Modelado de hemorragia intraventricular neonatal a través de la inyección intraventricular de hemoglobina
Summary
Presentamos un modelo de hemorragia intraventricular neonatal utilizando crías de rata que imita la patología observada en humanos.
Abstract
La hemorragia intraventricular neonatal (Hiv) es una consecuencia común del nacimiento prematuro y conduce a lesión cerebral, hidrocefalia poshemorrágica (HPH) y déficits neurológicos de por vida. Si bien la PHH se puede tratar mediante procedimientos de derivación temporal y permanente del líquido cefalorraquídeo (LCR) (reservorio ventricular y derivación ventriculoperitoneal, respectivamente), no existen estrategias farmacológicas para prevenir o tratar la lesión cerebral inducida por la hemorragia intraventricular y la hidrocefalia. Se necesitan modelos animales para comprender mejor la fisiopatología de la hemorragia intraventricular y probar tratamientos farmacológicos. Si bien existen modelos de Hiv neonatal, aquellos que resultan confiablemente en hidrocefalia a menudo están limitados por la necesidad de inyecciones de gran volumen, lo que puede complicar el modelado de la patología o introducir variabilidad en el fenotipo clínico observado.
Estudios clínicos recientes han implicado a la hemoglobina y la ferritina en causar agrandamiento ventricular después de la hemorragia intraventricular. Aquí, desarrollamos un modelo animal sencillo que imita el fenotipo clínico de PHH utilizando inyecciones intraventriculares de pequeño volumen del producto de degradación sanguínea hemoglobina. Además de inducir de manera confiable el agrandamiento ventricular y la hidrocefalia, este modelo produce lesiones en la sustancia blanca, inflamación e infiltración de células inmunes en regiones periventriculares y de la sustancia blanca. Este artículo describe este método simple y clínicamente relevante para modelar la HPH-IVH en ratas neonatas mediante inyección intraventricular y presenta métodos para cuantificar el tamaño del ventrículo después de la inyección.
Introduction
La hemorragia intraventricular neonatal se origina en la matriz germinal, un sitio de división celular rápida que se encuentra adyacente a los ventrículos laterales del cerebro en desarrollo. Esta estructura altamente vascular es vulnerable a la inestabilidad hemodinámica relacionada con el nacimiento prematuro. La sangre se libera en los ventrículos laterales en la hemorragia de la matriz germinal (GMH)-FIV cuando los vasos sanguíneos frágiles dentro de la matriz germinal se rompen. En el caso de la Hiv de grado IV, el infarto hemorrágico periventricular también puede contribuir a la liberación de productos sanguíneos dentro del cerebro. 1 La combinación de GMH-IVH puede causar PHH, particularmente después de hemorragia de alto grado (grados III y IV)1. La PHH se puede tratar con la colocación de una derivación ventriculoperitoneal, pero la colocación de la derivación no revierte la lesión cerebral que puede ocurrir por la IVH. Aunque los cuidados intensivos neonatales modernos han reducido las tasas de Hiv2, 3, no existen tratamientos específicos para la lesión cerebral o hidrocefalia causada por la Hiv una vez que ha ocurrido. Una limitación significativa en el desarrollo de tratamientos preventivos para la lesión cerebral inducida por IVH y PHH es la comprensión incompleta de la fisiopatología de la IVH.
Recientemente, se ha demostrado que los niveles tempranos de LCR del producto clave de degradación sanguínea hemoglobina están asociados con el desarrollo posterior de PHH en neonatos con HVI4 de alto grado. Además, los niveles de LCR de proteínas de la vía de manipulación del hierro (hemoglobina, ferritina y bilirrubina) se asocian con el tamaño del ventrículo en la Hiv neonatal. Esto también se demostró en una cohorte multicéntrica de lactantes con PHH prematura, donde los niveles más altos de ferritina en el LCR ventricular se asociaron con un tamaño de ventrículo5 más grande.
En este estudio, desarrollamos un modelo clínicamente relevante de lesión cerebral inducida por IVH e hidrocefalia utilizando inyección de hemoglobina en los ventrículos cerebrales, lo que permite la cuantificación de la lesión cerebral y la PHH y la prueba de nuevas estrategias terapéuticas (Figura 1)6, 7. Este modelo de IVH utiliza cachorros de rata neonatal, que se colocan bajo anestesia general durante la duración del procedimiento. Se realiza una incisión en la línea media en el cuero cabelludo y se utilizan coordenadas derivadas de los puntos de referencia del cráneo, el bregma o lambda, para apuntar a los ventrículos laterales para la inyección. La inyección lenta con una bomba de infusión libera hemoglobina en el ventrículo. Este protocolo es fácil de usar, versátil y puede modelar diferentes componentes de IVH que resultan en PHH.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este modelo de Hiv que utiliza inyección de hemoglobina permite el estudio de la patología de la Hiv específicamente mediada por la hemoglobina. Para estudios complementarios, la hemoglobina también se puede administrar fácilmente in vitro y no confunde los ensayos bioquímicos para proteínas producidas por microglia / macrófagos que están presentes en la sangre total.
Las principales teorías de IVH-PHH incluyen la obstrucción mecánica de la circulación del LCR, la interru…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JMS recibió fondos de NIH/NINDS R01 NS110793 y K12 (Programa de Desarrollo de Carrera de Investigación de Neurocirujanos). BAM recibió fondos de NIH / NINDS K08 NS112580-01A1, Premio al Área Prioritaria de Investigación de Neurociencia de la Universidad de Kentucky y un Premio al Innovador de la Asociación de Hidrocefalia .
Materials
| 0.3 mL insulin syringe | BD Microfine + Insulin Syringe | 230-4533 | 0.3-0.5 mL synringes will work |
| 1.5 mL microtube | USA Scientific | 1615-5500 | Lot No. K194642H -3 511 |
| 4.7T MRI | Agilent/Varian | 4.7T/33 cm | Agilent/Varian DirectDrive 4.7-T (200-MHz) MRI system |
| 6-0 monofilament suture | ETHICON | 667G | |
| 9.4T MRI | Bruker | BioSpec 94/20 | Used in this protocol without the cryoprobe |
| Analytical balance | CCURIS Instruments | W3200-320 | |
| Artificial CSF (aCSF) | Tocris Bioscience | 3525 | Batch No: 72A |
| Betadine | Purdue Products L.P. | 301005-00 | NDC 67618-150-09 |
| Carprofen (injectable) | Zoetis Inc. | PI 4019448 | Rimadyl |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| Heating pad | Sunbeam | E12107-819 | UL 612A, Z-1228-001 |
| Hemoglobin | MP Biomedicals | 100714 | LOT NO. SR02321 |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Isoflurane vaporizer | VETEQUIP | 911103 | |
| Light for stereotactic insturment | Dolan-Jenner industries | Fiber-Lite MI-150 | |
| Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | MICRO21 | Serial 184034 T08K |
| MRI software | Bruker BioSpin | Paravision 360 3.2 | |
| Oxygen | Airgas Healthcare | UN1072 | LOT NUMBER S1432080XA02 |
| Sprague Dawley rats | Charles River Laboratories | Strain code: 001 | |
| Stereotactic instrument | KOPF Instuments | Model 900LS Lazy Susan | |
| Sterile cotton tipped applicator | Fischerbrand | 23-400-118 | |
| Surgical blade | covetrus | #10 | |
| Topical triple antibiotic | Triple Antibiotic Ointment | NDC 51672-2120-1 | |
| Ventricle volume quantification software | ITK-SNAP | ITK-SNAP 4.0.0 beta |
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