Гравитационный метод транскардиальной перфузии для гистологического анализа центральной нервной системы мыши

Данные и экспериментальные шаги, представленные в этом протоколе, были сгенерированы с использованием мышей C57BL/6J. Все методы с участием животных были одобрены Государственным университетом Нью-Йорка Upstate Medical University Institutional Animal Care and Use Committee. 1. Строительство перфузионного аппарата и платформы для рассечения Как показано на рисунке 1, обрежьте внутренние соломинки от двух бутылок для мойки по 500 мл, разрезав их заподлицо на внутреннюю сторону навинчиваемого колпачка острым лезвием бритвы. Вырежьте квадратное отверстие размером 4 см х 4 см на дне каждой буферной бутылки. Вырежьте небольшое отверстие на дне каждой бутылки, чтобы пропустить изогнутый микропаток из нержавеющей стали. Создайте S-образный изгиб в микропатулах, чтобы их можно было использовать в качестве крючков для подвешивания буферных бутылок. Вставьте согнутые микропатули в соответствующие отверстия в буферных флаконах. Отрежьте две трубки длиной 25 см и плотно соедините их с наружными выходами из соломы бутылки. Соедините концы этих трубок вместе с разъемом Y. Отрежьте 2 м трубки и присоедините ее к свободному концу разъема Y. Снимите поршень со шприца объемом 1 мл и отрежьте шприц примерно на расстоянии 6 см от кончика шприца. Разрежьте шприц, сначала забив пластик лезвием бритвы, а затем резко щелкнув пластиком шприца. Вставьте разрезанную поверхность шприца в свободный конец пластиковой трубки. Вставьте на достаточную глубину, чтобы обеспечить плотное уплотнение.ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы все соединения внутри перфузионного аппарата были достаточно плотными, чтобы избежать утечки. В случае свободных соединений небольшие зажимы для шлангов из нержавеющей стали могут быть размещены и затянуты на соединениях по желанию, чтобы обеспечить плотное уплотнение в случае необходимости. Пометьте одну буферную бутылку как PFA и одну бутылку как PBS (буфер). Измерьте приблизительно 1/3длины от отверстия бутылки и проведите линию вокруг окружности бутылки в этой точке, чтобы обозначить соответствующий уровень наполнения растворов перфусата. Выпрямите, а затем создайте петлю в большой скрепке, которая может поместиться по окружности трубки. Поместите эту петлю вокруг трубки непосредственно рядом со шприцем. Поместите блок пенополистирола соответствующего размера в стеклянный лоток. Поместите концы скрепки в блок из пенополистирола, чтобы прикрепить трубку. Используя бумажные полотенца, поднимите передний конец стеклянного лотка примерно на 2 см.ПРИМЕЧАНИЕ: Это поместит мышь примерно в 20° от положения Тренделенбурга (наклон назад), чтобы облегчить визуализацию диафрагмы во время рассечения и стимулировать дренаж жидкостей во время перфузии. Рисунок 1: Диаграмма, изображающая собранный перфузионный аппарат. Сокращения: PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор; PFA = параформальдегид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. 2. Приготовление раствора параформальдегида (ПФА) ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор PFA должен быть приготовлен свежим в день перфузии и выброшен в конце перфузии в специально отведенном контейнере для отходов перед удалением обученным персоналом. Этот протокол составляет 1 л 4% раствора PFA, что достаточно для перфузии примерно 4 мышей. PFA очень токсичен, и необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать вдыхания или прямого контакта с кожей в порошкообразной или жидкой форме. Поэтому большинство этапов подготовки выполняются в перчатках, защитных очках и лабораторном халате под вытяжным капюшоном. Промойте стакан объемом 1 л, используя дистиллированную воду, и залейте примерно 800 мл 18 мОм молекулярно-биологического класса H2O. Нагревайте стаканH2Oв микроволновой печи в течение 3 мин или до тех пор, пока температура воды не достигнет 65 °C. Поместите на нагревательную/перемешивающую пластину, хранящуюся в вытяжке. Промойте стержень перемешивания дистиллированной водой и поместите его в горячую воду. Запустите мешалку и переверните горячую плиту до среднего огня. Убедитесь, что температура воды не превышает 70 °C. Наденьте хирургическую маску, перчатки, защитные очки и лабораторный халат и отмерьте 40 г порошка PFA. Налейте этот порошок в нагретую воду. Используя трансферную пипетку, добавьте в раствор несколько капель 5 M NaOH. Дайте порошку PFA полностью раствориться. Если порошок не полностью растворился через несколько минут, добавляют капли по 5 М NaOH по мере необходимости. Как только почти весь PFA растворится (будет казаться слегка мутным), прекратите перемешивание / нагрев и немедленно добавьте 100 мл 10x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS). Наконец, доливайте воду до отметки 1 л на стакане, используя 18 мОм молекулярно-биологического класса H2O. Накройте стакан полиэтиленовой пленкой и поместите его в морозильную камеру с температурой -20 °C, пока раствор не достигнет комнатной температуры (приблизительно 45 мин). Откалибруйте рН-метр с использованием соответствующих стандартов. Пока стакан находится на перемешивающей пластине, измерьте рН раствора и добавляйте HCl до тех пор, пока рН не достигнет 7,4. При необходимости добавляют 5 М NaOH для повышения рН, если он слишком низкий. Подключите вакуумную колбу для вакуума и поместите в колбу чистую керамическую воронку Бюхнера с фильтровальной бумагой. Включите вакуум и смочите фильтровальную бумагу с помощью передаточной пипетки, заполненной 4% раствором PFA. Медленно вылейте 4% раствор PFA на фильтровальную бумагу, пока весь раствор не будет отфильтрован. Переложите отфильтрованный раствор в чистую, защищенную от света емкость и храните при температуре 4 °C до использования (хранить не дольше 24 ч). 3. Транскардиальная перфузия «без насоса» В вытяжной шкаф поместите рассекающий блок из пенополистирола в стеклянный лоток. Убедитесь, что рассекающий блок имеет 5-6 коротких игл для удержания мыши во время операции и 2 длинные иглы для поддержки перфузионной трубки. Промыть перфузионный аппарат дистиллированной водой. Дайте всей воде стечь, прежде чем повесить перфузионный аппарат. Повесьте перфузионные флаконы на 1 м выше перфузированного животного (для мыши весом 20-30 г). Приготовьте нестерильный раствор 1x PBS с использованием 10x PBS, разбавленный 18 мОм молекулярно-биологического класса H2O. Как показано на фиг.2, зажмите основную линию перфузионного аппарата с помощью гемостата. Зажмите линию PFA другим гемостатом.ПРИМЕЧАНИЕ: Окклюзия с несколькими гемостатами может быть необходима на линию, чтобы полностью предотвратить поток. Заполните буферный контейнер 1x PBS при комнатной температуре. Поместите шприцевой конец перфузионного аппарата в стакан для сбора буфера отходов и удаления гемостата, закупоривающего основную линию (рисунок 2, слева). Позвольте PBS течь через линию, удаляя захваченный воздух, энергично постукивая по стенкам трубки. После того, как весь воздух был удален из буферных и основных линий, закройте поток, поместив гемостат на основную линию. Удалите гемостат из линии PFA и позвольте PBS течь ретроградным образом до бутылки PFA, выстукивая любые пузырьки в линии PFA (рисунок 2, середина). Продолжайте допускать PBS в линию PFA до тех пор, пока PBS не будет виден чуть выше отверстия бутылки. Закройте линию PFA гемостатом, чтобы остановить поток в бутылку PFA. Подключите иглу для инфузии бабочки к перфузионному шприцу и промывайте PBS через линию (открыв гемостат основной линии), чтобы удалить пузырьки из перфузионного шприца. Закройте гемостат основной линии. Убедитесь, что бутылка PBS теперь примерно на 1/3полна PBS. При необходимости промывайте PBS через основную линию или заполняйте больше PBS в буферную бутылку до 1/3 ее полной емкости. После того, как все пузырьки будут удалены из PBS, PFA и основных линий, заполните бутылку PFA 4% раствором PFA при комнатной температуре до черной отметки на бутылке (примерно 1/3 полной) (рисунок 2, справа). Рисунок 2: Подготовка перфузионного аппарата к перфузионной хирургии. Во-первых, закройте линию гемостата PFA и откройте гемостат на линии PBS и основной линии. Заполните PBS и удалите пузырьки из строки PBS и основной строки. Затем заполните линию PFA PBS, открыв гемостат на линии PFA и закрыв гемостат на основной линии. Удалите пузырьки в линии PFA. Наконец, закройте гемостат на линии PFA, когда PBS достигнет открытия бутылки PFA. Наполните бутылку PFA на 1/3полной PFA. Убедитесь, что уровень PBS в бутылке PBS заполнен на 1/3и либо заполните PBS, либо сливите PBS, открыв основную линию гемостата, если это необходимо. Сокращения: PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор; PFA = параформальдегид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Подготовьтесь к операции, не связанной с выживанием, очистив следующие инструменты водой с последующим 70% этанолом: большие ножницы, тонкие рассекающие ножницы, щипцы кожи, тонкие фенестрированные изогнутые щипцы. Подготовьте анестезию, поместив беспыльные салфетки в коническую трубку объемом 50 мл. В вытяжном шкафу тщательно замочите бессылевые салфетки изофлураном и поместите открытую трубку вверх ногами в стакан емкостью 500 мл. Убедитесь, что на дне стакана нет жидкого изофлурана, и выбросьте любой жидкий изофлуран перед помещением мыши в стакан. Поместите мышь в стакан и поместите полиэтиленовую пленку на отверстие, чтобы начать анестезию. Вводят анестезию до тех пор, пока мышь не перестанет дышать (примерно через 1 мин и 30 с). Когда дыхание прекратится, немедленно снимите мышь с стакана и замените колпачок на конической трубке объемом 50 мл. Убедитесь, что мышь достаточно обезболена, используя рефлекс сжатия пальца ноги. Если животное недостаточно обезболено, вводят больше изофлурана, как описано в шаге 3.15. Работая быстро, поместите мышь на блок из пенополистирола и прижмите лапы наружу, используя четыре короткие иглы (например, иглы для шприца 22 г). Подтягивая кожу живота кожными щипцами, используйте большие ножницы, чтобы прорезать брюшную стенку. Следите за тем, чтобы органы брюшной полости не были разрезаны! Продолжайте брюшной разрез преимущественно по направлению к печени. Отделите печень от передней брюшной стенки и продолжайте начальный разрез преимущественно по направлению к диафрагме. Остановите этот разрез примерно на 1 см ниже диафрагмы. Позаботьтесь о том, чтобы печень не была разрезана! Продолжайте начальный разрез латерально вверх к правой и левой сторонам диафрагмы, чтобы сделать разрез в форме «Y» (рисунок 3A). Когда разрез достигнет диафрагмы, сделайте отверстие в диафрагме с помощью тонких рассекающих ножниц и прорежьте ребра с правой стороны животного. Отрежьте ребра примерно наполовину к правой подмышечной впадине. Сделайте аналогичный, но более длинный разрез через левую сторону диафрагмы почти до всей левой подмышечной впадины. Отразите грудную стенку и прикрепите ее к блоку пенополистирола. При необходимости рассейте жир вокруг сердца, чтобы обнажить левый желудочек. Определите левый желудочек на основе относительно более светлого цвета по сравнению с правым желудочком. После идентификации левого желудочка удерживайте сердце устойчивым, используя легкое давление с помощью тонких изогнутых щипцов. Откройте гемостат основной линии, чтобы позволить PBS течь через иглу. Сразу проткните левый желудочек и убедитесь, что игла введена не более чем на 0,5 см в желудочек. При необходимости слегка отведите иглу.ПРИМЕЧАНИЕ: О точном размещении иглы в левом желудочке свидетельствует ретроградный приток крови в игольчатую трубку. Важно следить за тем, чтобы игла не была слишком глубоко вставлена в желудочек. Это может привести к ретроградному потоку через легочные вены или прокалыванию межжелудочковой перегородки. Положите трубку бабочки на X , изготовленную из пенополистирола, используя две большие иглы 18 G.ПРИМЕЧАНИЕ: Это очень важно, так как это позволит избежать движения иглы бабочки в сердце во время перфузии. Определите нижнюю полую вену, когда она выходит из печени, и перерегите ее с помощью тонких рассекающих ножниц (рисунок 3B). Как вариант, открыть правое предсердие ножницами. Немедленно откройте основную линию, чтобы начать перфузию PBS (рисунок 3C). Убедитесь, что PBS сливается с блока пенополистирола в стеклянный лоток ниже. Если этого не происходит, отрегулируйте угол лотка или блока Styrofoak, чтобы обеспечить слив жидкостей в стеклянный лоток. Продолжайте перфузию PBS до тех пор, пока жидкость, вытекающая из нижней полой вены, не останется без крови (примерно 3 мин).ПРИМЕЧАНИЕ: Правильное размещение иглы в сердце приведет к визуальному очищению крови из печени, которая превратится из красного в соломенный цвет. Если этого не происходит, это может быть исправлено путем репозиционирования иглы инфузии в левом желудочке. Небольшой разрез может быть сделан в основании вентрального хвоста для оценки качества перфузии. Правильная перфузия приведет к прозрачному PBS, вытекающему из разреза хвостового основания. Работая быстро, закройте линию PBS гемостатом и откройте линию PFA. Дайте PFA перфусировать в течение нескольких минут, пока хвост не начнет скручиваться. Как только хвост начнет скручиваться, начните 50-минутный таймер. Если хвост не сворачивается после 5 мин перфузии PFA, начните 50-минутный таймер для перфузии PFA. Контролируйте уровень PFA в бутылке непрерывно на протяжении всей перфузии, чтобы убедиться, что уровень не падает слишком низко. Заполните больше PFA во флаконе, если уровень падает ниже 2 см над крышкой бутылки. Рисунок 3: Диаграмма, изображающая транскардиальную перфузию. (А) Брюшная стенка сначала разрезается, а затем два боковых направленных разреза в сторону подмышечной впадины, образующей «Y». (B) После проникновения в грудную полость и обнажения сердца игла пропускается в левый желудочек. Затем IVC или правое предсердие транссектируется, чтобы обеспечить дренаж перфусатов после того, как они циркулируют по организму. IVC режется лучше диафрагмы. (C) Порядок введения перфузатов. Аббревиатура = IVC = нижняя полая вена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. По истечении 50 мин засекают основную линию гемостатом и выводят иглу из левого желудочка.ПРИМЕЧАНИЕ: Вся мышь жесткая в этот момент и теперь может быть помещена в маркированный контейнер с 4% PFA на ночь при 4 °C. На этом этапе можно рассеченить ткани ЦНС и поместить их индивидуально в фиксатор на ночь. В этой работе вся мышь помещается в фиксатор, так как это сокращает интервал между фиксацией и размещением при 4 °C. Это также позволяет избежать любого возможного механического искажения нервной ткани, которое может произойти, если животные предварительно рассечены до завершения ночной фиксации. 4. Рассечение ЦНС Подготовьте следующие инструменты для рассечения водой с последующим 70% этанолом: ножницы, кожные щипцы, изогнутые фенестрированные щипцы, изогнутые тонкие щипцы, прямые тонкие щипцы, тонкие ножницы. Пометьте четыре трубки на мышь следующим образом и заполните стерильной 20% сахарозой: Mouse ID, Brain 1, Mouse ID, Brain 2, Mouse ID, Lumbar, Mouse ID, Cervical. Извлеките мышь из раствора PFA и смойте ее насухо бумажным полотенцем, чтобы удалить избыток PFA. С помощью больших ножниц удалите головку мыши, разрезав шею. Поместите корпус в раствор PFA. Сохраните голову, чтобы рассечь мозг от черепа. Чтобы рассечь мозг, начните с отражения кожи черепа вперед, чтобы обнажить весь череп (рисунок 4A). Сделайте неглубокий разрез в слуховом проходе, используя тонкие рассекающие ножницы, чтобы проникнуть в череп Продолжайте этот разрез вдоль поперечной пазухи до тех пор, пока череп не будет разрезан между обоими слуховыми каналами. Сделайте разрез перпендикулярно предыдущему разрезу вдоль продольной трещины вплоть до самой ростральной части черепа (примерно между глазами). Используя фенестрированные изогнутые щипцы, отразите череп сбоку, чтобы обнажить передний мозг. Продолжайте удалять череп до тех пор, пока весь передний мозг, включая обонятельные луковицы, не будет открыт. Начните рассечение каудальной области черепа, сделав разрез через затылочную кость и медленно продолжая этот срез в сторону большого отверстия. Отразите два куска черепа сбоку, чтобы обнажить мозжечок и ствол мозга каудально (рисунок 4B). Используйте ультратонкие изогнутые щипцы, чтобы отделить обонятельные луковицы от переднего черепа и начать отслаивать мозг от основания черепа, начиная с обонятельных луковиц. Поскольку мозг отслояется от основания черепа, используйте ультратонкие щипцы, чтобы разрезать черепные нервы и позволить удалить мозг. Продолжайте отслаивать мозг от основания черепа до тех пор, пока весь неповрежденный мозг не будет удален (рисунок 4C, D). Разрежьте мозг пополам вдоль продольной трещины, чтобы отделить правое и левое полушария друг от друга (рисунок 4E,F). Поместите одно полушарие в мозг 1 трубку, а второе полушарие в мозг 2 трубки. Храните эти трубки при температуре 4 °C до тех пор, пока полушария мозга не утонут (примерно на ночь). Рисунок 4: Удаление неподвижного мозга. (А) Верхняя часть черепа. (B) Обнаженный мозг в черепе. (C) Изолированный мозг (дорсальный аспект). (D) Изолированный мозг (вентральный аспект). E) Левое полушарие (боковой аспект). F) Левое полушарие (медиальный аспект). Шкала стержней = 1 см (E и F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Чтобы рассечь спинной мозг, удалите тело мыши из PFA и промойте его насухо. Поместите мышь на рассекающий блок из пенополистирола в положении лежа и прижмите лапы к блоку с помощью четырех игл. Начните рассечение, разрезав кожу по средней линии мыши от шеи до хвоста, чтобы обнажить всю заднюю сторону. Отразите мышцы и фасции на спине, чтобы обнажить заднюю часть позвоночного столба. Начиная с самых черепных позвонков, используйте тонкие рассекающие ножницы, чтобы разрезать пластинку, избегая спинного мозга (рисунок 5A). Поместите ультратонкие изогнутые щипцы под пластинку и потяните вверх, чтобы сломать позвонки, чтобы обнажить спинной мозг (рисунок 5B). Используйте изогнутые щипцы, чтобы отразить переломы позвонков и обнажить наиболее боковые области спинного мозга. Продолжайте этот процесс для следующих позвонков, помещая ультратонкие изогнутые щипцы ниже ламины и разрывая позвонки. Продолжайте ломать позвонки до тех пор, пока весь шейный и грудной отдел позвоночника не будут обнажены (рисунок 5C). Продолжают обнажать спинной мозг до конца поясничного отдела спинного мозга (рисунок 5D). Используя острое лезвие бритвы, прорежьте весь путь через среднегрудный отдел спинного мозга. Используя ультратонкие изогнутые щипцы, трансецируют спинномозговые нервы латерально от позвоночника и фасции спереди к спинному мозгу, чтобы медленно отделить шейный спинной мозг от позвоночного столба. Продолжайте рассекать шейный спинной мозг до тех пор, пока он не освободится от позвонков (рисунок 5Е). Поместите шейно-среднегрудный отдел спинного мозга в трубку, помеченную шейным отделом. Храните эту трубку при температуре 4 °C до тех пор, пока шейный отдел спинного мозга не опустится (примерно на ночь). Продолжайте ломать грудные позвонки вплоть до конского хвоста, как описано в шагах с 4.22 по 4.25. Когда конский хвост обнажается, используйте острое лезвие бритвы, чтобы разрезать спинной мозг на 1 см ниже поясничного отдела спинного мозга (рисунок 5F). Рассекните поясничный спинной мозг от позвонков, как описано в шагах 4.26-4.27. Поместите пояснично-среднюю часть спинного мозга конского хвоста в трубку, помеченную поясничной. Храните эту трубку при температуре 4 °C до тех пор, пока поясничный отдел спинного мозга не опустится (примерно на ночь). Когда все ткани утонут в 20% сахарозы, перенесите их в меченые пробирки с 30% сахарозой, пока они не утонут или в течение 3 дней.ПРИМЕЧАНИЕ: Ткани позвоночника часто не опускаются на 30% сахарозы. Рисунок 5: Удаление неподвижных сегментов спинного мозга. (А) Начальный врез в пластинку шейных позвонков. (B) Установка изогнутых щипцов для перелома отдельных позвонков. (C) Открытый шейный отдел позвоночника. (D) Обнаженный шейный, грудной и поясничный отделы позвоночника. (E) Удаление шейного отдела позвоночника после перерезания спинномозговых нервов. (F) Разрезание крестцового отдела позвоночника. (G) Изолированный шейный отдел позвоночника. (H) Изолированный поясничный отдел позвоночника. Шкала стержней = 1 см (G и H). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. 5. Встраивание OCT и хранение тканей Для каждой мыши пометьте четыре криомольда прямоугольной формы: Идентификатор мыши, Правое полушарие, Дата встраивания; Идентификатор мыши, левое полушарие, дата встраивания; Идентификатор мыши, Шейка матки, Дата встраивания; Идентификатор мыши, поясница, дата встраивания. Установите контейнер из пенополистирола и повесьте металлическую чашку над контейнером. Заполните контейнер из пенополистирола жидким азотом примерно наполовину. Наполните металлическую чашку свежим 2-метилбутаном примерно наполовину.ПРИМЕЧАНИЕ: 2-метилбутан токсичен, очень летучий и легковоспламеняющийся. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать вдыхания путем выполнения последующих шагов в вытяжном шкафу и вдали от источников горения. Медленно опустите металлическую чашку в жидкий азот и избегайте брызг жидкого азота в металлическую чашку. Дайте 2-метилбутану начать замерзать. Пока 2-метилбутан замерзает, возьмите нужную ткань из 30% раствора сахарозы и промойте ее насухо на беспыльной салфетке. Поместите ткань в криомольд с ростральной областью, направленной в сторону верхней (немаркированной) части формы. Экономно заливайте ткань в криомольде оптимальной температуры реза при температуре встраивания среды (ОКТ), используя только достаточно, чтобы полностью покрыть ткань. Избегайте использования чрезмерного центра развертывания Office, так как это может привести к растрескиванию. Удалите все пузырьки из центра развертывания Office. Когда замороженный 2-метилбутан полностью покроет внутреннюю поверхность металлической чашки, полностью погружают криомольд в вышележащую жидкую фазу 2-метилбутана на 12 с. Через 12 секунд поместите криомоль для слива в помеченный квадрат из алюминиевой фольги и оберните весь криомольд. Немедленно поместите обернутый криомольд на сухой лед и избегайте оттаивания. Убедитесь, что замороженный OCT/криомольд всегда покрыт сухим льдом. Повторите шаги с 5.6 по 5.8 для всех тканей. Поместите ткань для одной мыши в запечатанный небольшой пластиковый пакет, а затем в криобезопасный, герметичный контейнер. Храните этот контейнер в морозильной камере с температурой -80 °C до тех пор, пока не будут разрезаны секции. 6. Криосекционирование Перед криосечением убедитесь, что температура криостатной камеры и головка образца установлены на соответствующие настройки.ПРИМЕЧАНИЕ: Температура камеры -20 °C, температура головки образца -20 °C и толщина сечения 30 мкм используются для резки срезов головного мозга. Для резки секций спинного мозга используется температура камеры -23 °C, температура головки образца -30 °C и толщина сечения 30 мкм. Важно отметить, что настройки криостата (особенно температура головки образца) должны быть скорректированы во время секционирования для решения проблем с качеством тканей. Как правило, температура головки образца понижается для коррекции для размазывания тканей. И наоборот, температура головки образца увеличивается, чтобы исправить чрезмерное скручивание тканей. Извлеките нужный блок OCT из морозильной камеры с температурой -80 °C и поместите неупакованный блок криомольда/OCT в криостатную камеру. Дайте блоку OCT акклиматизироваться к температуре камеры в течение 30 минут. Очистите патрон с 70% этанолом и протрите его насухо беспыльной салфеткой. Поместите очищенный патрон в криостатную камеру и сделайте на патроне круг OCT размером с монету. Дайте ОКТ замерзнуть (примерно 1-2 мин). Когда OCT замерзнет, поместите точку свежего OCT размером с горошину на патрон и немедленно поместите тканевый блок OCT на патрон. Убедитесь, что ткань идеально перпендикулярна патрону, прежде чем OCT полностью замерзнет.ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, самая ростральная область мозга расположена к патрону так, что сечение начинается с каудального конца. Для спинного мозга, как правило, наибольшая каудальная область помещается на патрон так, что сечение начинается с рострального конца. Когда oct затвердеет, поместите больше OCT вокруг основания блока OCT, чтобы действовать как структурная опора во время секционирования. Когда эта опора немного затвердеет, поместите патрон на головку образца и дайте блоку OCT достичь температуры головки образца в течение 30 минут. Поместите микротомное лезвие в держатель лезвия и очистите антикатальную пластину. Отрегулируйте расстояние антиката, чтобы убедиться, что ткань проходит прямо под пластиной во время сечения. Для получения дополнительной информации о правильном расположении противоролловой пластины обратитесь к руководству по криостату. После того, как блок OCT акклиматизировался к температуре головки образца, начните обрезку блока OCT до тех пор, пока ткань не будет достигнута. Когда ткань будет видна, переключитесь с обрезки на секционирование и начните резку 30 мкм секций. Отодвиньте в сторону противокатанную пластину и, используя предметное стекло микроскопа, поднимите секцию. Продолжайте резать и собирать срезы до тех пор, пока не будут удовлетворены анатомическим расположением срезов или вся ткань не будет разрезана. Поместите горки сушиться при комнатной температуре в течение 1-3 дней. После высыхания поместите слайды в коробку для слайдов и поместите эту коробку в запечатанный пластиковый пакет. Пометьте пакет идентификатором мыши и информацией о ткани перед размещением слайдов в морозильной камере с температурой -80 °C. 7. Иммунофлуоресцентное окрашивание Размораживать горки в течение 1 ч при комнатной температуре. Поместите слайды в горизонтальную слайд-банку и мойте секции 3 раза в PBS в течение 10 минут каждую стирку при комнатной температуре на шейкере. Подготовьте блокирующий буфер (2% BSA + 0,3% Triton-X-100 в 1x PBS). Используйте примерно 1 мл на слайд. Создайте увлажненную камеру, добавив воду на дно. Уложите горки лицевой стороной вверх горизонтально и не дайте им высохнуть. Добавляйте 1 мл блокирующего буфера к каждому слайду и инкубируйте в течение не менее 1 ч при комнатной температуре. Готовят раствор первичного антитела путем разведения первичного антитела в буфере антител (0,7% BSA + 0,3% Triton-X-100 в 1x PBS).ПРИМЕЧАНИЕ: Для фосфорилированного антитела α-синуклеина использовался коэффициент разведения 1:500. Добавляют 200-300 мкл раствора первичного антитела на слайд. Накройте крышкой, чтобы диспергировать антитело и инкубировать при 4 °C в течение ночи. На следующий день извлеките слайды из увлажненной камеры и поместите их в вертикальную банку Coplin, наполненную 1x PBS, чтобы крышка отвалилась. Делайте это для каждого слайда индивидуально и следите за тем, чтобы не потревожить участок ткани при удалении крышки. Поместите слайды в горизонтальную слайд-банку и мойте секции 3 раза в PBS в течение 10 минут каждую стирку при комнатной температуре на шейкере.ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие шаги должны быть выполнены с выключенным светом, чтобы избежать фотоотбеливания флуорофора! Готовят раствор вторичного антитела путем разбавления вторичного антитела в буфере антител.ПРИМЕЧАНИЕ: Для обнаружения фосфорилированного α-синуклеина использовали анти-кроликов вторичный конъюгированный с Alexa 488 с коэффициентом разбавления 1:500 в буфере антител (0,7% BSA + 0,3% Triton-X-100 в 1x PBS). Уложите слайды горизонтально в увлажненную камеру и добавьте 200-300 мкл раствора вторичных антител на слайд. Накройте крышкой, чтобы диспергировать антитело. Инкубировать при комнатной температуре не менее 2 ч. Извлеките слайды из увлажненной камеры и поместите их в вертикальную банку Coplin, наполненную 1x PBS, чтобы крышка отвалилась. Делайте это для каждого слайда индивидуально и следите за тем, чтобы не потревожить участок ткани при удалении крышки. Поместите слайды в горизонтальную слайд-банку и мойте секции 3 раза в PBS в течение 10 минут каждую стирку при комнатной температуре на шейкере. Высушите боковые части горок на полотенце и стряхните лишний PBS. Добавьте 3 капли монтажного носителя на каждый слайд. Добавьте крышку и осторожно выталкивайте пузырьки парой щипцов, нажимая на крышку перед визуализацией с помощью конфокальной микроскопии.