بروتوكول نمذجة الأروميات البشرية تطوير وزرع الكيسة الأريمية
Summary
بروتوكول يحدد تكوين الأروميات البشرية التي تولد بكفاءة وفي الوقت المناسب وبالتتابع خلايا تشبه الكيسة الأريمية.
Abstract
ومن شأن نموذج الكيسة الأريمية البشرية المتكون من الخلايا الجذعية (blastoid) أن يدعم التقدم العلمي والطبي. ومع ذلك ، فإن قوتها التنبؤية تعتمد على قدرتها على تلخيص تسلسل تطور الكيسة الأريمية بكفاءة وفي الوقت المناسب وبأمانة (التشكل ، المواصفات ، النمط) ، وتشكيل خلايا تعكس مرحلة الكيسة الأريمية. هنا نظهر أن الخلايا الجذعية البشرية الساذجة متعددة القدرات المستزرعة في ظروف PXGL ثم تثبيطها ثلاث مرات لفرس النهر ، وتحويل عامل النمو – β ، ومسارات كيناز خارج الخلية المنظمة بالإشارة تخضع بكفاءة للتشكل لتشكيل الأروميات (>70٪). مطابقة مع توقيت النمو (~ 4 أيام) ، تقوم الأروميات بفتح تسلسل الكيسة الأريمية للمواصفات عن طريق إنتاج نظائر الأرومة الغاذية و epiblast ، تليها تشكيل نظائر للأديم الباطن البدائي والأرومات الغاذية القطبية. هذا يؤدي إلى تكوين خلايا مشابهة نسخيا للكيسة الأريمية (>96٪) وأقلية من نظائرها بعد الزرع. تنتظم الأروميات بكفاءة عن طريق تشكيل المحور الجنيني غير الجنيني الذي يتميز بنضج المنطقة القطبية (NR2F2 +) ، والذي يكتسب القدرة المحددة على الالتصاق اتجاهيا بخلايا بطانة الرحم المحفزة هرمونيا ، كما هو الحال في الرحم. مثل هذا البلاستويد البشري هو نموذج قابل للتطوير ومتعدد الاستخدامات وأخلاقي لدراسة التنمية البشرية والزرع في المختبر.
Introduction
وقد حد الافتقار إلى النماذج التجريبية من فهم التكوين الجنيني البشري المبكر. تستمد المعرفة الحالية بالجوانب الخاصة بالإنسان من التطور الجنيني من فائض أجنة الإخصاب في المختبر (IVF) المتبرع بها للبحث. ومع ذلك ، فإن التوافر المحدود ، وصعوبات التلاعب التجريبي ، والجودة المتغيرة للأجنة تعيق التحقيقات العلمية. على العكس من ذلك ، فإن النموذج المخلص في المختبر للأجنة البشرية سيسمح بالتلاعب التجريبي المعقد ، وبالتالي توفير فرصة أخلاقية لاستكمال البحث على الأجنة البشرية1،2،3،4. نموذج تم تطويره سابقا من الكيسة الأريمية للفئران يجمع بين الخلايا الجذعية الجنينية للفئران والخلايا الجذعية الأرومة الغاذية5. في هذا البروتوكول المفصل ، يتم وصف طريقة لتوليد نموذج للكيسة الأريمية البشرية من الخلايا الجذعية الساذجة متعددة القدرات المخلصة لمعايير الكيسة الأريمية الأولية6.
أربعة معايير للأروميات البشرية. هنا ، في محاولة لوضع تعريف موحد للأروميات البشرية ، نقترح أربعة معايير دنيا. وعلى الرغم من أن هذه المعايير ليست شاملة، إلا أنها قد تكون بمثابة أساس لتقييم البارامترات التي تسمح بتكوين الأروميات البشرية (الشكل 1 ألف). (1) يجب أن تتشكل الأروميات بكفاءة من حيث التشكل وتوليد نظائرها من السلالات الثلاثة وهي epiblast (Epi) ، trophectoderm (TE) ، والأديم الباطن البدائي (PrE). من المرجح أن يشير عدم الكفاءة إلى حالة خلية أولية غير كافية و / أو حالة استزراع (على سبيل المثال ، وسط الأرومي). (2) يجب أن تولد الأروميات نظائر من السلالات الثلاثة وفقا للتسلسل التنموي (Epi / TE أولا ، PrE / polarTE الأخير) 7,8 والتوقيت (الحث ~ 3 أيام ؛ الأيام الجنينية 5-7) 7,9. (3) يجب أن تشكل الأروميات نظائرها لمرحلة الكيسة الأريمية ، ولكن ليس لمراحل ما بعد الزرع (على سبيل المثال ، الخلايا الأرومة الغاذية أو الخلايا السلوية بعد الزرع). (4) وأخيرا، ينبغي أن تكون الأروميات قادرة على تلخيص السمات الوظيفية لزرع الكيسة الأريمية وتطويرها. باستخدام هذا البروتوكول ، تتشكل الأروميات البشرية بكفاءة باستخدام خطوط خلايا متعددة (>70٪) ، وتكون قادرة على توليد نظائر الكيسة الأريمية الخلوية بالتتابع وفي غضون 4 أيام ، والنظيرات تشبه نسخيا مرحلة الكيسة الأريمية (>96٪ بناء على عدة تحليلات) 6،10،11. وأخيرا، تولد الأروميات بقوة المحور الجنيني الأبجيني، مما يسمح لها بالتفاعل مع خلايا بطانة الرحم المحفزة هرمونيا عبر المنطقة القطبية، وتوسيع السلالات بقوة عند الثقافة الموسعة (ما يعادل الوقت: اليوم الجنيني 13).
أهمية حالة الخلية الأولية. يمكن تثبيت الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) في حالات مختلفة تحاول التقاط مراحل نمو دقيقة. يتم الحفاظ على هذه الحالات من خلال ظروف الاستزراع التي ، على الرغم من أنها لا تزال دون المستوى الأمثل ، تقيد الخلايا في مرحلة ما قبل الزرع (~ الأيام الجنينية 5-7) أو ما بعد الزرع الشبيهة (~ الأيام الجنينية 8-14) المرحلة12. أظهر التحليل النسخي أن hPSCs المستزرعة في PD0325901 و XAV939 و Gö6983 وعامل تثبيط سرطان الدم (LIF ؛ يطلق عليها اسم PXGL hPSCs الساذجة) 13,14 هي أكثر تشابها مع epiblast الكيسة الأريمية بالمقارنة مع hPSCs المستزرعة في عامل نمو الخلايا الليفية (FGF) 2 و activin 15 (تسمى hPSCs12) والخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات الموسعة (hEPSCs)16 (انظر التحليل في المراجع 17 ، 18، 19). وفقا لذلك ، فإن نسخة hPSCs الجاهزة تتطابق بشكل أفضل مع cynomolgus20 بعد الزرع / ما قبل المعدة. أكدت معايير جزيئية إضافية ، مثل تعبير transposon ، ومثيلة الحمض النووي ، وحالة كروموسوم X ، أن الاختلافات في الحالة الساذجة تشبه إلى حد كبير أببلاست الكيسة الأريمية مقارنة بالحالة الجاهزة 17,21. وأخيرا ، تم اشتقاق خطوط hPSCs الساذجة بنجاح مباشرة من الكيسة الأريمية باستخدام ظروف زراعة PXGL22.
خلايا الكيسة الأريمية البشرية المبكرة لم تلتزم بعد. تحدث مواصفات سلالة المورين من مرحلة المورولا التي تسبق مرحلة الكيسة الأريمية23. على العكس من ذلك ، أظهرت تجارب التفكك وإعادة التجميع أن خلايا الأديم التغذي البشري للكيسات الأريمية المبكرة لم يتم ارتكابها بعد24. وبناء على ذلك، أظهر تحليل خلايا الكيسة الأريمية البشرية عن طريق تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNAseq) أن مواصفات السلالة الأولى (الأرومة الغاذية/الأرومة النجمية) تحدث بعد تكوين تجويف الكيسة الأريمية7. ترتبط هذه المواصفات البشرية المؤجلة بالملاحظات التي تفيد بأن hPSCs قوية لتشكيل الأرومات الغاذية25،26،27 عندما تكون PSCs الفئران ملتزمة إلى حد كبير بسلالة epiblast. أدت هذه الملاحظات مجتمعة إلى احتمال أن تعكس hPSCs الساذجة مرحلة الكيسة الأريمية وتحتفظ بإمكانية تشكيل سلالات الكيسة الأريمية الثلاثة. في الآونة الأخيرة ، تم اقتراح فعالية hPSCs لتحديد نظائرها خارج الجنين للتحول من الأديم التغذي إلى السلى أثناء التقدم من الحالة الساذجة إلى الحالة الجاهزة27. وبالتالي ، فإن hPSCs الساذجة تشبه إلى حد كبير مرحلة ما قبل الزرع 17،18،21 ولديها قدرة معززة على تكوين الأرومة الغاذية مقارنة ب hPSCs 27 ، hEPSCs16 ، أو الحالات المتوسطة المعاد برمجتها 28 ، والتي هي عرضة لتشكيل نظائر ما بعد الزرع 10 (الشكل 1B ). وبالتالي فإن حالة الخلية الأولية حاسمة لتشكيل النظائر خارج الجنين المناسبة. على الرغم من أنه لا يزال يتعين إجراء تحليل شامل جنبا إلى جنب لنظائر الأديم المحول ، إلا أن حالة PXGL الساذجة التي تعكس الكيسة الأريمية المبكرة تبدو مهمة لتشكيل أروميات عالية الدقة.
حث المواصفات والتشكل عن طريق تثبيط مسارات الإشارة. إن تثبيط مسار إشارات فرس النهر هو آلية محفوظة تقود مواصفات الأرومة الغاذية في الفئران والأبقار والبشر9،29،30. أيضا ، منذ عام 2013 ، من المعروف أن تثبيط NODAL (A83-01) وكيناز خارج الخلية المنظمة بالإشارة (ERK; PD0325901 أو ما يعادلها) وتنشيط مسارات إشارات البروتين المورفوجيني العظمي (BMP) يؤدي إلى تحفيز hPSCs الجاهزة لتنشيط شبكة النسخ المرتبطة بسلالة الأرومة الغاذية 25,31,32,33,34. علاوة على ذلك ، أكدت العديد من التقارير مؤخرا أيضا أن تثبيط كل من مسار NODAL و ERK وتنشيط BMP يسهل تمايز الأرومة الغاذية عن hPSCs الساذجة25،31،32،33،34. أخيرا ، إذا تم تشغيل مواصفات الأرومة الغاذية من حالة ساذجة ، فإن الخلايا تلخص جوانب التقدم التنموي للأديم الغاذ26. ومع ذلك، لم تستقر خطوط التجديد الذاتي التي تعكس الأديم التغذي للأديم الأريمي في المختبر. بعد مواصفات الأرومة الغاذية ، فإن تحريض مسار عامل نمو البشرة (EGF) ومسارات إشارات Wnt جنبا إلى جنب مع تثبيط HDAC قد يسهل التقدم التنموي للأرومة الغاذية34,35 واستقرار الخلايا في خطوط من الخلايا الجذعية للأرومة الغاذبية البشرية (hTSCs) التي تعكس الأرومات الغاذبية الخلوية بعد الزرع 18,35. يمكن اشتقاق هذه الخطوط من كل من الكيسة الأريمية وأنسجة المشيمة35.
يتم تحديد السلالة الثانية خارج الجنين ، والتي تسمى PrE ، بعد الأرومات الغاذية وتنشأ من epiblast 7,9. على عكس الفئران PrE36 ، يعتقد أن النظير البشري مستقل عن إشارات FGF37,38. تم إنشاء خطوط تعكس الأديم الباطن خارج الجنين (تسمى nEnd) من hPSCs الساذجة عن طريق تحريض مسارات الإشارات باستخدام activin A و Wnt و LIF39. غير متسق مع تجارب تثبيط الجنين ، فقد ثبت أن تثبيط ERK يمنع تكوين خلايا nEND هذه في المختبر39. حتى الآن ، لم يتم اشتقاق هذه الخطوط مباشرة من الكيسة الأريمية.
في الآونة الأخيرة ، تم تشكيل نماذج من الجنين المبكر من خلال الجمع بين الاختلافات في الوسائط التي تم تطويرها سابقا لخلايا hTSCs35 و nEND39 وبالتالي استخدام منشطات β عامل النمو المحول (TGF-β) ، EGF ، ومسارات إشارات Wnt28,40. تتشكل نماذج الأجنة هذه بكفاءة منخفضة (10٪ -20٪) وتشكل خلايا تشبه مرحلة ما بعد الزرع بدلا من مرحلة ما قبل الزرع 10 ، بما في ذلك نظائر الأرومة النجمية بعد الزرع ، الأرومة الغاذية ، السلى ، المعدة ، أنسجة الجلد المتوسط (~ اليوم الجنيني 14) ، والأرومات الغاذبيةالخلوية 10. على العكس من ذلك ، فإن التثبيط الثلاثي لمسارات Hippo و ERK و TGF-β يوجه بكفاءة تكوين الأروميات التي تضم خلايا تشبه الكيسة الأريمية41. جنبا إلى جنب مع حالة الخلية الأولية ، نقترح أن تثبيط المسارات الثلاثية (فرس النهر ، ERK ، TGF-β) هو المعلمة الأساسية الثانية لتشكيل الأروميات عالية الدقة (الشكل 1B).
تقييم حالة الخلية والمرحلة المنعكسة باستخدام scRNAseq. يمكن تقييم حالات الخلايا المكونة للأروميات من خلال تحليل scRNAseq. يمكن قياس تشابهها النسخي مع مراحل جنينية محددة باستخدام الخلايا الأريمية وحدها وبالمقارنة مع hPSCs أو hTSCs الجاهزة التي تعكس مراحل ما بعد الزرع20,35. يكشف إجراء تحليلات المجموعات باستخدام مستويات مختلفة من التعريف عن كيفية اندماج المجموعات الفرعية تدريجيا عندما ينخفض التعريف ، وبالتالي الكشف عن أوجه التشابه بين المجموعات. على الرغم من أن الأمثل في عدد المجموعات يمكن قياسه42 ، إلا أن التجمعات عالية الدقة تبلغ أيضا عن الوجود النهائي لمجموعات فرعية صغيرة غير طبيعية ، على سبيل المثال تعكس مراحل ما بعد الزرع10. يمكن للجينات التي يتم التعبير عنها بشكل تفاضلي بين المجموعات أن توفر معلومات عن نظائرها في عملية التطوير من خلال تقييم مستويات التعبير عن مجموعات الجينات المرجعية التي تحدد الأنساب الخاصة بالمرحلة. وهذا يسمح بقياس إثراء المجموعات الفرعية للأروميات إما من خلال خرائط المسافة غير الخاضعة للإشراف (على سبيل المثال، باستخدام الجينات الغنية العليا) أو عن طريق تحليل إثراء مجموعة الجينات (GSEA)43. باستخدام بروتوكول الأريمات هذا ، تتشكل ثلاث مجموعات رئيسية فقط تعكس نسخيا سلالات الكيسة الأريمية الثلاثة. تتضمن إحدى المجموعات كلا من hPSCs الساذجة الأولية والتناظرية epiblast للأروميات. أظهر تحليل الخلايا في نقاط زمنية مختلفة الطبيعة المتسلسلة لمواصفات الأنساب (تبدأ الأرومات الغاذية في التحديد في غضون 24 ساعة ، وخلايا الأديم الباطن البدائية في غضون 60 ساعة). استوعب تجمع عالي الدقة مجموعة فرعية من الخلايا (3.2٪) تعبر عن جينات خاصة بأجنة مرحلة المعدة (ربما الأديم المتوسط أو السلى). تجدر الإشارة إلى أن hPSCs الساذجة الأولية شكلت أيضا 5٪ من الخلايا الشبيهة بمرحلة ما بعد الزرع ، كما هو موضح سابقا44. في تحليل ثان ، يمكن دمج الخلايا البلاستويدية في سيليكو مع الخلايا المرجعية المعزولة من concepti في مراحل مختلفة45،46،47 من أجل استنتاج تكافؤ المرحلة. هنا ، تم استخدام الخلايا المعزولة من مفهوم ما قبل الزرع 45,46 ، في المختبر الأريمية المستزرعة45 ، والأجنة في مرحلة المعدة47 كنقاط مرجعية. باستخدام هذا البروتوكول ، تم تحديد كمية أن الخلايا الأريمية غير المتطابقة التي كشفت عنها التجمعات عالية الدقة تتجمع بالفعل مع الأديم المتوسط والسلى بعد الزرع. في الخطوات المستقبلية ، يجب استكمال قياس النسخ بتحليل تعبير transposon ، ومثيلة الحمض النووي ، وحالة الكروموسوم X التي توفر أيضا معالم المراحل التنموية21.
تقييم تكوين المحور والوظائف الأخرى للأروميات البشرية. تتميز الكيسة الأريمية الناضجة بتكوين الأرومات الغاذية ذات المحور الجنيني غير الجنيني للزرع. باستخدام بروتوكول الأروميات هذا ، يتشكل محور بقوة يتمثل في نضج الأرومات الغاذية القريبة (على سبيل المثال ، NR2F2 + / CDX2-) التي تكتسب القدرة على الالتصاق بالخلايا العضوية لبطانة الرحم فقط عندما يتم تحفيزها هرمونيا48,49. تظهر المقارنة مع الأكروسفير التي لا تشكل الأبلوبلاست أن هذه الخلايا الداخلية تحفز الأرومات الغاذية المتاخمة على النضج من أجل التوسط في الارتباط الأولي ببطانة الرحم. عند استزراعها في وسط استزراع ممتد مصمم للكيسات الأريمية للقرد cynomolgus50 ، فإن جميع السلالات الثلاثة من الأروميات تتوسع باستمرار لمدة ستة أيام إضافية (أي ما يعادل الوقت لليوم 13) على الرغم من أن تنظيمها لا يعكس تلك المرحلة التنموية.
الآثار المترتبة على الأروميات البشرية عالية الكفاءة وعالية الدقة. إن الحفاظ على المبادئ التنموية التي تم اكتشافها في الكائنات الحية النموذجية أمر صعب الاختبار بطبيعته في المفهوم البشري بسبب محدودية الوصول والصعوبات التقنية في التلاعب به وراثيا وجسديا. ومن شأن نموذج بلاستويد عالي الكفاءة وعالي الدقة أن يسمح بإجراء فحوصات جينية ودوائية عالية الإنتاجية، والتي هي أساس الاكتشافات العلمية والطبية الحيوية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن إدراج تعديلات وراثية معقدة لتغيير العمليات البيولوجية وتسجيلها من شأنه أن يكمل هذه الدراسات. بشكل عام ، نقترح أن يكون التثبيط الثلاثي (فرس النهر ، TGF-β ، ERK) ل PXGL hPSCs الساذج موصلا للتكوين الفعال للأروميات البشرية عالية الدقة التي تتوافق مع المعايير الأربعة الدنيا. إن الطبيعة القابلة للتطوير والمتعددة الاستخدامات لهذا البروتوكول تجعله مناسبا لإنشاء فرضيات مستهدفة يمكن بعد ذلك التحقق من صحتها باستخدام الكيسة الأريمية البشرية. على هذا النحو ، لن تحل الأروميات البشرية محل استخدام المفهوم البشري للبحث في المختبر ولكنها قد تعمل كوسيلة قوية لتوجيه البحث من خلال مناهج تجريبية لم يكن من الممكن الوصول إليها سابقا في قلب عملية الاكتشاف العلمي والطبي الحيوي. يوضح البروتوكول كيفية تكوين الأروميات البشرية وكذلك كيفية تحليل الخلايا الموجودة داخل البلاستويد.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة ، نعرض ، خطوة بخطوة ، كيفية إنشاء الأروميات البشرية ذات الكفاءة العالية باستخدام بروتوكول بسيط وقوي. عند تجميع HPSCs الساذجة PXGL وتثبيطها الثلاثي ، تتشكل الأروميات بكفاءة (> 70٪) وتولد بالتتابع نظائر الكيسة الأريمية 3 في غضون 4 أيام. يمكن أن تحدث قيود في كفاءة وجودة الأروميات (على سبيل المثال ، وجود خلايا خارج الهدف) إذا كانت الحالة الأولية دون المستوى الأمثل. تجدر الإشارة إلى أننا قمنا بقياس أن PXGL hPSCs يحتوي على حوالي 5٪ من الخلايا التي تعكس مراحل ما بعد الزرع. قد تحد هذه الخلايا من تكوين الأروميات عالية الجودة. بالإضافة إلى حالة PXGL الساذجة الأولية التي تعكس البلاستيدات الكيسية الأريمية ، هناك عامل محوري آخر هو الوسط المستخدم لتشكيل الأروميات. من أجل تشكيل خلايا تشبه الكيسة الأريمية بسرعة ومنع تكوين خلايا شبيهة بالخلايا غير المستهدفة ، بعد الزرع ، نقترح أن تثبيط المسارات الثلاثية (فرس النهر ، ERK ، TGF-β) أمر ضروري. في حين أن خطوط الخلايا المختلفة تعطي غلات مختلفة من الأروميات على تثبيط ERK / TGF-β (عموما حوالي 10٪ -20٪) ، فإن التعرض ل LPA يؤدي إلى تكوين عائد أرومي مرتفع بنفس القدر عبر جميع خطوط الخلايا ، مع استخدام معايير صارمة لمواصفات المورفومترية والنسب. ربما يعمل LPA على تثبيط مسار فرس النهر ، الذي يلعب دورا حاسما في الفصل الأول بين السلالات الأبلاستية و trophectoderm في الفأر والإنسان 8,51. يشير التحسن الكبير في كفاءة الأريمية بواسطة LPA إلى أن آليات مواصفات الخلية الداخلية والخارجية بوساطة مسار فرس النهر في اللعب في الكيسة الأريمية يتم اختيارها أثناء تكوين الأريمية. يكمن أحد القيود الحالية في حقيقة أنه نظرا لوجود ما دون المستوى الأمثل للبروتوكولات المستخدمة لزراعة الكيسة الأريمية البشرية أو الأروميات في اليوم المكافئ للوقت 7-13 (بعد تكوين الكيسة الأريمية / الأريمية) ، فإننا لسنا قادرين على تقييم إلى أي مدى يمكننا نمذجة تطور ما بعد الزرع بشكل صحيح.
يمكن بسهولة تحقيق تحليل الحالة النسخية للخلايا الأريمية باستخدام scRNAseq والخرائط المرجعية الكافية وطرق المعلوماتية الحيوية. في السابق ، أظهر التحليل النسخي أن hPSCs المستزرعة في PXGL هي أكثر تشابها مع ابيبلاست الكيسة الأريمية مقارنة بالحالة الجاهزة. يمكن أن تحدث قيود في تحليل البيانات إذا كانت الخريطة المرجعية تضم فقط خلايا مرحلة الكيسة الأريمية. يجب أن تتضمن الخريطة المرجعية الخلايا الناشئة عن أجنة ما بعد الزرع من أجل تقييم وجود خلايا محتملة خارج الهدف. في المستقبل ، من أجل قياس الخلايا الأريمية ، ستكون الخريطة المرجعية التي تشمل جميع أنسجة المفهوم البشري قبل وبعد الزرع قيمة للغاية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الخرائط المرجعية متعددة الخلايا الواحدة، بما في ذلك النسخ على سبيل المثال، وإمكانية الوصول إلى الكروماتين، ومثيلة الحمض النووي، من شأنها أن تساعد بشكل أكبر. وأخيرا، فإن الأساليب المعلوماتية الحيوية الموحدة لتقييم أوجه التشابه بين الخلايا من نماذج الأجنة والمفاهيم المرجعية بشكل كمي، وتحديد الخلايا غير المستهدفة بشكل إيجابي من شأنها أن تساعد بشكل أكبر على تحليل النتائج ومقارنتها بشكل غير متحيز.
إجمالا، تمتلك الأروميات التي تشكلت عن طريق التثبيط الثلاثي لمسارات فرس النهر و TGF-β و ERK السمات الأربع ل 1) التشكل عالي الكفاءة ، 2) التسلسل الصحيح لمواصفات النسب ، 3) النقاء العالي للخلايا الشبيهة بالكيسة الأريمية على مستوى النسخ ، 4) القدرة على نمذجة تطور ما حول الزرع. هذه الميزات من الأروميات سوف تسهل بناء فرضيات على تطور الكيسة الأريمية وزرعها ، ومع ذلك ، فإنها لا تلخص المراحل المبكرة من التطور الجنيني. وعلى النقيض من محدودية إمكانية الوصول إلى الكيسة الأريمية البشرية وتنوعها، فإن الكيسة الأريمية قابلة للفحص الجيني والدوائي للتحقيقات الوظيفية لتطور الكيسة الأريمية وزرعها. وفي المستقبل، يمكن أن تسهم هذه المعرفة الأساسية في تحسين صياغة وسائط التلقيح الاصطناعي، وتطوير وسائل منع الحمل بعد الإخصاب، وتحسين إدارة الحمل المبكر.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تلقى هذا المشروع تمويلا من مجلس البحوث الأوروبي (ERC) في إطار برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي (اتفاقية منحة ERC-Co رقم 101002317 “BLASTOID: منصة اكتشاف للتكوين الجنيني البشري المبكر”). يتم دعم H.H.K. من قبل صندوق العلوم النمساوي (FWF) ، برنامج ليز مايتنر M3131-B. نشكر ياسوهيرو تاكاشيما على مشاركة خطوط الخلايا H9 و H9-GFP ، وأوستن سميث وبيتر أندروز وجي قوه لمشاركة خطوط الخلايا HNES1 و Shef6 و niPSC 16.2b و cR-NCRM2. نشكر حسين باهارفاند على مشاركة عضويات بطانة الرحم. نشكر جوشوا م. بريكمان على مشاركة الحمض النووي الريبي المعزول من الخلايا المتمايزة PrE وخلايا nEND. نشكر شانكار سرينيفاس على مشاركة بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لجنين ما حول المعدة. نشكر ألكساندر بيكوف ولويزا كوشيلا على المساعدة التقنية لإعداد مكتبة SMARTSeq2. نشكر مرفق NGS و Biooptic و Stem Cell في IMBA على المساعدة الحاسمة.
Materials
| Neurobasal media | in house | ||
| DMEM/F12 | in house | ||
| 100X N2 supplemen | Gibco | 17502048 | |
| 50X B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
| 100X Glutamax | Gibco | 35050038 | |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360039 | |
| MEM-Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| 1 M Hepes | in house | ||
| 50 mM 2-Mercaptoethanol | Thermofisher | 31350010 | |
| 100X Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| PD0325901 | Medchem express | HY-10254 | |
| XAV-939 | Medchem express | HY-15147 | |
| Gö 6983 | Medchem express | HY-13689 | |
| Human recombinant Leukemia Inhibitory Factor | in house | ||
| A83-01 | Medchem express | HY-10432 | |
| 1-Oleoyl Lysophosphatidic acid (LPA) | Peprotech | 2256236 | |
| Y-27632 | Medchem express | HY-10583 | |
| CMRL medium | Gibco | 21530027 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Thermofisher | 10-828-028 | |
| Accutase | Biozym | B423201 | cell detachment solution |
| Geltrex | Thermofisher | A1413302 | growth factor basement membrane extract |
| TROP2 antibody | R&D systems | MAB650 | |
| PDGFRα antibody | R&D systems | AF307 | |
| SC-144 | Axon | 2324 | |
| XMU-MP-1 | Med Chem Express | HY-100526 | |
| Matrigel | basement membrane matrix | ||
| Countess cell counting chamber slides | Thermo fisher | cell counting slides | |
| DAPI Staining Solution | Miltenyi Biotec | 130-111-570 |
References
- Rivron, N., et al. Debate ethics of embryo models from stem cells. Nature. 564 (7735), 183-185 (2018).
- Hyun, I., Munsie, M., Pera, M. F., Rivron, N. C., Rossant, J. Toward Guidelines for Research on Human Embryo Models Formed from Stem Cells. Stem Cell Reports. 14 (2), 169-174 (2020).
- Clark, A. T., et al. Human embryo research, stem cell-derived embryo models and in vitro gametogenesis: Considerations leading to the revised ISSCR guidelines. Stem Cell Reports. 16 (6), 1416-1424 (2021).
- Lovell-Badge, R., et al. ISSCR Guidelines for Stem Cell Research and Clinical Translation: The 2021 update. Stem Cell Reports. 16 (6), 1398-1408 (2021).
- Rivron, N. C., et al. Blastocyst-like structures generated solely from stem cells. Nature. 557 (7703), 106-111 (2018).
- Kagawa, H., et al. Human blastoids model blastocyst development and implantation. Nature. , 04267-04268 (2021).
- Meistermann, D., et al. Integrated pseudotime analysis of human pre-implantation embryo single-cell transcriptomes reveals the dynamics of lineage specification. Cell Stem Cell. 28 (9), 1625-1640 (2021).
- Gerri, C., et al. Initiation of a conserved trophectoderm program in human, cow and mouse embryos. Nature. 587 (7834), 443-447 (2020).
- Gerri, C., Menchero, S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. A., Niakan, K. K. Human Embryogenesis: A Comparative Perspective. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 411-440 (2020).
- Zhao, C., et al. Reprogrammed iBlastoids contain amnion-like cells but not trophectoderm. bioRxiv. , 2021.05.07.442980 (2021).
- Zijlmans, D. W. Integrated multi-omics reveal polycomb repressive complex 2 restricts human trophoblast induction. Nat. Cell Biol. 24, 858-871 (2022).
- Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4 (6), 487-492 (2009).
- Guo, G., et al. Epigenetic resetting of human pluripotency. Development. 144 (15), 2748-2763 (2017).
- Takashima, Y., et al. Resetting transcription factor control circuitry toward ground-state pluripotency in human. Cell. 158 (6), 1254-1269 (2014).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Yang, Y., et al. Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency. Cell. 169 (2), 243-257 (2017).
- Stirparo, G. G., et al. Integrated analysis of single-cell embryo data yields a unified transcriptome signature for the human pre-implantation epiblast. Development. 145 (3), 158501 (2018).
- Castel, G., et al. Induction of Human Trophoblast Stem Cells from Somatic Cells and Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 33 (8), 108419 (2020).
- Posfai, E., et al. Evaluating totipotency using criteria of increasing stringency. Nature Cell Biology. 23 (1), 49-60 (2021).
- Nakamura, T., et al. A developmental coordinate of pluripotency among mice, monkeys and humans. Nature. 537 (7618), 57-62 (2016).
- Theunissen, T. W., et al. Molecular Criteria for Defining the Naive Human Pluripotent State. Cell Stem Cell. 19 (4), 502-515 (2016).
- Guo, G., et al. Naive Pluripotent Stem Cells Derived Directly from Isolated Cells of the Human Inner Cell Mass. Stem Cell Reports. 6 (4), 437-446 (2016).
- Rossant, J. Genetic Control of Early Cell Lineages in the Mammalian Embryo. Annual Review of Genetics. 52, 185-201 (2018).
- De Paepe, C., et al. Human trophectoderm cells are not yet committed. Human reproduction. 28 (3), 740-749 (2013).
- Amita, M., et al. Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 1212-1221 (2013).
- Io, S., et al. Capturing human trophoblast development with naive pluripotent stem cells in vitro. Cell Stem Cell. 28 (6), 1023-1039 (2021).
- Guo, G., et al. Human naive epiblast cells possess unrestricted lineage potential. Cell Stem Cell. 28 (6), 1040-1056 (2021).
- Liu, X., et al. Modelling human blastocysts by reprogramming fibroblasts into iBlastoids. Nature. 591 (7851), 627-632 (2021).
- Hirate, Y., et al. Polarity-dependent distribution of angiomotin localizes Hippo signaling in preimplantation embryos. Current biology: CB. 23 (13), 1181-1194 (2013).
- Cockburn, K., Biechele, S., Garner, J., Rossant, J. The Hippo pathway member Nf2 is required for inner cell mass specification. Current Biology: CB. 23 (13), 1195-1201 (2013).
- Xu, R. H., et al. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast. Nature Biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).
- Krendl, C., et al. GATA2/3-TFAP2A/C transcription factor network couples human pluripotent stem cell differentiation to trophectoderm with repression of pluripotency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 9579-9588 (2017).
- Xu, R. H., et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nature Methods. 2 (3), 185-190 (2005).
- Horii, M., Bui, T., Touma, O., Cho, H. Y., Parast, M. M. An Improved Two-Step Protocol for Trophoblast Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 50 (1), 96 (2019).
- Okae, H., et al. Derivation of Human Trophoblast Stem Cells. Cell Stem Cell. 22 (1), 50-63 (2018).
- Yamanaka, Y., Lanner, F., Rossant, J. FGF signal-dependent segregation of primitive endoderm and epiblast in the mouse blastocyst. Development. 137 (5), 715-724 (2010).
- Kuijk, E. W., et al. The roles of FGF and MAP kinase signaling in the segregation of the epiblast and hypoblast cell lineages in bovine and human embryos. Development. 139 (5), 871-882 (2012).
- Roode, M., et al. Human hypoblast formation is not dependent on FGF signalling. 发育生物学. 361 (2), 358-363 (2012).
- Linneberg-Agerholm, M., et al. Naïve human pluripotent stem cells respond to Wnt, Nodal and LIF signalling to produce expandable naïve extra-embryonic endoderm. Development. 146 (24), (2019).
- Yu, L., et al. Blastocyst-like structures generated from human pluripotent stem cells. Nature. 591 (7851), 620-626 (2021).
- Yanagida, A., et al. Naive stem cell blastocyst model captures human embryo lineage segregation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1016-1022 (2021).
- Zappia, L., Oshlack, A. Clustering trees: a visualization for evaluating clusterings at multiple resolutions. GigaScience. 7 (7), (2018).
- Subramanian, A., et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (43), 15545-15550 (2005).
- Messmer, T., et al. Transcriptional Heterogeneity in Naive and Primed Human Pluripotent Stem Cells at Single-Cell Resolution. Cell Reports. 26 (4), 815-824 (2019).
- Zhou, F., et al. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).
- Petropoulos, S., et al. Single-Cell RNA-Seq Reveals Lineage and X Chromosome Dynamics in Human Preimplantation Embryos. Cell. 167 (1), 285 (2016).
- Tyser, R. C. V., et al. A spatially resolved single cell atlas of human gastrulation. bioRxiv. , (2020).
- Turco, M. Y., et al. hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
- Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
- Ma, H., et al. In vitro culture of cynomolgus monkey embryos beyond early gastrulation. Science. 366 (6467), (2019).
- Nishioka, N., et al. The Hippo signaling pathway components Lats and Yap pattern Tead4 activity to distinguish mouse trophectoderm from inner cell mass. Developmental Cell. 16 (3), 398-410 (2009).
