan de buizen met een lager volume te vullen om meer ruimte te bieden voor de volumeverandering die de aceton bij verschillende temperaturen ervaart. Bovendien, als u aceton als oplosmiddel gebruikt, moet u ervoor zorgen dat de buizen geschikt zijn voor acetonopslag (bijv. FEP-, TFE- en PFA-kunststoffen). Als u hydrofobe insecticiden gebruikt, bewaar de oplossingen dan in glazen injectieflacons (omdat hydrofobe insecticiden zich minder dan plastic aan glas hechten). Het is ook een goede gewoonte om de meniscus van de oplossing te markeren voordat deze wordt opgeslagen om de verdamping te controleren.
Gewicht dat afdrijft op microbalans bij het wegen van organismen:
Als de gewichtsaflezing op de weegschaal afdrijft (langzaam omhoog of omlaag gaat), kan dit te wijten zijn aan statische elektriciteit. Drift komt meestal voor bij het wegen van organismen in plastic items, omdat plastic gemakkelijk een statische lading kan vasthouden. Om dit te voorkomen kan een weegpapier onder de plastic container worden geplaatst die wordt gewogen, of kan een niet-plastic container zoals glas worden gebruikt.
Abnormale sterfteresultaten:
Er zijn veel manieren waarop de sterfteresultaten abnormaal kunnen lijken, zoals het observeren van hoge mortaliteit in de controles of hoge / lage mortaliteit in alle insecticidedoses. Bekijk de volgende cases voor het oplossen van problemen met elk scenario.
Hoge controlesterfte
Als er een hoge mortaliteit is in de controlegroep (10% of meer), evalueer dan de knockdown-methode en de tijdsduur dat de monsters worden neergeslagen. Verkort indien mogelijk de tijdsduur gedurende welke de exemplaren worden neergeslagen. Andere mogelijke factoren om te overwegen voor hoge mortaliteit in de controles zijn i) controleren of de couveuseinstellingen correct zijn – abnormale temperaturen en / of vochtigheid kunnen leiden tot verhoogde mortaliteit. Temperatuur en vochtigheid moeten worden gecontroleerd met een onafhankelijke datalogger. ii) Beoordeling van de omgang met insecten. Te veel of te ruw omgaan met insecten kan leiden tot een hoge sterfte. iii) Controleren of er geen insecticideverontreiniging is in de 100% aceton die wordt gebruikt voor de behandeling van de controlegroep of op de instrumentatie. Vervang aceton en reinig alle instrumenten met aceton of ethanol. Voorkom besmetting door regelmatig handschoenen te vervangen, morsen te voorkomen en instrumenten te reinigen. Merk op dat in aanvullend bestand 3 maximaal twee muggen stierven binnen de controle (alleen aceton) kopjes. Dit sterfteniveau wordt niet als hoog beschouwd (het is minder dan 10%), en daarom was er geen reden tot bezorgdheid.
Hoge mortaliteit in alle blootgestelde groepen (maar niet in controlegroepen)
Gebruik lagere insecticideconcentraties of kleinere dosisvolumes voor het testen. De gebruikte doseringen kunnen boven de minimale dosis liggen die geen mortaliteit zal veroorzaken. Gebruik verschillende 10-voudige verdunningen om het juiste dosisbereik te bepalen en besmetting uit te sluiten. Om besmetting te voorkomen, begint u met de dosering met de laagste concentratie en werkt u naar de hoogste concentratie toe. Zorg er bovendien voor dat alle gebruikte apparatuur regelmatig wordt gereinigd met aceton en / of ethanol, dat de doses die op het monster worden aangebracht erg klein zijn en zelfs de geringste kruisbesmetting de resultaten kan beïnvloeden.
Lage mortaliteit in alle blootgestelde groepen
Gebruik hogere insecticideconcentraties. De gebruikte doseringen kunnen allemaal te laag zijn om sterfte in de bevolking te veroorzaken. Om het juiste dosisbereik te bepalen, stelt u monsters bloot aan nog een aantal 10-voudige geconcentreerde doseringen. Zorg ervoor dat de insecticide-oplossingen niet zijn verlopen of afgebroken (mogelijk als gevolg van hoge temperaturen of blootstelling aan licht). Als de oplossingen zijn verlopen of waarvan wordt vermoed dat ze zijn aangetast, maak de oplossingen dan opnieuw en zorg ervoor dat de juiste opslagomstandigheden worden gevolgd.
Inconsistente mortaliteit tussen replicaten/dagen
Het tijdstip van de dag waarop insecten worden blootgesteld aan het insecticide kan van invloed zijn op het niveau van resistentie dat wordt uitgedrukt, vooral voor metabole resistentie34. Herhaal dit protocol elke dag gedurende hetzelfde tijdvenster om het tijdstip van de dag te vermijden als een potentiële variabele die bijdraagt aan veranderingen in de mortaliteit. Andere mogelijke factoren die bijdragen aan inconsistente mortaliteit tussen replicaties zijn i) monsters die differentieel worden gekweekt tussen experimenten. Zorg ervoor dat alle exemplaren van dezelfde leeftijdscategorie zijn, gefokt met dezelfde temperatuur en vergelijkbare dichtheden en voedselbeschikbaarheid. ii) insecticideconcentraties die in de loop van de tijd afnemen of geconcentreerder worden als gevolg van acetonverdamping. Maak de oplossingen opnieuw en zorg voor de juiste bewaarcondities. iii) Inconsistente sterftescore. Zorg ervoor dat dezelfde persoon sterfte scoort of ontwikkel een duidelijk protocol dat consistent in het hele team kan worden gebruikt. Gebruik blind scoren om bias in mortaliteitsscores te verminderen.
Insecten die aan het oppervlak van de sorteerbak kleven:
Aceton reageert op kunststoffen die in dit protocol worden gebruikt, zoals petrischalen. Het monster zal zich waarschijnlijk aan het oppervlak hechten als aceton op petrischalen of soortgelijke plastic oppervlakken wordt gebruikt. Deze hechting kan worden voorkomen door de sorteerbak te bekleden met weegpapier of door een niet-plastic sorteerbak te gebruiken. Bovendien kan condensatie op het oppervlak van plastic in de sorteerbak of bekers ertoe leiden dat insecten zich aan de condensatie hechten, of het monster kan te koud zijn en mogelijk aan de oppervlakte bevriezen. Pas de knockdown-methode aan om condensatie te verminderen en tegelijkertijd te voorkomen dat de monsters te koud/bevroren worden (plaats bijvoorbeeld weegpapier tussen de monsters en de plastic sorteerbak).
R-analysefouten:
Zodra de sterftegegevens zijn verzameld, kunnen er tijdens de analyse verschillende complicaties optreden. De meest voorkomende reden waarom een R-code de acties voor het gegevensbestand niet kan voltooien, is dat de gegevensindeling niet overeenkomt met de code (bijvoorbeeld kolomkoppen en/of lege cellen). Als er meer ernstige complicaties optreden, raadpleegt u de R-helppagina’s die zijn ingebouwd in Rstudio35.
Beperkingen van de hierboven beschreven topische toepassingsmethode:
Insecticide absorptie via topische toepassingsmethode bootst geen natuurlijke blootstelling na:
Topische toepassing op het primaire lichaam is niet de natuurlijke manier van insecticide absorptie. In het veld absorberen insecten meestal insecticiden via hun poten gedurende de tijd dat ze in contact komen met het met insecticide behandelde oppervlak of op hun vleugels door kleine aerosoldeeltjes47,48, in plaats van een snelle blootstelling op het ventrale oppervlak. De directe toepassing van een bekende insecticidedosis zal echter nauwkeurig een fenotypische respons op insecticiden vaststellen, nodig voor genetische en evolutionaire studies of vergelijkingen van insecticidegevoeligheid in ruimte of tijd. Daarom is deze aanpak gunstig voor het testen van technische weerstand, maar zal deze niet direct de praktische weerstand meten (de effectiviteit van het eigenlijke interventie-instrument in een veldsetting15). Het is echter belangrijk op te merken dat de huidige standaardmethoden (bijv. WHO-buistests en CDC-flesbioassays) ook geen aerosol kunnen vangen of nabootsen (d.w.z. door blootstelling aan insecticiden in het veld te beslaan) door te beslaan.
Topische toepassingstests kunnen alleen contactabsorptie-insecticiden beoordelen:
Deze methode is bedoeld voor insecticiden die werken door contact en absorptie van het insecticide en niet voor gebruik met orale insecticiden, zoals boorzuur dat vaak wordt gebruikt in aantrekkelijk giftig suikeraas49.
Betekenis van de methode:
De topische toepassingsmethode borduurt voort op gevestigde normen voor insecticide bioassays door de dodelijke dosis (niet de concentratie) te berekenen en de technische (niet praktische) resistentie te meten15. Hieronder worden de voor- en nadelen van deze methode ten opzichte van bestaande insecticide gevoeligheidstests gegeven.
Berekening van de dodelijke dosis:
Deze methode bepaalt de dodelijke dosis van het insecticide, in plaats van de dodelijke concentratie die de CDC en WHO bioassays gebruiken om de discriminerende dosis11 vast te stellen. De dodelijke dosis is zinvoller omdat het een gekwantificeerde hoeveelheid insecticide is waarvan bekend is dat het sterfte veroorzaakt. Daarentegen houdt de dodelijke concentratie geen rekening met hoeveel insecticide het organisme daadwerkelijk verwerft. Bij gebruik van de berekening van de dodelijke dosis kunnen verschillen tussen geslachts- of grootteafhankelijke gevoeligheidsprofielen nauwkeuriger worden waargenomen en gekwantificeerd, waardoor deze meting nog veelzijdiger wordt.
Technische weerstand:
Deze methode beoordeelt de technische weerstand, dat is weerstand zoals gemeten onder gestandaardiseerde, gecontroleerde omgevingen. Dergelijke metingen zijn geschikt voor het toezicht op de verspreiding van insecticideresistentie en het koppelen van fenotypische resistentie aan potentiële markers15. Vanwege de verminderde variatie in mortaliteit als gevolg van de lokale toepassingsbioassay, maakt het een betere identificatie van nieuwe weerstandsmarkers mogelijk. Vanwege de onnatuurlijke blootstelling van insecticiden aan de mug is deze test echter niet geschikt voor de schatting van de werkzaamheid van een specifieke interventie in een specifieke populatie. Andere testen zijn nodig voor metingen van dergelijke praktische weerstand15.
Aanpassingsvermogen van het specimen:
Deze methode kan worden toegepast op andere belangrijke geleedpotigen zoals gewasplagen (bijv. Coloradokever), huisongedierte (bijv. Kakkerlakken en bedwantsen) of bestuivers (bijv. Bijen) met eenvoudige veranderingen in de knockdown-aanpak en / of insecticide dosis, volume en / of concentratie (zoals hierboven beschreven). Het gemak van aanpassingsvermogen kan helpen bij het analogiseren van onderzoek naar insecticideresistentie in verschillende onderzoeksgebieden. Het gebruik van een LD50-waarde in plaats van een dodelijke concentratie die 50% van de monsters doodt (LC50) maakt een nauwkeurige vergelijking tussen soorten mogelijk.
Kosten:
Net als bij CDC-flesbioassays en WHO-buistests zijn de kosten voor het uitvoeren van de actuele toepassingstest minimaal (zie de tabel met materialen). De essentiële uitrustingsstukken zijn de spuit (ongeveer $ 70) en de dispenser (ongeveer $ 100), die herbruikbaar zijn voor alle testen.
Aantal benodigde exemplaren:
Er moeten minimaal 20-25 monsters worden gebruikt per topische toepassingstestbeker. Per experiment wordt aanbevolen om minimaal vijf insecticideconcentraties te testen, met een minimum van drie replicaties die voor de procedure worden aanbevolen. Over het algemeen resulteert dit in een minimum van 300-375 monsters die nodig zijn voor een volledige test, vergelijkbaar met het aantal monsters dat nodig is om weerstandsintensiteitstests uit te voeren met behulp van WHO-buistests of CDC-flesbioassays. Als echter verminderde variabiliteit wordt bereikt met de topische toepassingsbioassay, kan hetzelfde aantal monsters leiden tot meer statistische kracht om gevoeligheidsgegevens in ruimte of tijd te vergelijken.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door een CAREER award van de National Science Foundation aan SH onder awardnummer 2047572. We bedanken Damien Rivera voor zijn hulp bij het fokken van fruitvliegen en de voorbereiding op actuele toepassingstests, Dr. Ganetzky aan de Universiteit van Wisconsin-Madison voor het delen van zijn Canton-S fruitvliegenstam, de Centers for Disease Control and Prevention voor het delen van de Rockefeller-stam en het United States Department of Agriculture Center for Medical Agricultural and Veterinary Entomology voor het delen van de IICC-isolinestam. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thomas Scientific | 20A00L068 | Acetone aliquot storage |
| 1.5 mL screw cap tubes | Thomas Scientific | 1182K23 | Insecticide dilution storage |
| 15 mL conical tubes | VWR | 339651 | Insecticide dilution storage |
| 20 mL glass scintillation vials | Fisher Scientific | 0334125D | Fruit fly weighing |
| 25 μL syringe | Fisher Scientific | 14815288 | Topical applicator |
| Acetone | Fisher Scientific | AC423240040 | ACS 99.6%, 4 L |
| Aedes aegypti (IICC strain) | USDA CMAVE | NA | Insecticide resistant |
| Aedes aegypti (Rockefeller strain) | CDC | NA | Insecticide susceptible |
| Analytical scale | Fisher Scientific | 14-557-409 | Precision up to 0.1 mg |
| Aspirator | Amazon | 6.49986E+11 | Mosquito collection device |
| Bench paper | VWR | 89126-794 | Place under workspace |
| Cotton swabs | Amazon | B092S8JVQN | Use for sorting insects |
| Cotton wool balls | Amazon | B0769MKZWT | Use for sucrose solution |
| Dispenser | Fisher Scientific | 1482225 | Repeater pipettor |
| Drosophila melanogaster (Canton-S strain) | University of Wisconsin-Madison | NA | Insecticide susceptible |
| Fine-tipped paint brushes | Amazon | B07KT2X1BK | Use for sorting insects |
| Fruit fly stock bottles | Fisher Scientific | AS355 | Use for rearing and sorting fruit flies |
| Hand-held CO2 dispenser | Fisher Scientific | NC1710679 | Use for knocking down insects |
| Holding cups | Amazon | B08DXG7V1S | Clear plastic |
| Ice pack | Amazon | B08QDWMMW5 | Use for knocking down fruit flies |
| Ice trays | Amazon | 9301085269 | Use for knocking down insects |
| Insect forceps | Amazon | B07B4767WR | Insect forceps |
| Insecticide | Sigma-Aldrich Inc | 45423-250MG | Deltamethrin |
| Labeling stickers | Amazon | B07Q4X9GWX | 3/4" Color dot stickers |
| Labeling tape | Amazon | B00X6A1GYK | White tape |
| Netting | Amazon | B07F2PHHWV | Use for covering holding cups and insect handling tent |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712H371 | 100 mm x 15 mm |
| PVC Pipe | Lowe’s | 23971 | Insect handling tent materials |
| Rubber bands | Amazon | B00006IBRU | Use for securing mesh/net on cups |
| Sucrose | Amazon | B01J78INO0 | Granulated White Sugar |
| Weighing paper | VWR | 12578-165 | 4" x 4" |
References
- World Health Organization. Vector-borne diseases. World Health Organization. , (2020).
- World Health Organization. Global plan for insecticide resistance management in malaria vectors. World Health Organization. , (2012).
- Liu, N. Insecticide resistance in mosquitoes: impact, mechanisms, and research directions. Annual Review of Entomology. 60 (1), 537-559 (2015).
- Hemingway, J., Ranson, H. Insecticide resistance in insect vectors of human disease. Annual Review of Entomology. 45 (1), 371-391 (2000).
- World Health Organization. Monitoring and managing insecticide resistance in Aedes mosquito populations. World Health Organization. , (2016).
- World Health Organization. Test procedures for insecticide resistance monitoring in malaria vector mosquitoes (Second edition). World Health Organization. , (2016).
- McAllister, J. C., Scott, M. CONUS manual for evaluating insecticide resistance in mosquitoes using the CDC bottle bioassay kit. Centers for Disease Control and Prevention. , (2020).
- Duneau, D., et al. Signatures of insecticide selection in the genome of Drosophila melanogaster. G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (11), 3469-3480 (2018).
- Pittendrigh, B., Reenan, R., ffrench-Constant, R. H., Ganetzky, B. Point mutations in the Drosophila sodium channel gene para associated with resistance to DDT and pyrethroid insecticides. Molecular & General Genetics: MGG. 256 (6), 602-610 (1997).
- Rinkevich, F. D., Du, Y., Dong, K. Diversity and convergence of sodium channel mutations involved in resistance to pyrethroids. Pesticide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 93-100 (2013).
- Lissenden, N., et al. Review and meta-analysis of the evidence for choosing between specific pyrethroids for programmatic purposes. Insects. 12 (9), 826 (2021).
- Owusu, H. F., Chitnis, N., Müller, P. Insecticide susceptibility of Anopheles mosquitoes changes in response to variations in the larval environment. Scientific Reports. 7 (1), 3667 (2017).
- Brito-Sierra, C. A., Kaur, J., Hill, C. A. Protocols for testing the toxicity of novel insecticidal chemistries to mosquitoes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e57768 (2019).
- Burgess, E. R., King, B. H., Geden, C. J. Oral and topical insecticide response bioassays and associated statistical analyses used commonly in veterinary and medical entomology. Journal of Insect Science. 20 (6), 1-9 (2020).
- Namias, A., Jobe, N. B., Paaijmans, K. P., Huijben, S. The need for practical insecticide-resistance guidelines to effectively inform mosquito-borne disease control programs. eLife. 10 (1), 65655 (2021).
- Zhu, X., et al. Manipulating solid forms of contact insecticides for infectious disease prevention. Journal of the American Chemical Society. 141 (1), 16858-16864 (2019).
- Dang, K., Singham, G. V., Doggett, S. L., Lilly, D. G., Lee, C. Y. Effects of different surfaces and insecticide carriers on residual insecticide bioassays against bed bugs, Cimex spp. (Hemiptera: Cimicidae). Journal of Economic Entomology. 110 (2), 558-566 (2017).
- Spielmeyer, A., Schetelig, M. F., Etang, J. High-throughput analysis of insecticides on malaria vectors using liquid chromatography tandem mass spectrometry. PLoS ONE. 14 (2), 0211064 (2019).
- Bagi, J., et al. When a discriminating dose assay is not enough: measuring the intensity of insecticide resistance in malaria vectors. Malaria Journal. 14 (1), 210 (2015).
- Pridgeon, J. W., Becnel, J. J., Clark, G. G., Linthicum, K. J. Permethrin induces overexpression of multiple genes in Aedes aegypti. Journal of Medical Entomology. 46 (3), 1-8 (2009).
- World Health Organization. Guidelines for efficacy testing of insecticides for indoor and outdoor ground-applied space spray applications. World Health Organization. , (2009).
- Estep, A. S., et al. Quantification of permethrin resistance and kdr alleles in Florida strains of Aedes aegypti (L.) and Aedes albopictus (Skuse). PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (10), 0006544 (2018).
- Waits, C. M., et al. A comparative analysis of resistance testing methods in Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) from St. Johns County, Florida. Florida Entomologist. 100 (3), 571-577 (2017).
- Kostromytska, O. S., Wu, S., Koppenhöfer, A. M. Diagnostic dose assays for the detection and monitoring of resistance in adults from Listronotus maculicollis (Coleoptera: Curculionidae) populations. Journal of Economic Entomology. 111 (5), 2329-2339 (2018).
- Aktar, W., Sengupta, D., Chowdhury, A. Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards. Interdisciplinary Toxicology. 2 (1), 1-12 (2009).
- Maïga, H., et al. Guidelines for routine colony maintenance of Aedes mosquito species. IAEA Physical and Chemical Sciences. , (2017).
- Gjullin, C. M., Hegarty, C. P., Bollen, W. B. The necessity of a low oxygen concentration for the hatching of aedes mosquito eggs. Journal of Cellular Physiology. 17 (2), 193-202 (1941).
- Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420 (1), 27-44 (2008).
- Jass, A., Yerushalmi, G. Y., Davis, H. E., Donini, A., MacMillan, H. A. An impressive capacity for cold tolerance plasticity protects against ionoregulatory collapse in the disease vector Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 222 (1), 214056 (2019).
- Bartholomew, N. R., Burdett, J. M., Vandenbrooks, J. M., Quinlan, M. C., Call, G. B. Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia. Scientific Reports. 5 (1), 15298 (2015).
- Jung, Y., Kennedy, A., Chiu, H., Mohammad, F., Claridge-Chang, A., Anderson, D. J. Neurons that function within an integrator to promote a persistent behavioral state in Drosophila. Neuron. 105 (2), 322-333 (2020).
- Aldridge, R. L., Kaufman, P. E., Bloomquist, J. R., Gezan, S. A., Linthicum, K. J. Impact of topical application site on the efficacy of permethrin and malathion to Culex quinquefasciatus. Journal of the American Mosquito Control Association. 32 (4), 300-307 (2016).
- Rinkevich, F. D., et al. Distinct roles of the DmNav and DSC1 channels in the action of DDT and pyrethroids. Neuro Toxicology. 47 (1), 99-106 (2015).
- Balmert, N. J., Rund, S. S. C., Ghazi, J. P., Zhou, P., Duffield, G. E. Time-of-day specific changes in metabolic detoxification and insecticide resistance in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Journal of Insect Physiology. 64 (1), 30-39 (2014).
- R Core Team. R: a language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. R Core Team. , (2021).
- Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PLoS ONE. 10 (12), 0146021 (2015).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of the American Mosquito Control Association. 3 (2), 302-303 (1987).
- Ravichandran, S. Data analysis through SAS with special emphasis on Probit analysis. National Academy of Agricultural Research Management (NAARM). , (2021).
- Smith, L. B., et al. CYP-mediated resistance and cross-resistance to pyrethroids and organophosphates in Aedes aegypti in the presence and absence of kdr. Pesticide Biochemistry and Physiology. 160 (1), 119-126 (2019).
- Finney, D. J. . Probit Analysis. , (1971).
- Silva, J. J., Kouam, C. N., Scott, J. G. Levels of cross-resistance to pyrethroids conferred by the Vssc knockdown resistance allele 410L+1016I+1534C in Aedes aegypti. PLOS Neglected Tropical Diseases. 15 (7), 0009549 (2021).
- Fan, Y., Scott, J. G. The F1534C voltage-sensitive sodium channel mutation confers 7- to 16-fold resistance to pyrethroid insecticides in Aedes aegypti. Pest Management Science. 76 (1), 2251-2259 (2020).
- Miller, A. L. E., Tindall, K., Leonard, B. R. Bioassays for monitoring insecticide resistance. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2129 (2010).
- Glunt, K. D., et al. Long-lasting insecticidal nets no longer effectively kill the highly resistant Anopheles funestus of southern Mozambique. Malaria Journal. 14 (1), 298 (2015).
- ffrench-Constant, R. H., Roush, R. T., Roush, R. T., Tabashnik, B. E. Resistance detection and documentation: the relative roles of pesticidal and biochemical assays. Pesticide Resistance in Arthropods. , (1990).
- Akdag, K., et al. Synthesis and larvicidal and adult topical activity of some hydrazide-hydrazone derivatives against Aedes aegypti. Marmara Pharmaceutical Journal. 18 (1), 120-125 (2014).
- Richards, S. L., Byrd, B. D., Reiskind, M. H., White, A. V. Assessing insecticide resistance in adult mosquitoes: perspectives on current methods. Environmental Health Insights. 14 (1), (2020).
- Cooperband, M., Golden, F., Clark, G., Jany, W., Allan, S. Prallethrin-induced excitation increases contact between sprayed ultra-low volume droplets and flying mosquitoes (Diptera: Culicidae) in a wind tunnel. Journal of Medical Entomology. 47 (1), 1099-1106 (2010).
- Barbosa, D. S., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. Evaluation of attractive toxic sugar baits (ATSB) against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in laboratory. Tropical Biomedicine. 36 (2), 578-586 (2019).
