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免疫与感染

인터루킨 10-결핍 마우스 모델에서 분변 미생물 이식의 치료 평가

Published: April 06, 2022
doi:
10.3791/63350
, , ,
1Division of Gastroenterology, Department of Internal Medicine,University of Texas Medical Branch at Galveston, 2Department of Gastroenterology,Xiangya Hospital of Central South University

Summary

유전 적 감수성, 점막 면역 및 장내 미세 생태 학적 환경의 상호 작용은 염증성 장 질환 (IBD)의 발병 기전에 관여합니다. 이 연구에서는 IL-10 결핍 마우스에 분변 미생물 이식을 적용하고 결장 염증 및 심장 기능에 미치는 영향을 조사했습니다.

Abstract

최근 몇 년 동안 미세 생태학의 발달로 장내 박테리아와 염증성 장 질환 (IBD)의 관계가 상당한 관심을 끌었습니다. 축적된 증거에 따르면 dysbiotic microbiota는 IBD에서 염증 과정을 유발하거나 악화시키는 데 적극적인 역할을 하며 분변 미생물총(FMT)은 건강한 미생물총을 IBD 환자에게 전달하면 적절한 숙주-미생물 통신을 복원할 수 있기 때문에 매력적인 치료 전략입니다. 그러나 분자 메커니즘이 불분명하고 FMT의 효능이 잘 확립되지 않았습니다. 따라서, IBD의 동물 모델에 대한 추가 연구가 필요하다. 이 방법에서는 야생형 C57BL/6J 마우스의 FMT를 대장염의 널리 사용되는 마우스 모델인 IL-10 결핍 마우스에 적용했습니다. 이 연구는 기증자 마우스에서 대변 알갱이를 수집하고, 대변 용액 / 현탁액을 만들고, 대변 용액을 투여하고, 질병을 모니터링하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 우리는 FMT가 IL-10 녹아웃 마우스의 심장 손상을 유의하게 완화하여 IBD 관리에 대한 치료 잠재력을 강조한다는 것을 발견했습니다.

Introduction

인간의 장내 미세 생태계는 매우 복잡하며 건강한 사람의 장에 1000 종 이상의 박테리아가 있습니다1. 장내 세균총은 장의 정상적인 생리 기능과 면역 반응을 유지하는 데 관여하며 인체와 불가분의 관계가 있습니다. 축적된 증거는 장내 미생물군집이 단순한 기생충 그룹이 아니라 인체의 일부인 마지막 인간 기관을 구성한다는 것을 시사합니다2. 장내 미생물총, 대사산물 및 초기 생애에 확립된 숙주 면역 체계 사이의 ‘건강한’ 공생 관계는 장 항상성을 유지하는 데 중요합니다. 만성 염증과 같은 일부 비정상적인 상태에서 신체의 내부 및 외부 환경의 변화는 장 항상성을 심각하게 방해하여 dysbiosis3라고하는 장의 미생물 군집의 지속적인 불균형을 초래합니다. 사실,식이 요법, 약물 및 병원체를 포함한 여러 환경 요인에 노출되면 미생물 총이 변할 수 있습니다.

Dysbiosis는 염증성 장 질환 (IBD), 과민성 대장 증후군 (IBS) 및 위 막성 장염과 같은 다양한 장 질환의 발병 기전뿐만 아니라 심혈관 질환, 비만 및 알레르기를 포함한 장 외 질환의 증가하는 목록과 관련이 있습니다4. 미생물군 프로파일링에 따르면 IBD 환자는 박테리아 다양성이 급격히 감소하고 일부 특정박테리아 균주의 개체군이 현저하게 변화하는 것으로 나타났습니다5,6. 이 연구는 IBD 환자에서 라크노스피라세아과 박테로이데테스와 박테로이데테스가 적지만 프로테오박테리아와 악티노박테리아가 더 많다는 것을 보여주었습니다. IBD의 발병기전은 비정상적인 장내 세균총, 조절되지 않는 면역 반응, 환경 문제 및 유전적 변이를 포함한 다양한 병원성 요인과관련이 있는 것으로 믿어집니다7. 풍부한 근거는 장내 박테리아가 IBD8,9의 개시 및 적용 단계에서 역할을 한다는 것을 시사하며, 이는 장내 dysbiosis를 교정하는 것이 IBD의 치료 및/또는 유지 치료를 위한 새로운 접근 방식을 나타낼 수 있음을 시사한다.

분변 미생물 이식 (FMT)의 원형은 고대 중국에서 시작되었습니다10. 1958 년 Eiseman 박사와 그의 동료들은 관장을 통해 건강한 기증자의 대변으로 중증 위 막성 장염 4 건을 성공적으로 치료하여 인간의 대변을 사용하여 인간 질병을 치료하는 현대 서양 의학의 새로운 장을 열었습니다11. 클로스트리디움 디피실 감염(CDI)은12 번 위막성 장염의 주요 원인으로 밝혀졌으며 FMT는 CDI 치료에 매우 효과적입니다. 지난 8년 동안 FMT는 재발성 CDI13의 치료를 위한 표준 치료 요법이 되었으며, IBD와 같은 다른 장애에서 FMT의 역할을 조사하는 추가 연구가 촉발되었습니다. 지난 20년 동안 수많은 사례 보고서와 코호트 연구에서 IBD14 환자에서 FMT 사용이 문서화되었습니다. 12건의 시험을 포함한 메타 분석에 따르면 크론병(CD) 환자의 62%가 FMT 후 임상적 관해를 달성했으며 CD 환자의 69%가 임상 반응15를 보였습니다. 이러한 고무적인 결과에도 불구하고 IBD 관리에서 FMT의 역할은 여전히 불확실하며 FMT가 장 염증을 개선하는 메커니즘은 잘 이해되지 않았습니다. FMT가 클리닉에서 IBD에 대한 치료 옵션의 현재 군비에 합류하기 전에 추가 조사가 필요합니다.

이 프로토콜에서 우리는 이유 후 자발적으로 대장염이 발생하는 IL-10-/- 마우스에 FMT를 적용했으며 IBD16,17,18의 다인성 특성을 반영하는 황금 표준 역할을 했습니다. IL-10-/– 마우스는 IBD 환자와 유사한 분자 및 조직학적 특징을 나타내고, 환자와 마찬가지로 항-TNFα 요법으로 질병을 개선할 수 있기 때문에 IBD 병인을 해부하기 위해 광범위하게 사용되었습니다16. 노화 IL10-/- 마우스(생후 >9개월)는 연령이 일치하는 야생형 마우스(19)에 비해 심장 크기가 증가하고 심장 기능이 손상되어 대장염으로 인한 심장 질환을 연구하는 데 탁월한 모델이 됩니다. 그러나, 덱스트란 황산나트륨 모델 및 T 세포 유도 대장염 모델과 같은 대장염의 다른 쥐 모델도 사용될 수 있다. 우리는 경구 위관을 통해 대변 현탁액을 투여했으며, 이는 인간20의 관장보다 효과적이고 더 나은 경로로 입증되었습니다.

Protocol

동물에 대해 수행 된 모든 절차는 갤버스턴에있는 텍사스 대학교 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (프로토콜 # 1512071A)의 승인을 받았습니다. 1. 신선한 분변 알갱이 수집 멸균 종이 타월, 무딘 끝 집게 및 50mL 원추형 튜브를 준비하십시오.종이 타월과 집게를 별도의 오토클레이브 백에 넣고 180°C에서 30분 동안 건열로 오토클레이브합니다. ?…

Representative Results

2개월 된 C57BL/6J 야생형(WT) 및 IL-10 녹아웃 마우스에 대해 건강한 기증자 FMT를 3회(3개월 동안 한 달에 한 번) 수행했습니다. 연령 일치 C57BL/6J 마우스(연령 차이는 <2개월이어야 함)를 대변 기증자로 제공하고 매번 신선한 분변 펠릿을 사용했습니다. EIA 분석에 따르면 BNP는 IL-10 결핍 마우스의 혈장에서 현저하게 상승했으며 건강한 공여자 FMT는 BNP 수준의 증가를 유의하게 완화했습니다 (<strong class="xfi…

Discussion

혁신적인 연구 치료제로서 FMT는 IBD, 비만, 당뇨병, 자폐증, 심장병 및 암을 포함한 여러 인간 질병의 발병 기전에 공생 미생물총의 dysbiosis가 연루되어 있기 때문에 최근 몇 년 동안 다양한 장애 치료에서 뜨거운 주제가 되었습니다26. 메커니즘은 결정되지 않았지만 FMT는 새로운 생물학적 식물상을 구축하고 잔류 박테리아의 손실을 방지함으로써 작동하는 것으로 믿어집니다. 본?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작업은 부분적으로 국립 보건원 (R01 HL152683 및 R21 AI126097에서 Q. Li로) 및 미국 심장 협회 보조금 17GRNT33460395 (Q. Li에게) (heart.org).

Materials

BD Syringe, 1 mL Fisher Scientific 14-829-10F
Blunt end forceps Knipex 926443
Brain natriuretic peptide EIA kit Sigma RAB0386
C57BL/6J mice Jackson Lab 000664
Centrifuge Eppendorf 5415R
Conical tubes ThermoFisher 339650
Curved feeding Needles Kent Scientific FNC-20-1.5-2
GLH-115 homogenizer Omni International GLH-115
Glycerol MilliporeSigma G5516
IL-10 knockout mice Jackson Lab 004366
Isoflurane Piramal Critical care NDC66794-017-10
USP normal saline Grainger 6280
Vaporizer Euthanex Corp. EZ-108SA
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References

  1. D’Argenio, V., Salvatore, F. The role of the gut microbiome in the healthy adult status. Clinica Chimica Acta. 451, 97-102 (2015).
  2. Baquero, F., Nombela, C. The microbiome as a human organ. Clinical Microbiology and Infection. 18, 2-4 (2012).
  3. Hawrelak, J. A., Myers, S. P. The causes of intestinal dysbiosis: a review. Alternative Medcine Review. 9 (2), 180-197 (2004).
  4. Carding, S., Verbeke, K., Vipond, D. T., Corfe, B. M., Owen, L. J. Dysbiosis of the gut microbiota in disease. Microbial Ecology in Health and Disease. 26 (1), 26191 (2015).
  5. Ma, H. Q., Yu, T. T., Zhao, X. J., Zhang, Y., Zhang, H. J. Fecal microbial dysbiosis in Chinese patients with inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 24 (13), 1464-1477 (2018).
  6. Chu, Y., et al. Specific changes of enteric mycobiota and virome in inflammatory bowel disease. Journal of Digestive Diseases. 19 (1), 2-7 (2018).
  7. Manichanh, C., Borruel, N., Casellas, F., Guarner, F. The gut microbiota in IBD. Nature reviews Gastroenterology and Hepatology. 9 (10), 599-608 (2012).
  8. Podolsky, D. K. Inflammatory bowel disease. The New England Journal of Medicine. 347 (6), 417-429 (2002).
  9. Tamboli, C. P., Neut, C., Desreumaux, P., Colombel, J. F. Dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut. 53 (1), 1-4 (2004).
  10. Shi, Y. C., Yang, Y. S. Fecal microbiota transplantation: Current status and challenges in China. JGH Open: An Open Access Journal of Gastroenterology and Hepatology. 2 (4), 114-116 (2018).
  11. Markley, J. C., Carson, R. P., Holzer, C. E. Pseudomembranous enterocolitis: A clinico pathologic study of fourteen cases with a common etiologic factor. AMA Archives of Surgery. 77 (3), 452-461 (1958).
  12. Wilcox, M. H. Clostridium difficile infection and pseudomembranous colitis. Best Practice and Research Clinical Gastroenterology. 17 (3), 475-493 (2003).
  13. Kelly, C. R., de Leon, L., Jasutkar, N. Fecal microbiota transplantation for relapsing Clostridium difficile infection in 26 patients: methodology and results. Journal of Clinical Gastroenterology. 46 (2), 145-149 (2012).
  14. Borody, T. J., Warren, E. F., Leis, S., Surace, R., Ashman, O. Treatment of ulcerative colitis using fecal bacteriotherapy. Journal of Clinical Gastroenterology. 37 (1), 42-47 (2003).
  15. Cheng, F., Huang, Z., Wei, W., Li, Z. Fecal microbiota transplantation for Crohn’s disease: a systematic review and meta-analysis. Techniques in Coloproctology. 25 (5), 495-504 (2021).
  16. Scheinin, T., Butler, D. M., Salway, F., Scallon, B., Feldmann, M. Validation of the interleukin-10 knockout mouse model of colitis: antitumour necrosis factor-antibodies suppress the progression of colitis. Clinical and Experimental Immunology. 133 (1), 38-43 (2003).
  17. Keubler, L. M., Buettner, M., Hager, C., Bleich, A. A multihit model: Colitis lessons from the interleukin-10-deficient mouse. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (8), 1967-1975 (2015).
  18. Kiesler, P., Fuss, I. J., Strober, W. Experimental models of inflammatory bowel diseases. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 1 (2), 154-170 (2015).
  19. Sikka, G., et al. Interleukin 10 knockout frail mice develop cardiac and vascular dysfunction with increased age. Experimental Gerontology. 48 (2), 128-135 (2013).
  20. Fecal microbiota transplantation-standardization study group. Nanjing consensus on methodology of washed microbiota transplantation. Chinese Medical Journal (Engl). 133 (19), 2330-2332 (2020).
  21. Kodani, T., et al. Flexible colonoscopy in mice to evaluate the severity of colitis and colorectal tumors using a validated endoscopic scoring system). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50843 (2013).
  22. Cheng, H. -. W., et al. Assessment of right ventricular structure and function in mouse model of pulmonary artery constriction by transthoracic echocardiography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (84), e51041 (2014).
  23. Tang, Y., et al. Chronic colitis upregulates microRNAs suppressing brain-derived neurotrophic factor in the adult heart. PLoS One. 16 (9), 0257280 (2021).
  24. Orner, G. A., et al. Suppression of tumorigenesis in the Apc(min) mouse: down-regulation of beta-catenin signaling by a combination of tea plus sulindac. Carcinogenesis. 24 (2), 263-267 (2003).
  25. Kline, K. T., et al. Neonatal injury increases gut permeability by epigenetically suppressing E-Cadherin in adulthood. The Journal of Immunology. 204 (4), 980-989 (2020).
  26. DeGruttola, A. K., Low, D., Mizoguchi, A., Mizoguchi, E. Current understanding of dysbiosis in disease in human and animal models. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (5), 1137-1150 (2016).
  27. Chevalier, G., et al. Effect of gut microbiota on depressive-like behaviors in mice is mediated by the endocannabinoid system. Nature Communications. 11 (1), 6363 (2020).
  28. Kao, D., et al. Effect of oral capsule- vs colonoscopy-delivered fecal microbiota transplantation on recurrent clostridium difficile infection: A randomized clinical trial. JAMA. 318 (20), 1985-1993 (2017).
  29. Cammarota, G., et al. International consensus conference on stool banking for faecal microbiota transplantation in clinical practice. Gut. 68 (12), 2111-2121 (2019).
  30. Vemuri, R., et al. The microgenderome revealed: sex differences in bidirectional interactions between the microbiota, hormones, immunity and disease susceptibility. Seminar Immunopathology. 41 (2), 265-275 (2019).
  31. Wilkinson, N. M., Chen, H. -. C., Lechner, M. G., Su, M. A. Sex differences in immunity. Annual Review of Immunology. , (2022).
  32. Lee, C. H., et al. Frozen vs fresh fecal microbiota transplantation and clinical resolution of diarrhea in patients with recurrent clostridium difficile infection: A randomized clinical trial. JAMA. 315 (2), 142-149 (2016).
  33. Hamilton, M. J., Weingarden, A. R., Sadowsky, M. J., Khoruts, A. Standardized frozen preparation for transplantation of fecal microbiota for recurrent clostridium difficile infection. American Journal of Gastroenterology. 107 (5), 761-767 (2012).
  34. Tang, G., Yin, W., Liu, W. Is frozen fecal microbiota transplantation as effective as fresh fecal microbiota transplantation in patients with recurrent or refractory Clostridium difficile infection: A meta-analysis. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 88 (4), 322-329 (2017).
  35. Cui, B., et al. Fecal microbiota transplantation through mid-gut for refractory Crohn’s disease: safety, feasibility, and efficacy trial results. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 30 (1), 51-58 (2015).
  36. Li, P., et al. Timing for the second fecal microbiota transplantation to maintain the long-term benefit from the first treatment for Crohn’s disease. Applied Microbiology and Biotechnology. 103 (1), 349-360 (2019).
  37. Moayyedi, P. Update on fecal microbiota transplantation in patients with inflammatory bowel disease. Gastroenterology and Hepatology. 14 (5), 319 (2018).
  38. Saha, S., Mara, K., Pardi, D. S., Khanna, S. Long-term safety of fecal microbiota transplantation for recurrent clostridioides difficile infection. Gastroenterology. 160 (6), 1961-1969 (2021).
  39. Perler, B. K., et al. Long-term efficacy and safety of fecal microbiota transplantation for treatment of recurrent clostridioides difficile infection. Journal of Clinical Gastroenterology. 54 (8), 701-706 (2020).
  40. Safety alert regarding use of fecal microbiota for transplantation and risk of serious adverse events likely due to transmission of pathogenic organisms. FDA Available from: https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/safety-availability-biologics/safety-alert-regarding-use-fecal-microbiota-tramsplantation-and-risk-serious-adverse-events-likely (2020)

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Xiao, Y., Zhong, X. S., Liu, X., Li, Q. Therapeutic Evaluation of Fecal Microbiota Transplantation in an Interleukin 10-Deficient Mouse Model. J. Vis. Exp. (182), e63350, doi:10.3791/63350 (2022).
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