局部应用生物测定以量化蚊子和果蝇的杀虫剂毒性

注：杀虫剂可对人类、动物和环境造成危害25.强烈建议谨慎、训练和个人防护装备。请务必遵循所有所用杀虫剂和溶剂的材料安全数据表。 1. 后部试样 3-5天大的成年蚊子。注：以下议定书 反映了埃及伊 蚊养殖的条件，严格遵守联合国粮食及农业组织准则26。 所有生命阶段的后蚊子在27±1°C和75±5%相对湿度下，12：12小时明暗循环。 通过将蚊子卵浸入去离子水中并加入酵母26来孵化蚊子卵，或将淹没的卵放在真空室中30分钟。注意：这两种方法都降低了水中的氧含量，并增加了27的孵化率。 在托盘内喂养新孵化的幼虫鱼食（或同等的饲料，如磨碎的猫肉），并保持托盘之间的幼虫密度尽可能相似，因为幼虫密度影响发育12 （例如，每个托盘200-250幼虫，总共含有1.5升水）。 每隔一天喂食幼虫，直到它们达到蛹阶段（约7-10天），根据需要增加食物量。注意：当喂食太少时，幼虫的生长会受到阻碍，幼虫可能会互相吃掉。当喂食过多时，幼虫可能会死亡，导致水变臭。 一旦蛹发育，每天将它们转移到成年蚊笼中的水碗中， 并随意提供10%的蔗糖溶液。 记录成人出苗的第一天。在出苗开始后2天从笼中取出剩余的蛹。注意：雄性蚊子出现得更快。注意男性和女性的出现，并确保每个测试都有足够的男性和女性。 取出蛹后等待3天，以达到3-5天大的蚊子进行测试。 尾果蝇（松散地遵循苏黎世大学28的协议）。 后 果蝇 在23±1°C和60±5%相对湿度下在储备瓶中，12：12小时光照和黑暗循环。注意： 果蝇 储备瓶应含有75毫升标准苍蝇培养基，首先将其作为液体倒入瓶底，然后凝固过夜。 每两周将菌落转移到装有新鲜食物的新高汤瓶中，以防止人口过剩和霉菌生长。为此，使用手持式二氧化碳（CO2）分配器击倒苍蝇，将麻醉后的苍蝇转移到冰袋或冷却台上的称重纸上，然后使用细尖的画笔将苍蝇刷入新鲜的汤瓶中。在此过程中，请务必将瓶子放在侧面，以防止苍蝇掉入食物中并溺水身亡。 2. 使用重量法制备杀虫剂制剂 在通风橱内使用精度为0.1 mg的分析秤，按照重量法制备第一个储备溶液。注意：重量法使用质量来测量杀虫剂和溶剂的添加量。标准做法（体积法）将需要一个分析秤来测量在制备第一个储备溶液时添加的（固体）杀虫剂的量;但是，加入的溶剂量和所有后续稀释液仅按体积测量。重量法具有更高的精度，因此是首选。 确定第一个储备溶液的目标杀虫剂浓度和目标体积（如果使用15 mL锥形管以防止储存在冰箱中时溢出，则建议最大10 mL），并使用等式（1）计算要添加多少杀虫剂活性成分（AI）：   （1） 准备一个储存管（对于较大体积，建议使用15 mL锥形管，对于1 mL或更小体积，建议使用1.5 mL微量离心机螺旋盖管），并用杀虫剂和溶剂名称，目标浓度和制备日期标记。将管子和盖子放在架子或支架内的秤上，然后对秤进行去皮处理。 称取步骤2.1.1确定的所需固体或液体杀虫剂AI的量。（例如，用于代表性数据的溴氰菊酯）进入管中并记录质量。 将秤去皮并向管中加入所需体积的溶剂（相当于目标体积），立即关闭盖子，并记录质量。加入溶剂（此处使用的丙酮）后立即关闭管盖，以避免蒸发并混合溶液。 记录室温。一些溶剂，如丙酮，可以根据温度在体积（以及密度）上发生显着变化。 如果立即储存，请将管盖包裹在parafilm中（以减少蒸发），将其放在管架/支架中（以保持直立并防止泄漏），盖在箔中（以防止紫外线照射），将其放在可重复密封的塑料袋中（以减少蒸发），并将袋子放在-20°C的冰箱中。如果不立即存放，请确保盖子固定并盖在铝箔或避光容器中。 通过将添加的杀虫剂AI的质量除以添加的溶剂体积（如果是液体形式的杀虫剂的体积）来计算储备溶液的实际浓度（mg / mL）。要计算添加的溶剂（或液体杀虫剂）的体积，请将添加的质量除以适合记录温度的已知密度。 通过将添加的总质量（杀虫剂和溶剂）除以添加的总体积（溶剂和杀虫剂，如果是液体形式）来计算储备溶液的密度（g / mL）。请参阅步骤2.1.7，将液体质量转换为体积。 通过10%稀释剂连续稀释初始储备溶液。如果需要，使用这些连续稀释液创建初始剂量 – 反应曲线，以确定生物测定的杀虫剂浓度的目标范围。 计算杀虫剂储备溶液和要添加到每个管中的溶剂的体积（例如，将1 mL杀虫剂储备溶液稀释在9 mL溶剂中，以10 mL稀释至先前浓度的10%）。 涡旋储备溶液10秒。在秤上将预先标记的第一个稀释管去皮。使用移液器将所需体积的储备溶液加入第一个稀释管中。立即关闭两个试管的盖子，并将质量记录在第一个稀释管中。 再次将第一个稀释管去皮，并加入所需体积的溶剂。立即盖上盖子，记录所加入溶剂的质量，并涡旋第一次稀释10秒。 对剩余的稀释液重复步骤2.2.2和2.2.3。 按照上述步骤2.1.6中所述储存所有稀释液。 按照步骤2.1.7计算稀释液的实际浓度。 通过将添加的总质量（杀虫剂溶液和溶剂）除以添加的总体积（杀虫剂溶液和溶剂）来计算每种杀虫剂稀释液的密度。对于每个连续稀释，使用先前的杀虫剂原液稀释的密度来计算新稀释液的密度，其密度如下方程 （2）： (2) 可选：通过连续稀释以较小的增量创建杀虫剂稀释。 选择每种新溶液的浓度和体积，以借助初始连续稀释液，先前试验或已发表文献的剂量 – 反应曲线进行制作。注意：所选浓度的死亡率范围应为 0-100%，此范围内至少有三个浓度，以便进行 Probit 分析。 使用连续稀释液作为储备溶液进行每次新的稀释，并按照步骤2.2在10倍稀释度之间创建新的稀释度。 可选：等分杀虫剂溶液。如果制造了大量杀虫剂溶液，请将溶液等分到1.5 mL螺旋盖管中，以避免频繁处理和暴露在光线下污染，蒸发和降解储备溶液。 从最低浓度开始等分溶液，并努力达到最高浓度以减少潜在的污染。在打开之前通过涡旋10秒将每种储备溶液混合，并将所需体积（例如，0.5 mL）移液到预标记的螺旋盖管中。 将等分试样储存在-20°C冰箱中的耐光容器中。注意：建议定期（每月）用直接从库存农药稀释液中取出的小新等分试样替换等分试样。这将限制在工作台上使用样品时，污染被带到其他实验中或由于蒸发或紫外线降解而发生变化的可能性。只要杀虫剂溶液正确储存（见步骤2.1.6）并保存在-20°C冰箱中，该方案就可以在此处暂停，甚至在几年后重新启动。 在储存前使用永久性记号笔标记半月板，以监测溶剂蒸发。当去除杀虫剂溶液以制成等分试样时，每次取出溶液时都要标记半月板。 3. 准备局部应用生物测定工作区 注意：建议在台式昆虫处理帐篷中工作，以便更容易捕获逃跑的蚊子或苍蝇。有关昆虫处理帐篷的图像，请参见 补充图 S1 。 从冰箱中取出所需的杀虫剂溶液，立即涡旋，并将其置于室温下的耐光容器中，让杀虫剂在使用前加热到室温。注意：杀虫剂AI可以在较冷的温度下与溶剂分离。此外，丙酮体积随温度而变化，这可能会改变所施用的杀虫剂剂量。混合溶液并使其加热到室温有助于确保使用杀虫剂溶液时的一致性。 列出在材料表中引用的昆虫处理帐篷中进行局部应用测定所需的所有 工具和材料。 用分析级丙酮清洁注射器桶和针头，每个丙酮等分试样完成5次洗涤。用5个单独的等分试样完成此操作，总共25次洗涤。参见 补充图S2 ，了解注射器和中继器移液器部件。 设置5个微量离心管，每个管含有0.5 mL丙酮。 用第一根管中的0.025 mL丙酮填充注射器桶，然后通过迅速向下推柱塞将丙酮排入废物容器中。再重复四次，从同一丙酮等分试样中完成总共五次丙酮洗涤。然后，用空气完全填充注射器桶，并将空气和潜在的丙酮残留物排出到废物容器中。再重复两次，用空气完成三次“洗涤”。 对剩余的4管丙酮重复步骤3.3.2。 在注射器柱塞和针头顶部之间的枪管内创建一个气穴，方法是将柱塞稍微拉入枪管（~5 mm）。注意：该气穴可防止柱塞接触杀虫剂溶液，并减少杀虫剂残留。 将注射器放在一边，直到准备用于局部应用。 创建一个包含要应用的剂量的密钥，并在随机数或字母生成器之后分配随机ID（请参阅 补充文件1）。 用随机ID标记塑料保温杯，以进行盲人死亡率评估。注意：如果需要，可以在此处暂停协议，并在以后的日期和时间重新启动。如果在暂停时间超过几个小时，鼓励重复步骤3.3以确保注射器清洁，并将杀虫剂溶液放回冰箱中，直到给药前约一小时给药，然后重复步骤3.1。 4.为局部生物测定准备标本。有关过程概述，请参见图 1 对蚊子进行分类和称重 使用由吸入吸入力驱动的吸气器，吸出测定所需的所需数量的3-5天大成年蚊子，包括过量的蚊子以解释受损个体。通过将吸气器的尖端放入管中，将蚊子转移到锥形管中（每管最多100只蚊子），并将棉花包裹在尖端，然后轻轻呼气并轻拍吸气器。当吸气器尖端被移除时，使用棉花堵塞管子，然后用盖子盖住。避免一次用过多的蚊子填充吸气器和管子，因为这会增加蚊子的额外压力并可能导致死亡。 通过在4°C下放置至少10分钟或将它们埋在冰盘中的冰下，短暂地击倒管中的蚊子。注意：蚊子可以在2°C下保持数小时，最低死亡率为29;然而，最好尽量减少蚊子在冰上的持续时间，以减少潜在的负面影响。 将被击倒的蚊子转移到昆虫处理帐篷中，并小心地将蚊子倒在放在冰上的塑料托盘（例如培养皿）上。一次只倒入大约50只蚊子，以确保每只蚊子都接触到它下面的凉爽托盘并保持被击倒。 按性别对蚊子进行分类，用镊子轻轻地用腿（或翅膀）捡起它们，并将每种性别放入单独的保管杯中。在分类时计算每种性别的蚊子数量，并在达到所需数量时停止。在分类时，清除任何受伤（例如，缺腿）或超大（例如，腹部异常增大）或小（用肉眼容易区分为小于该种群的平均蚊子大小）的蚊子。注意：通过附属物处理蚊子可减少对其柔软的初级体（例如腹部）的结构损伤。 使用精度为0.1mg的分析秤记录每杯蚊子的重量。 在秤上放一个空杯子，用培养皿作为盖子，然后去皮。将蚊子倒入容器中，将盖子放在顶部，然后将容器放在秤上。 在评分表上记录标本的总重量和数量（参见 补充文件2）。立即将标本杯放回冰上，以保持固定。 重复步骤4.1.5.1-4.1.5.2，直到称量所有杯状试样。 将准备好的蚊子分成20-25组，放在单独的杯子上，放在标有随机ID的冰上。在转移蚊子时，要减少镊子造成的压力和物理伤害。理想情况下，仅使用镊子将蚊子捡起1-2次：一次用于分拣/称重，第二次用于转移到实验杯中。注意：每个杯子的理想蚊子数量为20-25只，这足以重复，对于评估死亡率是合理的，并且不应导致杯中密度引起的应激/死亡。 对果蝇进行分类和称重 使用CO2 麻醉苍蝇7秒。注意：如果苍蝇暴露于CO2 超过7秒，当它们醒来30时，它们可能会有爬行和飞行的困难。 将苍蝇倒在用长凳纸包裹的冰袋上，用细尖的画笔分离并计数雄性和雌性。 使用画笔轻轻地捡起选择的苍蝇，并将它们放入干净的空汤瓶中。选择相同数量的雄性和雌性果蝇（例如，15只雄性和15只雌性），并在库存瓶上标有菌株名称和果蝇总数（例如，Canton-S，30只果蝇）。注意：拥有相同数量的雌性和雄性果蝇是很重要的，因为雄性果蝇在从雌性31的存在中移除后，可能会经历对彼此的高度攻击。因此，为了避免非杀虫剂的死亡或伤害，最好有相同数量的雄性和雌性（或完全省略雄性果蝇）。 使用分析秤记录每瓶果蝇的重量。 将一个空的小瓶（标有随机ID，请参阅步骤3.4）放在秤上，用培养皿作为盖子，并将秤去皮。注意：建议将玻璃瓶与果蝇一起使用，因为它们可显着减少静电。 使用CO2 麻醉对应于小瓶随机ID的果蝇瓶7秒。 将果蝇倒在称量纸上，并将纸用作漏斗，将果蝇引入小瓶中。将培养皿盖放在果蝇小瓶的顶部，并将其放在秤上。 在记分表上记录标本的总重量和数量，然后立即将果蝇小瓶放入一盘冰中，盖子仍然在上面以防止果蝇逃跑。 对每瓶果蝇重复步骤4.2.4.1-4.2.4.4。 完成上述步骤后，请立即转到下一部分。 5. 剂量标本 在注射器中装入适当的杀虫剂浓度。从浓度最低的剂量开始，并努力使每组生物体达到最集中的剂量。为防止浪费，只需在注射器中装入所需体积的杀虫剂外加推荐的额外 2 μL。 将标本倒在放在冰上托盘上的称量纸上。使用干净、不含杀虫剂的画笔或棉签分离紧密在一起的标本，以便于获取每个标本进行给药。对于蚊子，也要使用画笔来确保每个标本都放在它们的背上，并且它们的腹面朝上。 使用注射器，将一滴杀虫剂溶液（或丙酮用于对照）施加到蚊子的腹侧胸部和腹部区域以及果蝇的背部。对较小的昆虫（如果蝇）应用0.2μL液滴（需要10μL注射器），对蚊子使用0.5μL液滴（需要25μL注射器）。注意：与附属物（如翅膀、腿或长鼻）相比，主要身体部位（如头部、胸部和腹部）之间的杀虫剂敏感性没有显著差异32。因此，只要将剂量液滴施加到原体上，施用部位就不必精确。腹侧胸部和腹部区域是为蚊子选择的，因为它们在被击倒时经常躺在背侧，而果蝇则选择背侧，因为它们在被击倒时经常躺在腹侧。应用部位特异性的降低有助于提高该方法的通量。 立即将标本倒回标记的塑料杯中，并用网和橡皮筋盖住杯子。将杯子放入保温盘中，并在杯子上注明在此过程中被杀死，损坏或逃脱的任何标本（以将其排除在该杯子中标本的最终计数中）。对于第一个杯子，记录配料完成的时间。 更换放置标本的称量纸，以避免两次剂量之间的杀虫剂污染。 对每个杯子重复加药，直到所有试样都用适当的杀虫剂浓度加药，并记录所有试样的给药结束时间。 通过浸泡的棉球为每杯提供10%蔗糖溶液，并将杯子放在一边，直到第二天评估死亡率。将蚊子储存在27±1°C，相对湿度为 75±5%，果蝇在23±1°C，相对湿度为60±5%。注意：挤压棉球时要小心，以避免过度饱和或饱和度不足。棉球应该是湿的，但不是滴水的。杯中滴下糖水会导致标本死亡，从而影响杀虫剂的死亡率评估。 6. 评估死亡率 记录杀虫剂暴露开始后24小时的标本死亡率。如果蚊子可以飞翔并保持直立，则将其归类为活的蚊子;如果他们不动或共济失调（无法站立或起飞飞行），如世卫组织6号所描述的那样死亡。遵循相同的果蝇死亡率评估8，33。注意：为了评估延迟死亡率，还可以在48和72小时后通过每日糖水变化来评估死亡率。 记录死亡率后，将所有标本杯放在密闭袋中，在冰箱中冷冻至少1小时，以确保所有标本在处置或随后使用（例如，分子或化学分析）之前都已死亡。 7. 执行复制 在一组新的标本上重复步骤3-6，注意每天在同一时间进行重复，因为杀虫剂的易感性可能会根据第34天的时间而变化。 确保每种浓度至少重复3次，以准确估计杀死50%标本的致死剂量（LD50）。如果观察到高水平的变异性，则包括更多重复。 收集完所有数据后完成分析。 8. 分析结果 在电子表格程序中记录数据，并使用随机 ID 键取消屏蔽数据（参考步骤 3.4）。将数据保存为文本文件（参见 补充文件3中的示例数据），以便在统计程序R35 （参见 补充文件4中的示例R代码）或其他选择的软件36中进行分析。 在软件程序中，完成以下分析。有关示例 R 代码，请参阅 补充文件 4 。 按照以下等式（3）计算每个标本质量（mg）的杀虫剂（ng）剂量： （3） 计算死亡率并应用雅培公式37 来校正相对于在每个对照37 中观察到的死亡率的死亡率。或者，使用Schneider-Orelli（1947）公式来校正死亡率38。使用任一公式，无论每个对照的死亡率如何，都将校正应用于所有数据，如前所述37 和实施的39，除非对照数据异常高（见下面的讨论）。注意：雅培公式和等效的替代方案（如施耐德-奥雷利公式）根据对照中未观察到的死亡率程度按比例调整死亡率值，并且不会导致死亡率为100%的杯子的死亡率降低。有关详细信息，请参阅这些公式的引用参考文献。 将校正后的死亡率数据转换为概率单位值40 ，并在杀虫剂剂量和转换后的死亡率数据之间执行线性回归。使用卡方检验来评估线性模型的拟合。注意：在完成概率转换之前，将从数据中删除死亡率值 0（0% 死亡率）或 1（100% 死亡率）。由于概率转换的性质，这是必要的。因此，图表数据将不包括阳性或阴性对照或任何其他导致 0% 或 100% 死亡率的数据（在应用 Abbott 的校正后）。 按照先前发表的方法39，41，42计算每个标本菌株，群体和/或性别的LD50和95%可信区间（CI）。 注意：如果两个菌株的95%CI不重叠，则菌株具有显着不同的剂量反应。 如果适用，通过将目标应变的LD50 除以参考/对照应变的LD50 来计算电阻比（RR）。 图1：局部应用测定方案图。 局部应用测定方案首先：（A）在冰上分拣标本，然后（B）在分析秤上称量标本，（C）用杀虫剂溶液给样，以及（D）杀虫剂暴露后24小时的等待期， 随意 获得10%蔗糖溶液（通过浸泡的棉球），然后进行死亡率评估。红色箭头表示蚊子（左）和果蝇（右）的目标杀虫剂施用位置。请注意，图像不是要缩放的。 请点击此处查看此图的大图。