Analyzing the Parkinson's Disease Mouse Model Induced by Adeno-associated Viral Vectors Encoding Human &#945;-Synuclein

Daniela Elgueta; Ornella Chovar; Valentina Ugalde; Vanesa S&#225;nchez-Guajardo; Alejandra Catenaccio; Felipe Court; Rodrigo Pacheco

doi:10.3791/63313

JoVE Journal > Neuroscience

神经科学

Analisando o modelo de rato da doença de Parkinson induzida por vetores virais associados à Adeno codificando α-sinucleína humana

Published: July 29, 2022

doi:

10.3791/63313

Daniela Elgueta¹, Ornella Chovar¹, Valentina Ugalde¹, Vanesa Sánchez-Guajardo¹, Alejandra Catenaccio², Felipe Court^2,3,4, Rodrigo Pacheco^1,5

¹Laboratorio de Neuroinmunología,Fundación Ciencia & Vida, ²Center for Integrative Biology,Universidad Mayor, ³FONDAP Geroscience Center for Brain Health and Metabolism, ⁴Buck Institute for Research on Ageing, ⁵Facultad de Medicina y Ciencia,Universidad San Sebastián

Summary

Este trabalho analisa a dose vetorial e o tempo de exposição necessários para induzir neuroinflamação, neurodegeneração e comprometimento motor neste modelo pré-clínico da doença de Parkinson. Esses vetores que codificam a α-sinucleína humana são entregues na substantia nigra para recapitular a patologia da sinucleína associada à doença de Parkinson.

Abstract

A doença de Parkinson é uma doença neurodegenerativa que envolve a morte dos neurônios dopaminérgicos da via nigrostriatal e, consequentemente, a progressiva perda de controle dos movimentos voluntários. Este processo neurodegenera é desencadeado pela deposição de agregados proteicos no cérebro, que são constituídos principalmente de α-sinucleína. Vários estudos indicaram que a neuroinflamação é necessária para desenvolver a neurodegeneração associada à doença de Parkinson. Notavelmente, o processo neuroinflamatório envolve ativação microglial, bem como a infiltração de células T periféricas na substantia nigra (SN). Este trabalho analisa um modelo de camundongo da doença de Parkinson que recapitula a ativação microglial, infiltração de células T no SN, a neurodegeneração de neurônios dopaminérgicos nigral e prejuízo motor. Este modelo de camundongo da doença de Parkinson é induzido pela entrega estereoxica de vetores virais associados ao adeno que codificam o tipo selvagem humano α-sinucleína (AAV-hαSyn) no SN. A entrega correta de vetores virais no SN foi confirmada utilizando vetores de controle codificando proteína fluorescente verde (GFP). Posteriormente, como a dose de AAV-hαSyn administrada no SN afetou a extensão da expressão hαSyn, a perda de neurônios dopaminérgicos nigral e o comprometimento motor foram avaliados. Além disso, a dinâmica da expressão hαSyn, ativação microglial e infiltração de células T foram determinadas ao longo do tempo de desenvolvimento da doença. Assim, este estudo fornece pontos de tempo críticos que podem ser úteis para direcionar a patologia da sinucleína e a neuroinflamação neste modelo pré-clínico da doença de Parkinson.

Introduction

Após a doença de Alzheimer, a doença de Parkinson é a segunda doença neurodegenerativa mais prevalente em todo o mundo. Os neurônios primários afetados na doença de Parkinson são os da via nigrostriatal, que produzem dopamina e controlam o movimento voluntário. Como consequência, o sintoma mais característico associado a esse transtorno é o comprometimento motor. Essa patologia também envolve a deposição de agregados proteicos no cérebro, que são compostos principalmente de α-sinucleína (αSyn)¹, uma proteína citosolica associada a terminais pré-sinápticos. Evidências mostraram que a geração de inclusões patogênicas de αSyn é desencadeada por erros ou por algumas modificações pós-translacionais desta proteína².

Notavelmente, estabeleceu-se uma relação próxima entre a patologia αSyn e a perda de neurônios dopaminérgicos da via nigrostriatal na doença de Parkinson humano e modelos animais ^3,4. Entender como os agregados αSyn são gerados e como eles induzem a morte neuronal representa um desafio significativo no campo. Um grupo crescente de estudos tem demonstrado que, ao aumentar o estresse oxidativo, a disfunção mitocondrial é uma das principais causas para a geração de αSyn agrega². De fato, vários genes associados à doença de Parkinson codificam proteínas envolvidas na função mitocondrial, morfologia e dinâmica ^5,6. Além disso, a disfunção lysosômica, que resulta no acúmulo de mitocôndrias disfuncionais e αSyn desomída constitui outro grande evento promovendo a geração de αSyn agregados⁷.

Evidências emergentes indicaram que, uma vez que os agregados αSyn são depositados no cérebro, essas proteínas patogênicas estimulam receptores semelhantes a pedágio (TLRs) na microglia, desencadeando assim a ativação microglial e um ambiente inflamatório inicial na substantia nigra (SN)^8,9. Além disso, as evidências indicam que os agregados αSyn são capturados e apresentados por células que apresentam antígenos às células T, induzindo uma resposta imune adaptativa específica para αSyn^10,11. Essas células T específicas da αSyn se infiltram posteriormente no cérebro e são repimuladas por microglia ativada, promovendo assim a secreção de fatores neurotóxicos que evocam a morte neuronal ^9,10. Curiosamente, várias linhas de evidência sugerem que os agregados αSyn são gerados primeiro no sistema nervoso entérico e depois transportados através do nervo vago para o tronco cerebral¹².

Vários modelos animais da doença de Parkinson têm sido usados por muitos anos, incluindo aquelas induzidas pela administração de substâncias neurotóxixicas (ou seja, 6-hidroxydopamina, paraquat, rotenona, 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropyridina) e aquelas que envolvem condições genéticas (ou seja, mutante α-sinucleína, mutante leucina-rica em kinase 2)¹³ . Apesar de modelos envolvendo neurodegeneração induzida por neurotoxina replicando alguns aspectos da doença de Parkinson, nenhum deles recapitula todos os aspectos essenciais da doença ou não são progressivos¹³. Por outro lado, embora modelos genéticos de camundongos envolvendo a expressão de versões mutantes de leucina-rich repeat kinase 2, versões mutantes de α-sinucleína, ou a superexpressão do tipo selvagem humano α-sinucleína resultam em prejuízo motor e, em alguns casos, também o desenvolvimento da sinucleinopatia, eles não reproduzem a neurodegeneração proeminente dos neurônios dopaminérgicos nigral, que é um aspecto essencial da doença de Parkinson¹³^,^{14 anos}. Um terceiro tipo de modelo animal de neurodegeneração conseguiu atender a maioria dos aspectos essenciais da doença de Parkinson, a entrega estereotaxa de vetores virais associados ao Adeno (AAVs) codificando a α-sinucleína humana (AAV-hαSyn)^14,15. É importante ressaltar que os AAVs permitem a transdução de neurônios com alta eficácia e a longo prazo no cérebro adulto dos mamíferos. Além disso, a entrega estereoxica de AAV-hαSyn no SN tem se mostrado para reproduzir muitos dos aspectos essenciais da doença, incluindo patologia αSyn, ativação microglial, neurodegeneração e comprometimento motor 16,17,18,19,20. Este estudo apresenta uma análise de como a dose de vetor viral e o tempo após o parto do vetor viral afetam a extensão da expressão hαSyn, neurodegeneração e neuroinflamação na via nigrostriatal, bem como o grau de comprometimento motor no modelo de rato de entrega estereotaxa unilateral de hαSyn no SN.

Protocol

Todos os estudos foram realizados na 8ª edição do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Os protocolos experimentais foram aprovados pela IACUC na Fundação Ciencia & Vida, incluindo aqueles que envolvem anestesia, dor, angústia e eutanásia (Número de Licença P-035/2022). 1. A cirurgia estereotaxa Preparação para a cirurgia (aproximadamente 1 h) Para manter um ambiente asséptico, use roupas cirúrgicas apropriadas durante toda a cirurgia, incluindo capas de sapato, uma máscara cirúrgica, uma barreira sanitária, luvas e uma tampa cirúrgica. Pulverizar 70% de etanol no camundongo e todo o material cirúrgico para manter um ambiente asséptico. Para induzir analgesia, injete o camundongo com carprofeno 5 mg/kg subcutâneamente (s.c.) a cada 12 h21 começando 1h antes da cirurgia e continuando até 3 dias após a cirurgia. Para anestesiar o rato, coloque o animal em uma câmara de indução. Abra o fluxo isoflurane a uma taxa de 0,5% e, em seguida, lentamente aumente-o até 5% ao longo de aproximadamente 5 min até que o mouse tenha perdido seu reflexo de redomentação22. Remova o animal da câmara de indução. Transfira imediatamente o animal para um circuito não rebreathing com um cone de nariz apropriadamente dimensionado. Mantenha a anestesia do camundongo com isoflurane 1% durante todo o tempo de cirurgia. Confirme se o mouse está totalmente anestesiado beliscando sua cauda e patas. Quando o mouse não reage a beliscar a cauda e as patas, significa que o mouse está completamente anestesiado. Raspe a cabeça do rato usando uma tesoura. Limpe a pele do rato usando um cotonete com clorexidina 2% e remova todo o cabelo. Conserte a cabeça do mouse no quadro estereotaxic. Coloque um protetor de córnea em ambos os olhos de rato usando um cotonete. Para evitar a indução de estresse em outros roedores, evite a presença de qualquer outro rato na sala de cirurgia23. A cirurgia (aproximadamente 30 min) Limpe a cabeça do rato com três balas de 2% de clorexidina seguidas de 70% de etanol. Exponha o crânio usando material cirúrgico e faça um fino orifício com uma broca nas seguintes coordenadas: anteroposterior −2,8 mm, e mediolateral 1,4 mm em relação à linha medial. Coloque a agulha de uma seringa de 10 μL no orifício e mova a agulha dentro do cérebro lentamente até chegar a −7,2 mm dorsoventral em relação à dura24. Deixe a agulha na posição final por 2 minutos para permitir que o tecido se acomode um pouco, e, em seguida, injetar 1 μL de AAV5-CBA-hαSyn (AAV-hαSyn), AAV5-CBA-eGFP (AAV-GFP) ou veículo (PBS em pH 7.4; cirurgia falsa) na substantia nigra direita a uma taxa de 0,2 μL/30 s. Deixe a agulha na mesma posição por 5 minutos após a entrega de vetores virais e, em seguida, retire-a lentamente. Pós-cirurgia (aproximadamente 5 min) Feche a ferida usando uma sutura não absorvível trançada de seda estéril. Coloque o mouse na gaiola de casa pré-armado colocando-o sobre um colchão aquecido elétrico (25 °C).NOTA: O rato deve ser mantido sozinho na gaiola doméstica até que ele seja capaz de andar sem dificuldade e a ferida tenha cicatrizado. 2. Determinação do desempenho do motor usando o teste de feixe Treinamento (aproximadamente 15 minutos por mouse) Doze semanas após a cirurgia estereotaxa, avalie o desempenho do motor usando uma versão simplificada do teste de feixe descrito antes dos25 anos. Para isso, utilize um feixe horizontal de 25 cm de comprimento e 3 cm de largura. A superfície do feixe deve ser coberta com uma grade metálica com quadrados de 1 cm e elevada 1 cm acima do feixe. Faça um vídeo do mouse atravessando o feixe de superfície da grade de uma extremidade para a extremidade oposta do feixe, onde a gaiola doméstica está localizada. Treine o mouse por 2 dias antes da determinação do desempenho do motor. No primeiro dia, treine o rato para andar pela viga cinco vezes sem a grade. No segundo dia, treine o mouse para caminhar pela viga na presença da grade cinco vezes. O teste (aproximadamente 5 minutos por mouse) No terceiro dia, avalie o desempenho do motor. Para isso, quantifique o número de erros realizados pelas patas esquerdas ou pelas patas direitas separadamente assistindo os vídeos no modo slow-motion.NOTA: Um erro é definido como quando uma pata não pisa corretamente na grade e, portanto, torna-se visível na lateral da grade ou entre a grade e a superfície do feixe. 3. Processamento de tecidos Perfusão transcárvia (aproximadamente 15 minutos por rato) Para anestesiar o camundongo, injete uma mistura de cetamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) intraperitoneal (i.p.) usando uma seringa de 1 mL e agulha de 27 G26. Uma vez que o rato esteja completamente anestesiado (confirmado como na etapa 1.1.6.), abra o tórax com material cirúrgico e exponha o coração. Em seguida, insira uma agulha de 21 G (faça a ponta plana usando uma broca) no ventrículo esquerdo do coração. Ao acoplar a agulha a um tubo, perfuse 50 mL de PBS (pH 7.4) a uma taxa de 9,5 mL/min usando uma bomba peristáltica. Fixação e crioproteção do cérebro (aproximadamente 10 minutos por cérebro) Remova o cérebro usando tesouras e pinças e, em seguida, fixe-o por imersão em 5 mL de 4% de paraformaldeído em PBS (pH 7.4) a 4 °C por 24 h. Depois, coloque o cérebro fixo em 15 mL de 30% de sacarose a 4 °C por 48 h. Em seguida, coloque o cérebro em 4 mL de solução de crioproteção (20% de glicerina e 2% DMSO em PBS) e salve o cérebro a −80 °C ou use-o imediatamente na etapa seguinte. Obtenção de fatias cerebrais (aproximadamente 20 min por cérebro).NOTA: Certifique-se de que o cérebro é colocado em uma criostata em uma posição adequada para fazer cortes coronais. Para obter fatias de SN, corte o cérebro em seções de 40 μm de espessura, começando em −2,92 mm e terminando em −3,64 mm24. Colher cada fatia em um poço (contendo 1 mL de solução de crioproteção) de uma placa de 24 poços seguindo uma ordem anteroposterior como descrito antesde 25,27,28. Para realizar análises imunohistoquímicas (seção 4.) e imunofluorescência (seção 5.) no SN, escolha seis seções coronais de SN tomadas em intervalos uniformes (120 μm) que cobrem toda a extensão rostrocaudal do núcleo (720 μm no total), conforme descrito antesde 25,27,28. Para obter fatias estriais, corte o cérebro em seções de 40 μm de espessura, começando em +1,34 mm e terminando em −0,26 mm24. Colher cada fatia em um crioboto de 2 mL (contendo 1 mL de solução de crioproteção) seguindo uma ordem anteroposterior. Para realizar análises imunohistoquímicas (seção 4.) e imunofluorescência (seção 5.) no estriato, escolha cinco seções estriais coronais tomadas em intervalos uniformes (320 μm) que cobrem toda a extensão rostrocaudal do núcleo (1600 μm no total). 4. Análise imunohistoquímica para quantificar neurônios dopaminérgicos e microgliose (aproximadamente 2 dias) Para análise imunohistoquímica de fatias estriárias ou nigrais, coloque o conjunto de cinco (estriato) ou seis (SN) fatias do mesmo cérebro em um poço de uma placa de 24 poços. Lave as seções 3x com 1 mL de PBS e, em seguida, incubar com 0,5 mL de 0,03% H2O2 em metanol à temperatura ambiente e com agitação por 30 minutos para inativar atividade peroxidase endógena. Lave as seções 3x com 1 mL de PBS e incuba com 0,5 mL de solução de bloqueio (4% soro de cabra, 0,05% Triton X-100 e 4% BSA em PBS) em temperatura ambiente e com agitação por 40 min. Depois, incubar com 0,5 mL de solução de bloqueio contendo o anticorpo primário (altivexa-trosina de coelho [TH] pAb diluído 1:1000 [ver Tabela 1]; ou anticorpo anti-Iba1 de coelho diluído 1:1000) à temperatura ambiente e com agitação durante a noite. Lave as seções 3x com 1 mL de PBS e incuba com 0,5 mL de solução de bloqueio contendo anti-coelho de cabra biotiningada pAb (1:500, ver Tabela 1) à temperatura ambiente e com agitação por 2h. Em seguida, lave as seções 3x com 1 mL de PBS e incubar com 0,5 mL de avidin conjugado peroxidase (1:5000, ver Tabela 1) em solução de bloqueio à temperatura ambiente e com agitação por 90 min. Lave as seções 3x com 1 mL de PBS e incubar com 0,5 mL de solução de substrato (0,05% diaminobenzidina em 0,03% H2O2/Trizma-HCl tampão em pH 7.6). Use luvas e um jaleco para este passo, já que a diaminobenzidina é um potencial cancerígeno. Quando a coloração específica for evidente (tipicamente 30 seg para TH e 5 min para Iba1), pegue a solução do substrato e lave as seções 3x com 1 mL de PBS à temperatura ambiente e com agitação. Sempre realize a imunostaining de fatias de todos os cérebros incluídos no mesmo experimento simultaneamente.NOTA: A coloração específica do TH é evidente quando a imunossuagem de TH aparece na área do SN, que exibe uma forma característica no cérebro. A marca específica do Iba1 é determinada quando a imunostaining Iba1 aparece em fatias cerebrais de controle com formas microgliais típicas, que são confirmadas após observação de microscópio. Desta forma, o tempo exato de exposição de substrato para análise de IHC é determinado para cada experimento. Monte as seções cerebrais em lâminas de vidro usando uma solução de 0,2% de gelatina em 0,05 M Tris (pH 7.6). Coloque cada conjunto de cinco (estriato) ou seis (SN) fatias obtidas do mesmo cérebro na ordem rostrocaudal no mesmo slide de vidro. Quantifique o número de neurônios TH+ no SN. Para quantificar os neurônios TH+ no SN, adquira fotos das seis fatias a ampliação de 20x usando um microscópio de campo brilhante, como descrito antesde 25,27,28. Use o seguinte ajuste de cor: temperatura de cor 3200 K, ciano-vermelho 40%, magenta-verde 39%, amarelo-azul 54%, gama 0,5, contraste 37, brilho 13, saturação 5. Usando o software Image J, selecione o perímetro do SN pars compacta no hemisfério analisado. Evite a seleção de neurônios TH+ da área tegmental ventral (VTA). Depois, peça ao software para calcular a área selecionada (tipicamente 0,04-0,07 mm2/hemisfério, dependendo da posição rostrocaudal). Em seguida, usando a ferramenta de vários pontos, marque cada neurônio TH+ com um ponto. Usando a ferramenta de ponto, peça ao software para contar o número total de pontos. Com o número de pontos totais (neurônios TH+ ) e a área do SNpc, calcule a densidade de neurônios TH+ /mm2. Repita o mesmo cálculo em ambos os hemisférios nas seis fatias de SN e, em seguida, calcule a média dos neurônios TH+ /mm2 nos lados ipsilateral e contralateral. Quantifique o número de microglia ativada no estriato Para quantificar a microglia ativada no estriado, adquira duas fotos em cada hemisfério para todas as cinco fatias estriadas a 20x de ampliação usando um microscópio de campo brilhante e as mesmas configurações indicadas na etapa 4.10.1. Usando o software Image J, em cada foto (exibindo uma área de 660 μm x 877 μm), marque com um ponto cada célula expressando alta intensidade Iba1 e forma de ameboid usando a ferramenta multiponto. Usando a ferramenta de ponto, peça ao software para contar o número total de pontos. Com o número de pontos totais e a área da foto, calcule a densidade de microglia ativada (Iba1células altas /mm2) como realizada antesde 29. Antígeno alvo Acoplado a Clonalidade Especie do host Reatividade especie* Diluição** Tyrosine Hidroxilase N/A Policlonal Coelho Rato, Rato, Humano 1/200 – 1/1000 Iba1 N/A Monoclonal Coelho Rato, Rato, Humano 1/1000 alfa-sinucleína N/A Monoclonal Coelho Humano 1/150 CD4 N/A Monoclonal Rato Rato 1/250 IgG (H+L) Biotinilated Policlonal Cabra Coelho 1/500 IgG (H+L) AlexaFluor 546 Policlonal Cabra Coelho 1/500 IgG (H+L) AlexaFluor 647 Policlonal Cabra Coelho 1/500 IgG (H+L) AlexaFluor 546 Policlonal Cabra Rato 1/500 Tabela 1: Diluições de anticorpos. N/A, não aplicável. *, Só é especificado se houver reatividade com camundongos, ratos e humanos, independentemente da reatividade com outras espécies. **, Uma única diluição ou uma faixa de diluição é especificada. 5. Análise de imunofluorescência para avaliar a infiltração de células T na via nigrostriatal (aproximadamente 2 dias) Para análise de imunofluorescência de hαSyn ou TH/GFP em fatias estriais ou nigrais, monte o conjunto de cinco (estriato) ou seis (SN) fatias do mesmo cérebro em um poço de uma placa de 24 poços. Lave as seções 3x com 1 mL de PBS e, em seguida, incubar com 0,5 mL de solução de bloqueio (0,3% Triton X-100, 0,05% interpolação20 e 5% BSA em PBS) à temperatura ambiente e com agitação por 40 min. Depois, incubar com 0,5 mL de solução de bloqueio contendo o anticorpo primário (coelhinho anti-TH pAb diluído 1:500; ou anticorpo anti-hαSyn de coelho diluído 1:150, ver Tabela 1) à temperatura ambiente e com agitação durante a noite. Lave as seções 3x com 1 mL de PBS e incubar com 0,5 mL de solução de bloqueio contendo anticorpo secundário anti-coelho AlexaFluor546 (1:500, ver Tabela 1) e 4′,6-diamidino-2-fenillindole (DAPI; 1:1000) à temperatura ambiente e com agitação para 2 h. Em seguida, lave as seções 3x com 1 mL de PBS. Monte as seções cerebrais em lâminas de vidro como descrito acima (passo 4.9.). As imagens foram adquiridas com um microscópio de fluorescência invertido acoplado a uma unidade de alimentação. Para a análise de imunofluorescência de TH/CD4/GFP (Foxp3) em fatias nigrais, coloque o conjunto de seis (SN) fatias do mesmo cérebro em um poço de uma placa de 24 poços. Lave as seções 3x com 1 mL de PBS e incuba com 0,5 mL de solução de bloqueio (0,5% Triton X-100, 0,5% gelatina de pele de peixe em PBS) à temperatura ambiente e com agitação por 2h. Incubar com 0,5 mL de solução de bloqueio contendo os anticorpos primários coelhinho anti-TH pAb (1:200, ver Tabela 1) e anti-CD4 de rato (1:250) a 4 °C e com agitação durante a noite. Lave as seções 3x com 1 mL de PBS e incubar com 0,5 mL de solução de bloqueio contendo anti-coelho acoplado ao AlexaFluor 647 (1:500, ver Tabela 1) e anti-rato acoplado ao AlexaFluor 546 (1:500) à temperatura ambiente e com agitação por 2h. Em seguida, lave as seções 3x com 1 mL de PBS. Coloque cada conjunto de seis (SN) fatias obtidas do mesmo cérebro na ordem rostrocaudal no mesmo slide de vidro e monte-as usando Fluoromount G. Adquira imagens usando um microscópio Leica DMi8. Use as configurações do microscópio confocal indicada na Tabela 2 para adquirir imagens a partir da análise da imunofluorescência. Nome Chanel Cubo Wavelenght de emissão Nome da tabela de procura Tempo de exposição Ganhar Resolução XY Resolução Z Canal 1 Y5 700nm Cinza 1.011.727 ms alta capacidade de poço 2.237 um 24.444 um Canal 2 GFP 525nm Verde 326.851 ms alta capacidade de poço 2.237 um 24.444 um Canal 3 TXR 630nm Vermelho 406.344 ms alta capacidade de poço 2.237 um 24.444 um Canal 4 Dapi 460nm Azul 91.501 ms alta capacidade de poço 2.237 um 24.444 um Tabela 2: Configurações de microscópio confocal utilizadas para a aquisição de imagens a partir da análise da imunofluorescência. 6. Análise estatística Para comparar os dados obtidos dos lados ipsilateral e contralateral, use um teste t t de duas caudas emparelhado. Para comparar os dados obtidos de camundongos que recebem AAV-hαSyn e de camundongos que recebem AAV-GFP ou cirurgia falsa, use um teste t de um aluno de duas caudas não reparado. Considere diferenças significativas quando os valores P < 0,05.

Representative Results

Validando a correta entrega de vetores AAV nos neurônios dopaminérgicos da via nigrostriatalPara estudar os processos de neuroinflamação, neurodegeneração e comprometimento motor promovidos pela patologia da sinucleína, foi utilizado um modelo de camundongo da doença de Parkinson induzido pela entrega estereotaxa unilateral da codificação de AAV hαSyn na SN 16,17,30,31 (veja o desenho experimental na Figura Suplementar 1 ). Para validar a correta entrega de vetores AAV nos neurônios dopaminérgicos da via nigrostriatal, a imunorreatividade de codificação AAV (AAV-GFP) foi injetada no SN, e 12 semanas depois, a fluorescência GFP e a imunorreatividade hidroxilase de tyrosina (TH) foram analisadas no SN e estria por imunofluorescência. A fluorescência associada ao GFP foi observada exclusivamente no lado ipsilateral, e houve colocalização significativa com imunoreatividade th tanto no SN quanto no estriado, indicando a entrega correta de vetores AAV nos neurônios dopaminérgicos da via nigrostriatal (Figura 1). Figura 1: Análise da entrega de AAV-GFP na via nigrostriatal. Os camundongos receberam AAV-GFP (1 x10 10 vg/mouse) e 12 semanas depois foram sacrificados, e o TH foi imunossugado em (A) o SN (barras de escala são de 118 μm) e (B) o estriado (barras de escala são 100 μm). Fluorescência associada ao TH e GFP foram analisadas por microscopia de epifluorescência. Os núcleos estavam manchados com DAPI. Imagens representativas de manchas mescladas ou únicas de TH (vermelho), GFP (verde) e DAPI (azul). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Configuração da dose de vetor viral administrado para induzir neurodegeneração e comprometimento motor no modelo de camundongo da doença de Parkinson induzida por AAV-hαSynPara testar a dose de AAV-hαSyn necessária para induzir uma superexpressão significativa de hαSyn que promove a neurodegeneração dos neurônios dopaminérgicos nigral, diferentes doses (1 x 108 genomas virais [vg]/mouse, 1 x 109 vg/mouse, ou 1 x 1010 vg/mouse) de AAV-hαSyn foram injetados, e 12 semanas depois, a imunoreatividade hαSyn e a extensão da imunoreatividade TH foram avaliadas na via nigrostria. Embora a imunoreatividade hαSyn tenha sido evidente com todas as doses testadas no SN (Figura 2), apenas os camundongos que receberam 1 x10 10 vg/rato apresentaram evidente imunorreatividade hαSyn no estriado (Figura 3). Além disso, camundongos que receberam 1 x 1010 vg/mouse de AAV-hαSyn apresentaram uma perda significativa de neurônios dopaminérgicos no SN (Figura 4A,B). Embora os camundongos que receberam 1 x10 10 vg/mouse de AAV-GFP apresentaram um baixo grau (~20%) de perda neuronal (Figura 4A,B), os camundongos que receberam a mesma dose de AAV-hαSyn apresentaram um grau significativamente maior de neurodegeneração de neurônios dopaminérgicos nigral (Figura 4C). Assim, outros experimentos foram realizados utilizando 1 x 1010 vg/mouse de AAV-hαSyn. Além disso, a extensão do comprometimento motor foi determinada em camundongos que receberam diferentes doses de AAV-hαSyn utilizando o teste de feixe (Figura 5A), conforme descrito antesde 25. Uma redução significativa no desempenho do motor foi detectada exclusivamente com 1 x 1010 vg/mouse de AAV-hαSyn no teste de feixe tanto quando comparamos o número de erros cometidos pelas almofadas direita e esquerda (Figura 5B) e ao comparar o número total de erros de ratos que recebem AAV-hαSyn em comparação com os ratos que recebem o vetor de controle AAV-GFP (Figura 5C). Assim, outros experimentos foram realizados utilizando 1 x 1010 vg/mouse de AAV-hαSyn. Figura 2: Análise da expressão de α-sinucleína humana no SN de camundongos tratados com diferentes doses de AAV-hαSyn. Os camundongos receberam AAV-hαSyn em (A) 1 x 1010 vg/mouse, (B) 1 x 109 vg/mouse, ou (C) 1 x 108 vg/mouse e 12 semanas depois foram sacrificados, e a expressão hαSyn foi analisada pela imunofluorescência no SN usando microscopia de epifluorescência. Os núcleos estavam manchados com DAPI. Imagens representativas de coloração mesclada ou única de hαSyn (vermelho) ou DAPI (azul). As barras de escala são de 118 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Análise da expressão de α-sinucleína humana no estriado de camundongos tratados com diferentes doses de AAV-hαSyn. Os ratos receberam AAV-hαSyn em (A) 1 x 1010 vg/mouse, (B) 1 x 109 vg/mouse, ou (C) 1 x 108 vg/mouse) e 12 semanas depois foram sacrificados, e a expressão hαSyn foi analisada por imunofluorescência na estria usando microscopia de epifluorescência. Os núcleos estavam manchados com DAPI. Imagens representativas de coloração mesclada ou única de hαSyn (vermelho) ou DAPI (azul). Barras de escala são 100 μm. A inserção no canto superior direito das imagens mescladas mostra uma área de interesse em maior ampliação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Perda de neurônios dopaminérgicos do SN em camundongos tratados com diferentes doses de AAV-hαSyn ou vetor de controle. Os ratos receberam AAV-hαSyn (1 x10 10 vg/mouse, 1 x 109 vg/mouse, ou 1 x 108 vg/mouse) ou AAV-GFP (1 x 1010 vg/mouse) e 12 semanas depois foram sacrificados, e o TH foi analisado no SNpc pela imunohistoquímica. (A) Imagens representativas. Barras de escala, 100 μm. (B,C) A densidade dos neurônios foi quantificada como o número de neurônios TH+ /mm2. Os dados representam ± sem. n = 3 a 8 camundongos por grupo. (B) Foi realizada uma comparação do ipsilateral com os lados contralaterais utilizando-se o teste t do aluno emparelhado de duas caudas. (C) Foi realizada uma comparação dos lados ipsilaterais dos camundongos que recebem 1 x10 10 vg/mouse de AAV-hαSyn ou AAV-GFP. (B,C) Considerando que as barras brancas indicam a quantificação de neurônios TH+ no lado ipsilateral dos camundongos que recebem AAV-hαSyn, as barras verdes indicam a quantificação de neurônios TH+ no lado ipsilateral dos camundongos que recebem AAV-GFP. As barras cinzentas indicam a quantificação dos neurônios TH+ no lado contralateral do grupo correspondente. As comparações foram realizadas por um teste t-t de um aluno não-acompanhado de duas caudas. *p < 0,05; **p < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: Análise do desempenho motor em camundongos tratados com diferentes doses de AAV-hαSyn. Os camundongos receberam doses diferentes (1 x 1010 vg/mouse, 1 x 109 vg/mouse, ou 1 x 108 vg/mouse) de AAV-hαSyn ou AAV-GFP, e 12 semanas depois, o desempenho do motor foi avaliado pelo teste do feixe. (A) Imagem de um rato andando na viga. (B) O número de erros realizados pelos membros esquerdos (contralateral) versus membros direito (ipsilateral) foi quantificado nos grupos de camundongos que recebem AAV-hαSyn. (C) O número total de erros foi comparado entre diferentes grupos experimentais que receberam a mesma dose de AAV-hαSyn ou AAV-GFP. Os dados representam ± SEM. n = 3-5 ratos por grupo. As comparações foram realizadas por (B) um teste t-t de duas caudas emparelhado ou por (C) um teste t de um aluno de duas caudas não remunerado. *p < 0,05; **p < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Configuração da cinética do modelo da doença de Parkinson induzida por AAV-αSynApós determinar a dose adequada de AAV-hαSyn usada para induzir um nível significativo de neurodegeneração e comprometimento motor, foram realizados experimentos para definir o início da superexpressão hαSyn. Para isso, os camundongos foram tratados com 1 x 1010 vg/mouse de AAV-hαSyn ou cirurgia falsa. A extensão da expressão hαSyn foi analisada no SN uma vez por semana durante as semanas 2-5 após a cirurgia estereotaxa (ver o desenho experimental em Figura Suplementar 2). Os resultados mostram que, apesar da expressão hαSyn ter sido detectada em níveis baixos até 2 semanas após a cirurgia, os clusters hαSyn apareceram na semana 5 após a cirurgia estereotaxa (Figura 6). Figura 6: Análise do curso temporal da expressão de α-sinucleína humana no SN de camundongos tratados com AAV-hαSyn. Os camundongos receberam AAV-hαSyn (1 x10 10 vg/mouse) ou apenas a falsa cirurgia estereotaxa, e a expressão de hαSyn no SN foi analisada (A) 2 semanas, (B) 3 semanas, (C) 4 semanas, ou (D) 5 semanas depois por imunoorescência usando microscopia de epifluorescência. Os núcleos estavam manchados com DAPI. Imagens representativas de coloração mesclada ou única de hαSyn (vermelho) ou DAPI (azul). Barras de escala, 100 μm. A inserção no canto superior direito das imagens mescladas mostra uma área de interesse em maior ampliação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Posteriormente, foram realizados experimentos para determinar os pontos de tempo adequados para analisar a neuroinflamação e infiltração de células T no sistema nervoso central (SNC) após a entrega estereotipada de AAV-hαSyn. Para determinar o pico de ativação microglial após o tratamento de camundongos com AAV-hαSyn, a extensão das células expressando altos níveis de Iba1 no estriato foi avaliada uma vez por semana durante as semanas 2-15 após a cirurgia estereotaxa. Os resultados mostram um aumento significativo na ativação microglial do lado ipsilateral em comparação com o lado contralateral dos camundongos 15 semanas após o tratamento AAV-hαSyn (Figura 7). O número de células Treg (CD4+ Foxp3+) infiltradas no SNpc também foi avaliado em diferentes momentos após a entrega estereotipada de AAV-hαSyn por imunofluorescência seguida de observação de microscopia confocal. Os resultados mostram que o pico de infiltração de Treg no SNpc foi de 11 semanas após a cirurgia, enquanto a extensão do Treg infiltrando-se nesta área do cérebro foi menor na semana 8 ou semana 13 após a cirurgia (Figura 8). Não foram detectadas células T CD4+ infiltrando-se no estriato (dados não mostrados). Ao todo, esses resultados indicam que, usando 1 x 1010 vg/mouse de AAV-hαSyn, o ponto de tempo mais adequado para analisar a neuroinflamção é a semana 15 após a cirurgia estereotaxa, enquanto um ponto de tempo adequado para analisar a infiltração de células T no CNS parece ser a semana 11 após o tratamento AAV-hαSyn. Figura 7: Análise do curso temporal de ativação microglial em camundongos inoculados com AAV-hαSyn. Os camundongos receberam AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/mouse), e a ativação microglial foi avaliada pela análise imunohistoquímica de Iba1 no estriado em diferentes momentos após a cirurgia. (A) Imagens de visão geral representativas da análise imunohistoquímica de Iba1 de camundongos sacrificados 5 semanas, 10 semanas ou 15 semanas após a inoculação com AAV-hαSyn são mostradas. Barras de escala, 110 μm. (B) A densidade de microglia ativada foi quantificada à medida que o número de células expressando altos níveis de Iba1 e forma de ameboide por área. Os dados representam ± médias SEM. n = 3 camundongos por grupo. Um teste t de duas caudas emparelhado do student foi usado para determinar diferenças estatísticas entre ipsilateral e Iba1 contralateral em cada grupo. *p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 8: Análise do curso temporal da infiltração de células T CD4+ no SN de camundongos inoculados com AAV-hαSyn. Os ratos repórteresfoxp3 gfp receberam AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/mouse). A presença de células T CD4+ expressando Foxp3 e a presença de neurônios TH+ foram analisadas em diferentes pontos de tempo (semana 8, semana 11 e semana 13 após a cirurgia) no SN por imunofluorescência. (A) Imagens representativas para imunossuperamento único ou a fusão são mostradas. Barras de escala, 100 μm. (B) O número de células CD4+ Foxp3+ T por área no SN foi quantificado. Os dados representam ± SEM média de 3 camundongos por grupo. *p<0,05, células IPSilateral versus Contralateral CD4+ Foxp3+ T por teste t do aluno de duas caudas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura suplementar 1: Desenho experimental para avaliação do efeito de diferentes doses de vetores de AAV sobre patologia da sinucleína, neurodegeneração e comprometimento motor. Os camundongos C57BL/6 machos do tipo selvagem foram anestesiados e receberam inoculação estereotaxica de diferentes doses (1 x 1010 vg/mouse, 1 x 109 vg/mouse, ou 1 x 108 vg/mouse) de AAV codificando α-sinucleína humana (AAV-hαSyn) ou eGFP (AAV-GFP) sob o controle do promotor CBA na substantia nigra direita (SN). Após 12 semanas, a expressão de GFP e hαSyn no SN e estriatum (Str) foi avaliada por imunofluorescência (IF), células de hidroxilase tyrosina positiva (TH+) foram quantificadas pela imunohistoquímica (IHC) no SN, e o desempenho motor foi avaliado pelo teste de feixe. O número de camundongos em cada grupo experimental é indicado entre parênteses. * indica grupos onde um rato morreu antes das análises. Cada análise indica entre parênteses o número da figura do corpo do papel onde os resultados correspondentes são mostrados. Clique aqui para baixar este Arquivo. Figura suplementar 2: Desenho experimental para determinar a cinética da infiltração de células T, neuroinflamação e expressão hαSyn. Os ratos repórteres foxp3gfp foram anestesiados e receberam inoculação estereotaxa de AAV (1 x 1010 vg/mouse) codificando α-sinucleína (AAV-hαSyn) sob o controle do promotor cba na substantia nigra (SN) ou cirurgia falsa (PBS). Os camundongos foram sacrificados em diferentes pontos de tempo, e a expressão de hαSyn no SN e estriatum foi avaliada por imunofluorescência (IF), GFP (Foxp3), CD4 e células hidroxilase positivas de tyrosina (TH+) foram quantificadas pelo IF no SN, e a expressão Iba1 foi analisada pela imunohistoquímica (IHC) no estriatum (Str). O número de ratos em cada grupo experimental é indicado. A faixa de pontos de tempo incluídos em cada análise é indicada. Cada análise indica entre parênteses o número da figura do corpo do papel onde os resultados correspondentes são mostrados. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Discussion

O modelo de neurodegeneração do camundongo aqui analisado pode ajudar a estudar muitos aspectos críticos envolvidos na fisiopatologia da doença de Parkinson, incluindo os mecanismos envolvidos na patologia αSyn e ativação microglial, o envolvimento do sistema imunológico periférico na regulação da neuroinflamação e os mecanismos de neurodegeneração. Entre os mecanismos envolvidos na patologia αSyn estão os mecanismos subcelulares associados à disfunção mitocondrial, lisosômica ou proteassômica na presença de uma carga excessiva de αSyn nos neurônios dopaminérgicos da SN². É importante considerar que, além da expressão hαSyn induzida pela transdução mediada por AAV, o rato endógeno αSyn também contribui para a carga da expressão total αSyn. Camundongos transgênicos que expressam excessivamente o camundongo αSyn desenvolvem patologia synucleina semelhante, neuropatologia e comprometimento motor para esses modelos de camundongos com base na superexpressão de hαSyn³². Em relação à ativação microglial, o modelo atual do mouse pode ser usado para estudar como diferentes atores moleculares e celulares, como citocinas, neurotransmissores, astrócitos, neurônios, a barreira hematoencefálica e células T podem regular a aquisição de fenótipos funcionais pró-inflamatórios ou anti-inflamatórios ^8,10,11 . Este modelo também constitui uma importante ferramenta para estudar o papel do sistema imunológico periférico, incluindo não apenas células T, mas também macrófagos, monócitos e neutrófilos, sobre os processos de neuroinflamação e neurodegeneração dos neurônios^nigrais 11,33,34. Por fim, este modelo de camundongos também representa um sistema valioso para estudar os mecanismos celulares e moleculares da neurodegeneração in vivo, incluindo aqueles induzidos por processos celulares internos, como estresse oxidativo, déficits energéticos e organelas danificadas ², ou aqueles exercidos por atores externos, como fatores neurotóxicos produzidos por células microgliais, astrócitos e células T citotóxixas⁸^, 28,29,35.

Uma limitação deste modelo de camundongo é o estudo de como a agregação patológica de αSyn em locais extra-cerebrais pode constituir os estágios iniciais no desenvolvimento da doença de Parkinson³⁶. A este respeito, há evidências crescentes indicando que, antes da neurodegeneração de neurônios negros e comprometimento motor, a patologia αSyn começa na mucosa intestinal e no epitélio olfativo³⁶ e, provavelmente, na resposta αSyn-específica t-cell, bem como¹². Depois, os agregados αSyn migrariam através do nervo vago para o tronco cerebral, desencadeando a neuroinflamação e neurodegeneração dos neurônios dopaminérgicos¹². Embora o modelo AAV-hαSyn recapitula a maioria dos aspectos da doença de Parkinson, não há evidente envolvimento da agregação patológica de αSyn em locais extra-cerebrais neste modelo. Um modelo alternativo envolvendo a patologia hαSyn apropriada para estudar esses aspectos da doença de Parkinson pode ser camundongos transgênicos superexpressando hαSyn sob o controle do promotor Thy1, o thy1-SNCA modelo³⁷, no qual o desenvolvimento da doença é dependente da microbiota intestinal e envolve um evidente comprometimento gastrointestinal³⁸.

Embora seja útil para o estudo dos diversos processos associados à fisiopatologia da doença de Parkinson, o modelo atual do camundongo envolve etapas críticas que devem ser minuciosamente verificadas, incluindo a correta entrega dos vetores virais nas coordenadas espaciais correspondentes, a expressão seletiva de hαSyn em neurônios (que depende do sorotipo AAV e da construção vetorial), e a dose e o tempo adequados de AAV antes de analisar o fenótipo parkinsoniano. A análise da entrega adequada dos vetores virais no SN é necessária, pois o uso das coordenadas espaciais corretas do SN pode não ser suficiente quando a agulha não é totalmente reta, o que às vezes é imperceptível ao olho humano. Além disso, a difusão dos vetores AAV depende do sorotipo AAV³⁹. Por essas razões, é necessário realizar controles periódicos de qualidade verificando a entrega e difusão correta dos vetores AAV-GFP injetados após a observação de GFP em fatias cerebrais contendo a área do SN.

Quanto à expressão seletiva de hαSyn nos neurônios, em princípio, a expressão de hαSyn poderia ser projetada para ser controlada por um promotor seletivo para neurônios ou, ainda mais preciso, seletivo para neurônios dopaminérgicos, como o uso do promotor de TH em vetores AAV para induzir a expressão seletiva de genes em neurônios dopaminérgicos⁴⁰ . No entanto, essa estratégia não funciona quando o que se busca é a superexpressão do gene de interesse. Por essa razão, no modelo atual, é essencial utilizar um promotor forte (um promotor induzindo alta expressão do gene a jusante) e sorotipos AAV com tropismo neuronal. Neste estudo, o promotor da CBA foi utilizado como um forte promotor para induzir a superexpressão de hαSyn, e o sorotipo AAV5 foi utilizado para o vetor viral. Este sorotipo já foi usado antes para transduzir neurônios de camundongos e ratos^41,42. Aqui, os resultados demonstraram que, 12 semanas após a entrega de AAV5-GFP no SN de camundongos, a fluorescência verde estava seletivamente presente no lado ipsilateral tanto do SN quanto do estriado (Figura 1), indicando a transdução eficiente dos neurônios da via nigrostriatal.

Outro aspecto crítico deste modelo de camundongos da doença de Parkinson é o ponto de tempo necessário para analisar um determinado processo após a cirurgia. Nesse sentido, este trabalho mostra um estudo cinético de diferentes processos envolvidos na patologia. Uma vez que os pontos-chave mudam com a dose de genomas virais dada por camundongo, o sorotipo de AAV utilizado, ou mesmo com o lote de AAV utilizado, uma análise dose-resposta da quantidade de AAV-αSyn necessária para induzir uma perda significativa de neurônios TH+ e prejuízo motor foi realizada pela primeira vez. Estudos anteriores mostraram prejuízo motor significativo e perda de neurônios TH+ da via nigrostriatal após 12 semanas de injeções AAV-αSyn em camundongos em doses que variam de 6 x 10^8-3 x 10¹⁰ genomas virais por rato 16,17,30,31. Assim, a dose de AAV-hαSyn usada para induzir a expressão hαSyn na via nigrostriatal, a perda de neurônios TH⁺ e o comprometimento motor em camundongos variaram de 1 x 10^8-1 x 10¹⁰ genomas virais por rato. Além disso, para controlar que a perda de neurônios TH⁺ e o comprometimento motor foram induzidos pela superexpressão de hαSyn no SN e não pela infecção por AAV de neurônios do SN, foram incluídos grupos de controle nos quais a codificação de AAV para um gene repórter (AAV-eGFP) foi entregue unilateralmente no SN de camundongos e foram determinados prejuízos neurodegeneração e motor. Os resultados mostraram que, 12 semanas após a cirurgia estereoxica, 1 x 10¹⁰ genomas virais por camundongo foi uma dose adequada de AAV5-hαSyn, pois os camundongos que receberam essa carga viral apresentaram hαSyn significativo na via nigrostriatal (Figura 2 e Figura 3), perda de neurônios TH+ (Figura 4) e comprometimento motor (Figura 5). Em contraste, doses mais baixas de AAV5-hαSyn (1 x 10⁸ genomas virais por rato e 1 x 10⁹ genomas virais por rato) não foram fortes o suficiente para alcançar mudanças significativas em todos esses parâmetros (Figuras 2-4). Note-se que a administração do AAV-GFP em 1 x 10¹⁰ genomas virais por camundongo induziu um baixo (~20%), mas grau significativo de perda de neurônios TH⁺ de neurônios dopaminérgicos nigral (Figura 4A,B). Este resultado concorda com observações anteriores usando este modelo⁴¹ e é provavelmente a consequência de um baixo nível de neuroinflamação induzido pela administração de vetores AAV no SN. No entanto, a extensão da perda de neurônios TH⁺ foi significativamente maior em camundongos que receberam AAV5-hαSyn em comparação com aqueles que receberam a mesma dose de AAV-GFP (Figura 4C). Note-se que a cinética da expressão hαSyn não depende apenas da eficiência da transdução, mas também da extensão da difusão AAV³⁹. Uma vez que a difusão do AAV depende do sorotipo AAV, os pontos de tempo precisos neste modelo animal podem variar ao usar outro sorotipo AAV diferente do AAV5.

Posteriormente, foi realizada uma análise cinética usando 1 x 10¹⁰ genomas virais por mouse para determinar os principais pontos de tempo neste modelo de mouse. Uma vez que as evidências atuais mostraram alguns sintomas precoces que aparecem antes do comprometimento motor, o que permitiria o diagnóstico precoce da doença de Parkinson^43,44, esses experimentos procuraram encontrar o ponto de tempo em que a expressão hαSyn já era evidente, mas na ausência de comprometimento motor. Os resultados mostram que o início da expressão hαSyn no SN foi de 5 semanas após a entrega estereotipada de AAV-hαSyn (Figura 6). Este ponto de tempo constitui um ponto temporal interessante para começar a administrar terapias adaptadas para parar os processos neuroinflamatórios e neurodegenerativos. Outros pontos-chave determinados aqui foram os horários de pico de dois eventos críticos associados ao processo de neuroinflamação: o tempo em que a microglia atinge o grau máximo de ativação e o tempo de infiltração máxima de células T no SN. Os resultados mostraram uma curva com tendência atingindo duas ondas de ativação microglial máxima, a primeira às 10 semanas após a cirurgia e a segunda às 15 semanas após a cirurgia (Figura 7). A análise cinética da infiltração de células T mostrou o tempo de pico da infiltração de Treg no SN às 11 semanas após a cirurgia estereotipada (Figura 8). Surpreendentemente, nenhuma célula T efeitoor (CD4⁺ Foxp3-) foi detectada ^{infiltrando-se} no SN durante o período analisado (semanas 8-13 após a cirurgia). Ao todo, esses resultados sugerem um período adequado de tempo para começar a administrar terapias voltadas para parar o processo de neuroinflamação e atenuar a infiltração de células T no SN usando este modelo pré-clínico, que varia entre a semana 5 após a cirurgia (o início da superexpressão hαSyn) e a semana 10 após a cirurgia (a primeira onda de neuroinflamação e infiltração de células T) (Figura 9).

Figura 9: Resumo dos principais pontos de tempo encontrados para este modelo animal. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos ao Dr. Sebastián Valenzuela e à Dra. Este trabalho contou com o apoio do “Financiamiento Basal para Centros Científicos y Tecnológicos de Excelencia de ANID” Centro Ciencia & Vida, FB210008 (para Fundação Ciencia & Vida) e pelo Centro de Gerociência para Saúde Cerebral e Metabolismo, FONDAP-15150012. Este trabalho também foi financiado pelas bolsas FONDECYT-1210013 (para R.P.) e FONDECYT-1150766 (para F.C.) da “Agencia Nacional de Investigación y DesarRollo de Chile (ANID)” e MJFF-10332.01 (para R.P.) e MJFF-17303 (para F.C.) da Fundação Michael J Fox para Pesquisa de Parkinson.

Materials

ANIMALS AND ANIMAL FOOD
Foxp3-GFP C57BL/6 mice	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)	Stock No: 023800
Laboratory Rodent Diet	LabDiet	Rodent Diet 5001	Standard Rodent diet
Wild-type C57BL/6 mice	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)	Stock No: 000664
VIRAL VECTORS
AAV5-CBA-αSyn	University of Iowa Viral Vector Core Facility	N/A	Stock concentration at 10E13 vg/mL
AAV5-CBA-eGFP	University of Iowa Viral Vector Core Facility	N/A	Stock concentration at 9.5 x 10E12 vg/mL
ANESTHETICS AND ANALGESICS
Isoflurane	Baxter	218082	1% for stereotaxic surgery
Ketamine	Drag Pharma	CHE30	70 mg/Kg for stereotaxic surgery
Sevoflurane	Baxter	VE2L9117	For before transcardial perfusion
Tramadol	Drag Pharma	DPH134	30 mg/Kg every 24 h
Xylazine	Centrovet	EHL40	9 mg/kg for stereotaxic surgery
EQUIPMENT
Beam test	Home made	N/A	horizontal beam 25 cm length and 3 cm width. The beam surface was covered by a metallic grid (1 cm²).
Cryostate	Leica	CM1520
Digital camera	Nikon	S2800 Coolpix	For recording the beam test performance
Microscope	Olympus	BX51	Used for IHC analysis (section 4.4)
Microscope	Olympus	IX71	Used for IF analysis (section 5.3)
Microscope	Leica	DMI8	Used for IF analysis (section 5.7)
New Standard Stereotaxic, mouse	Stoelting, Wood Dale, IL, USA	51500	stereotaxic frame for surgery
Peristaltic Pump	Masterflex	C-flex L/S16
Power supply unit	Olympus	U-RFL-T	Used for IF analysis (section 5.3)
Surgical suture	Sylkam®, B Braun	C0760171
Syringe 100 U	BD	324918	For anesthesia before transcardial perfusion, 29G needle
Syringe RN 5uL SYR W/O NEEDLE	Hamilton	HA-7641-01	For viral vector innoculation
BUFFERS AND REAGENTS
Aviden, Peroxidase Conjugate	Merck, Darmstadt, Germany	189728
Bovine Serum Albumin	Merck, Darmstadt, Germany	9048-46-8
Cryotrotection buffer	Home made	N/A	20% glycerine and 2% DMSO in PBS
DAPI	Abcam	ab228549
Diaminobenzidine	Merck, Darmstadt, Germany	D8001
Fluoromount -G T	Electron Microscopy Science	17984-25
Gelatin	Merck, Darmstadt, Germany	104078
Normal goat serum	Jackson ImmunoResearch Laboratory	5000121
Paraformaldehyde	Merck, Darmstadt, Germany	104005
PBS	Home made	N/A	0.125 M, pH 7.4
Peroxidase inactivating buffer	Home made	N/A	0.03% H₂O₂ in methanol
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5
Trizma Hydrochloride	Merck, Darmstadt, Germany	1185-53-1
Tween 20	Sigma-Aldrich	822184
ANTIBODIES
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratory	111065003
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546	ThermoFisher Scientific	A11010
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647	ThermoFisher Scientific	A21244
Goat anti-Rat IgG (H+L) Alexa Fluor 546	ThermoFisher Scientific	A11081
Rabbit monoclonal anti-alpha-Synuclein	Abcam	ab138501
Rabbit monoclonal anti-Iba-1	Abcam	EPR16588
Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase	Millipore	AB152
Rat monoclonal anti-CD4	Biolegend	100402
SOFTWARES
GraphPad	Prism	6.0	Fos stats analysis
ImageJ	National Institute of Health	N/A	For image analysis
LAS X	Leica	N/A	For image capture with Leica microscope
ProgRes Capture Pro	Jenoptik	N/A	For image capture with Olympus microscope
VLC media player	VideoLAN Organization	N/A	For analysis of behavioural tests

References

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Elgueta, D., Chovar, O., Ugalde, V., Sánchez-Guajardo, V., Catenaccio, A., Court, F., Pacheco, R. Analyzing the Parkinson’s Disease Mouse Model Induced by Adeno-associated Viral Vectors Encoding Human α-Synuclein. J. Vis. Exp. (185), e63313, doi:10.3791/63313 (2022).