Analisi del modello murino della malattia di Parkinson indotto da vettori virali adeno-associati che codificano la α-sinucleina umana
Summary
Questo lavoro analizza la dose vettoriale e il tempo di esposizione necessari per indurre neuroinfiammazione, neurodegenerazione e compromissione motoria in questo modello preclinico di malattia di Parkinson. Questi vettori che codificano la α-sinucleina umana vengono consegnati nella substantia nigra per ricapitolare la patologia sinucleina associata al morbo di Parkinson.
Abstract
La malattia di Parkinson è una malattia neurodegenerativa che comporta la morte dei neuroni dopaminergici della via nigrostriatale e, di conseguenza, la progressiva perdita di controllo dei movimenti volontari. Questo processo neurodegenerativo è innescato dalla deposizione di aggregati proteici nel cervello, che sono costituiti principalmente da α-sinucleina. Diversi studi hanno indicato che la neuroinfiammazione è necessaria per sviluppare la neurodegenerazione associata al morbo di Parkinson. In particolare, il processo neuroinfiammatorio coinvolge l’attivazione microgliale e l’infiltrazione di cellule T periferiche nella substantia nigra (SN). Questo lavoro analizza un modello murino della malattia di Parkinson che ricapitola l’attivazione microgliale, l’infiltrazione delle cellule T nel SN, la neurodegenerazione dei neuroni dopaminergici nigrali e la compromissione motoria. Questo modello murino della malattia di Parkinson è indotto dalla somministrazione stereotassica di vettori virali adeno-associati che codificano la α-sinucleina wild-type umana (AAV-hαSyn) nel SN. La corretta consegna di vettori virali nel SN è stata confermata utilizzando vettori di controllo che codificano per la proteina fluorescente verde (GFP). Successivamente, è stato valutato il modo in cui la dose di AAV-hαSyn somministrata nel SN ha influenzato l’estensione dell’espressione di hαSyn, la perdita di neuroni dopaminergici nigrali e la compromissione motoria. Inoltre, le dinamiche dell’espressione di hαSyn, dell’attivazione microgliale e dell’infiltrazione delle cellule T sono state determinate durante il decorso temporale dello sviluppo della malattia. Pertanto, questo studio fornisce punti temporali critici che possono essere utili per indirizzare la patologia della sinucleina e la neuroinfiammazione in questo modello preclinico della malattia di Parkinson.
Introduction
Dopo il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson è la seconda malattia neurodegenerativa più diffusa in tutto il mondo. I neuroni primari colpiti nella malattia di Parkinson sono quelli della via nigrostriatale, che producono dopamina e controllano il movimento volontario. Di conseguenza, il sintomo più caratteristico associato a questo disturbo è la compromissione motoria. Questa patologia comporta anche la deposizione di aggregati proteici nel cervello, che sono composti principalmente da α-sinucleina (αSyn)1, una proteina citosolica associata ai terminali presinaptici. L’evidenza ha dimostrato che la generazione di inclusioni patogene di αSyn è innescata da un misfolding o da alcune modifiche post-traduzionali di questa proteina2.
In particolare, è stata stabilita una stretta relazione tra la patologia αSyn e la perdita di neuroni dopaminergici della via nigrostriatale nella malattia di Parkinson umana e nei modelli animali 3,4. Capire come vengono generati gli aggregati αSyn e come inducono la morte neuronale rappresenta una sfida significativa nel campo. Un gruppo crescente di studi ha dimostrato che, aumentando lo stress ossidativo, la disfunzione mitocondriale è una delle principali cause per la generazione di aggregati αSyn2. Infatti, diversi geni associati al rischio di malattia di Parkinson codificano proteine coinvolte nella funzione mitocondriale, nella morfologia e nelladinamica 5,6. Inoltre, la disfunzione lisosomiale, che provoca l’accumulo di mitocondri disfunzionali e αSyn mal ripiegato, costituisce un altro evento importante che promuove la generazione di aggregati αSyn7.
Prove emergenti hanno indicato che, una volta che gli aggregati di αSyn si depositano nel cervello, queste proteine patogene stimolano i recettori toll-like (TLR) sulla microglia, innescando così l’attivazione microgliale e un ambiente infiammatorio iniziale nella substantia nigra (SN)8,9. Inoltre, l’evidenza indica che gli aggregati di αSyn vengono catturati e presentati dalle cellule che presentano l’antigene alle cellule T, inducendo una risposta immunitaria adattativa specifica per αSyn10,11. Queste cellule T αSyn-specifiche successivamente si infiltrano nel cervello e vengono ristimolate da microglia attivate, promuovendo così la secrezione di fattori neurotossici che evocano la morte neuronale 9,10. È interessante notare che diverse linee di prova hanno suggerito che gli aggregati αSyn vengono generati prima nel sistema nervoso enterico e poi trasportati attraverso il nervo vago al tronco cerebrale12.
Diversi modelli animali di morbo di Parkinson sono stati utilizzati per molti anni, compresi quelli indotti dalla somministrazione di sostanze neurotossiche (cioè 6-idrossidopamina, paraquat, rotenone, 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina) e quelli che coinvolgono condizioni genetiche (cioè α-sinucleina mutante, chinasi ripetuta 2 ricca di leucina mutante)13 . Nonostante i modelli che coinvolgono la neurodegenerazione indotta da neurotossine che replicano alcuni aspetti della malattia di Parkinson, nessuno di essi ricapitola tutti gli aspetti essenziali della malattia o non sono progressivi13. D’altra parte, sebbene i modelli murini genetici che coinvolgono l’espressione di versioni mutanti della chinasi ripetuta 2 ricca di leucina, le versioni mutanti della α-sinucleina o la sovraespressione della α-sinucleina wild-type umana provochino compromissione motoria e, in alcuni casi, anche lo sviluppo della sinucleinopatia, non riproducono una neurodegenerazione prominente dei neuroni dopaminergici ninigrali, che è un aspetto essenziale della malattia di Parkinson13, 14. Un terzo tipo di modello animale di neurodegenerazione è riuscito a soddisfare la maggior parte degli aspetti essenziali della malattia di Parkinson, la somministrazione stereotassica di vettori virali adeno-associati (AAV) che codificano per la α-sinucleina umana (AAV-hαSyn)14,15. È importante sottolineare che gli AAV consentono la trasduzione di neuroni con elevata efficacia e a lungo termine nel cervello adulto dei mammiferi. Inoltre, la somministrazione stereotassica di AAV-hαSyn nel SN ha dimostrato di riprodurre molti degli aspetti essenziali della malattia, tra cui la patologia αSyn, l’attivazione microgliale, la neurodegenerazione e la compromissione motoria 16,17,18,19,20. Questo studio presenta un’analisi di come la dose di vettore virale e il tempo dopo la consegna del vettore virale influenzano l’estensione dell’espressione di hαSyn, la neurodegenerazione e la neuroinfiammazione nella via nigrostriatale, nonché il grado di compromissione motoria nel modello murino di consegna stereotassica unilaterale di hαSyn nel SN.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il modello murino di neurodegenerazione qui analizzato potrebbe aiutare a studiare molti aspetti critici coinvolti nella fisiopatologia della malattia di Parkinson, compresi i meccanismi coinvolti nella patologia αSyn e nell’attivazione microgliale, il coinvolgimento del sistema immunitario periferico nella regolazione della neuroinfiammazione e i meccanismi della neurodegenerazione. Tra i meccanismi coinvolti nella patologia αSyn ci sono quei meccanismi subcellulari associati a disfunzione mitocondriale, lisosomiale o proteasomiale in presenza di un carico eccessivo di αSyn nei neuroni dopaminergici dell’SN2. È importante considerare che, oltre all’espressione hαSyn indotta dalla trasduzione mediata da AAV, il topo endogeno αSyn contribuisce anche al carico dell’espressione totale di αSyn. I topi transgenici che sovraesprimono αSyn sviluppano patologia sinucleina, neuropatologia e compromissione motoria simili a quei modelli murini basati sulla sovraespressione di hαSyn32. Per quanto riguarda l’attivazione microgliale, il presente modello murino potrebbe essere utilizzato per studiare come diversi attori molecolari e cellulari come citochine, neurotrasmettitori, astrociti, neuroni, barriera emato-encefalica e cellule T potrebbero regolare l’acquisizione di fenotipi funzionali pro-infiammatori o anti-infiammatori 8,10,11 . Questo modello costituisce anche un importante strumento per studiare il ruolo del sistema immunitario periferico, comprendente non solo le cellule T ma anche macrofagi, monociti e neutrofili, sui processi di neuroinfiammazione e neurodegenerazione dei neuroni nigrali 11,33,34. Infine, questo modello murino rappresenta anche un valido sistema per studiare i meccanismi cellulari e molecolari della neurodegenerazione in vivo, compresi quelli indotti da processi cellulari interni, come lo stress ossidativo, i deficit energetici e gli organelli danneggiati 2, o quelli esercitati da attori esterni, come i fattori neurotossici prodotti da cellule microgliali, astrociti e cellule T citotossiche8, 28,29,35.
Un limite di questo modello murino è lo studio di come l’aggregazione patologica di αSyn in posizioni extra-cerebrali potrebbe costituire le fasi iniziali nello sviluppo della malattia di Parkinson36. A questo proposito, ci sono prove crescenti che indicano che, prima della neurodegenerazione dei neuroni nigrali e della compromissione motoria, la patologia αSyn inizia nella mucosa intestinale e nell’epitelio olfattivo36 e, probabilmente, nella risposta delle cellule T αSyn-specifica anche12. Successivamente, gli aggregati αSyn migrerebbero attraverso il nervo vago verso il tronco cerebrale, innescando la neuroinfiammazione e la neurodegenerazione dei neuroni dopaminergici12. Sebbene il modello AAV-hαSyn ricapitoli la maggior parte degli aspetti della malattia di Parkinson, non vi è alcun evidente coinvolgimento dell’aggregazione patologica di αSyn in posizioni extra-cerebrali in questo modello. Un modello alternativo che coinvolge la patologia hαSyn appropriato per studiare questi aspetti della malattia di Parkinson potrebbe essere topi transgenici che sovraesprimono hαSyn sotto il controllo del promotore Thy1, il modello Thy1-SNCA 37, in cui lo sviluppo della malattia dipende dal microbiota intestinale e comporta un evidente deterioramento gastrointestinale38.
Sebbene sia utile per lo studio dei diversi processi associati alla fisiopatologia della malattia di Parkinson, il presente modello murino comporta passaggi critici che dovrebbero essere minuziosamente controllati, tra cui la corretta consegna dei vettori virali nelle coordinate spaziali corrispondenti, l’espressione selettiva di hαSyn nei neuroni (che dipende dal sierotipo AAV e dal costrutto vettoriale), e la corretta dose di AAV e la tempistica prima di analizzare il fenotipo parkinsoniano. L’analisi della corretta consegna dei vettori virali nel SN è necessaria, in quanto l’uso delle coordinate spaziali corrette del SN potrebbe non essere sufficiente quando l’ago non è completamente dritto, che a volte è impercettibile per l’occhio umano. Inoltre, la diffusione dei vettori AAV dipende dal sierotipoAAV 39. Per questi motivi, è necessario eseguire controlli periodici di qualità verificando la corretta consegna e diffusione dei vettori AAV-GFP iniettati a seguito dell’osservazione della GFP in fette di cervello contenenti l’area del SN.
Per quanto riguarda l’espressione selettiva di hαSyn nei neuroni, in linea di principio, l’espressione di hαSyn potrebbe essere progettata per essere controllata da un promotore selettivo per i neuroni o, ancora più precisamente, selettiva per i neuroni dopaminergici, come l’uso del promotore TH nei vettori AAV per indurre l’espressione selettiva dei geni nei neuroni dopaminergici40 . Tuttavia, questa strategia non funziona quando ciò che si cerca è la sovraespressione del gene di interesse. Per questo motivo, nel presente modello, è essenziale utilizzare un promotore forte (un promotore che induce un’alta espressione del gene a valle) e sierotipi AAV con tropismo neuronale. In questo studio, il promotore CBA è stato utilizzato come promotore forte per indurre la sovraespressione di hαSyn e il sierotipo AAV5 è stato utilizzato per il vettore virale. Questo sierotipo è stato usato in precedenza per trasdurre i neuroni di topo e ratto41,42. Qui, i risultati hanno dimostrato che, 12 settimane dopo la somministrazione di AAV5-GFP nel SN dei topi, la fluorescenza verde era selettivamente presente sul lato ipsilaterale sia del SN che dello striato (Figura 1), indicando l’efficiente trasduzione dei neuroni della via nigrostriatale.
Un altro aspetto critico di questo modello murino della malattia di Parkinson è il punto temporale necessario per analizzare un particolare processo dopo l’intervento chirurgico. A questo proposito, questo lavoro mostra uno studio cinetico di diversi processi coinvolti nella patologia. Poiché i punti temporali chiave cambiano con la dose di genomi virali somministrati per topo, il sierotipo di AAV utilizzato, o anche con il lotto di AAV utilizzato, è stata effettuata per la prima volta un’analisi dose-risposta della quantità di AAV-αSyn necessaria per indurre una significativa perdita di neuroni TH + e compromissione motoria. Studi precedenti hanno mostrato una significativa compromissione motoria e una perdita di neuroni TH+ della via nigrostriatale dopo 12 settimane di iniezioni di AAV-αSyn nei topi a dosi comprese tra 6 x 108-3 x 1010 genomi virali per topo 16,17,30,31. Di conseguenza, la dose di AAV-hαSyn utilizzata per indurre l’espressione di hαSyn nella via nigrostriatale, la perdita di neuroni TH+ e la compromissione motoria nei topi variavano da 1 x 108-1 x 1010 genomi virali per topo. Inoltre, per controllare che la perdita di neuroni TH+ e la compromissione motoria fossero indotte dalla sovraespressione di hαSyn nel SN e non dall’infezione AAV dei neuroni del SN, sono stati inclusi gruppi di controllo in cui AAV codificante per un gene reporter (AAV-eGFP) è stato erogato unilateralmente nel SN di topi e sono stati determinati neurodegenerazione e compromissione motoria. I risultati hanno mostrato che, 12 settimane dopo l’intervento stereotassico, 1 x 1010 genomi virali per topo era una dose corretta di AAV5-hαSyn, poiché i topi che ricevevano questa carica virale mostravano hαSyn significativo nella via nigrostriatale (Figura 2 e Figura 3), perdita di neuroni TH+ (Figura 4) e compromissione motoria (Figura 5). Al contrario, dosi più basse di AAV5-hαSyn (1 x 108 genomi virali per topo e 1 x 109 genomi virali per topo) non erano abbastanza forti da raggiungere cambiamenti significativi in tutti questi parametri insieme (Figure 2-4). Da notare, la somministrazione di AAV-GFP a 1 x 1010 genomi virali per topo ha indotto un basso (~20%), ma significativo grado di perdita di neuroni TH+ di neuroni dopaminergici ninigrali (Figura 4A,B). Questo risultato concorda con le precedenti osservazioni che utilizzano questo modello41 ed è probabilmente la conseguenza di un basso livello di neuroinfiammazione indotto dalla somministrazione di vettori AAV nel SN. Tuttavia, l’entità della perdita di neuroni TH+ era significativamente più alta nei topi che ricevevano AAV5-hαSyn rispetto a quelli che ricevevano la stessa dose di AAV-GFP (Figura 4C). Da notare, la cinetica dell’espressione di hαSyn non dipende solo dall’efficienza della trasduzione, ma anche dall’estensione della diffusione AAV39. Poiché la diffusione dell’AAV dipende dal sierotipo AAV, i punti temporali chiave precisi in questo modello animale possono variare quando si utilizza un altro sierotipo AAV diverso da AAV5.
Successivamente, è stata condotta un’analisi cinetica utilizzando 1 x 1010 genomi virali per topo per determinare i punti temporali chiave in questo modello murino. Poiché le prove attuali hanno mostrato alcuni sintomi precoci che compaiono prima della compromissione motoria, che consentirebbe la diagnosi precoce della malattia di Parkinson43,44, questi esperimenti hanno cercato di trovare il punto temporale in cui l’espressione di hαSyn era già evidente ma in assenza di compromissione motoria. I risultati mostrano che l’insorgenza dell’espressione di hαSyn nel SN è avvenuta a 5 settimane dopo la somministrazione stereotassica di AAV-hαSyn (Figura 6). Questo punto temporale costituisce un punto temporale interessante per iniziare a somministrare terapie su misura per fermare i processi neuroinfiammatori e neurodegenerativi. Altri punti temporali chiave qui determinati sono stati i tempi di picco per due eventi critici associati al processo di neuroinfiammazione: il momento in cui le microglia raggiungono il massimo grado di attivazione e il tempo di infiltrazione massima delle cellule T nel SN. I risultati hanno mostrato una curva con un trend che raggiunge due ondate di massima attivazione microgliale, la prima a 10 settimane dopo l’intervento e la seconda a 15 settimane dopo l’intervento (Figura 7). L’analisi cinetica dell’infiltrazione delle cellule T ha mostrato il tempo di picco dell’infiltrazione di Treg nel SN a 11 settimane dopo l’intervento stereotassico (Figura 8). Sorprendentemente, nessuna cellula T effettrice (CD4 + Foxp3–) è stata rilevata infiltrandosi nel SN durante il periodo di tempo analizzato (settimane 8-13 dopo l’intervento chirurgico). Complessivamente, questi risultati suggeriscono un adeguato lasso di tempo per iniziare a somministrare terapie orientate a fermare il processo di neuroinfiammazione e attenuare l’infiltrazione delle cellule T nel SN utilizzando questo modello preclinico, che varia tra la settimana 5 dopo l’intervento chirurgico (l’inizio della sovraespressione di hαSyn) e la settimana 10 dopo l’intervento chirurgico (la prima ondata di neuroinfiammazione e infiltrazione delle cellule T) (Figura 9).
Figura 9: Riepilogo dei punti temporali chiave trovati per questo modello animale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. Sebastián Valenzuela e il Dr. Micaela Ricca per la loro preziosa assistenza veterinaria nella nostra struttura per animali. Questo lavoro è stato supportato da “Financiamiento Basal para Centros Científicos y Tecnológicos de Excelencia de ANID” Centro Ciencia & Vida, FB210008 (a Fundación Ciencia & Vida), e il Geroscience Center for Brain Health and Metabolism, FONDAP-15150012. Questo lavoro è stato anche finanziato dalle sovvenzioni FONDECYT-1210013 (a R.P.) e FONDECYT-1150766 (a F.C.) da “Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo de Chile (ANID)” e MJFF-10332.01 (a R.P.) e MJFF-17303 (a F.C.) dalla Michael J Fox Foundation for Parkinson’s Research.
Materials
| ANIMALS AND ANIMAL FOOD | |||
| Foxp3-GFP C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock No: 023800 | |
| Laboratory Rodent Diet | LabDiet | Rodent Diet 5001 | Standard Rodent diet |
| Wild-type C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock No: 000664 | |
| VIRAL VECTORS | |||
| AAV5-CBA-αSyn | University of Iowa Viral Vector Core Facility | N/A | Stock concentration at 10E13 vg/mL |
| AAV5-CBA-eGFP | University of Iowa Viral Vector Core Facility | N/A | Stock concentration at 9.5 x 10E12 vg/mL |
| ANESTHETICS AND ANALGESICS | |||
| Isoflurane | Baxter | 218082 | 1% for stereotaxic surgery |
| Ketamine | Drag Pharma | CHE30 | 70 mg/Kg for stereotaxic surgery |
| Sevoflurane | Baxter | VE2L9117 | For before transcardial perfusion |
| Tramadol | Drag Pharma | DPH134 | 30 mg/Kg every 24 h |
| Xylazine | Centrovet | EHL40 | 9 mg/kg for stereotaxic surgery |
| EQUIPMENT | |||
| Beam test | Home made | N/A | horizontal beam 25 cm length and 3 cm width. The beam surface was covered by a metallic grid (1 cm2). |
| Cryostate | Leica | CM1520 | |
| Digital camera | Nikon | S2800 Coolpix | For recording the beam test performance |
| Microscope | Olympus | BX51 | Used for IHC analysis (section 4.4) |
| Microscope | Olympus | IX71 | Used for IF analysis (section 5.3) |
| Microscope | Leica | DMI8 | Used for IF analysis (section 5.7) |
| New Standard Stereotaxic, mouse | Stoelting, Wood Dale, IL, USA | 51500 | stereotaxic frame for surgery |
| Peristaltic Pump | Masterflex | C-flex L/S16 | |
| Power supply unit | Olympus | U-RFL-T | Used for IF analysis (section 5.3) |
| Surgical suture | Sylkam®, B Braun | C0760171 | |
| Syringe 100 U | BD | 324918 | For anesthesia before transcardial perfusion, 29G needle |
| Syringe RN 5uL SYR W/O NEEDLE | Hamilton | HA-7641-01 | For viral vector innoculation |
| BUFFERS AND REAGENTS | |||
| Aviden, Peroxidase Conjugate | Merck, Darmstadt, Germany | 189728 | |
| Bovine Serum Albumin | Merck, Darmstadt, Germany | 9048-46-8 | |
| Cryotrotection buffer | Home made | N/A | 20% glycerine and 2% DMSO in PBS |
| DAPI | Abcam | ab228549 | |
| Diaminobenzidine | Merck, Darmstadt, Germany | D8001 | |
| Fluoromount -G T | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
| Gelatin | Merck, Darmstadt, Germany | 104078 | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 5000121 | |
| Paraformaldehyde | Merck, Darmstadt, Germany | 104005 | |
| PBS | Home made | N/A | 0.125 M, pH 7.4 |
| Peroxidase inactivating buffer | Home made | N/A | 0.03% H2O2 in methanol |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | |
| Trizma Hydrochloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1185-53-1 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 822184 | |
| ANTIBODIES | |||
| Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 111065003 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546 | ThermoFisher Scientific | A11010 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A21244 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Alexa Fluor 546 | ThermoFisher Scientific | A11081 | |
| Rabbit monoclonal anti-alpha-Synuclein | Abcam | ab138501 | |
| Rabbit monoclonal anti-Iba-1 | Abcam | EPR16588 | |
| Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | |
| Rat monoclonal anti-CD4 | Biolegend | 100402 | |
| SOFTWARES | |||
| GraphPad | Prism | 6.0 | Fos stats analysis |
| ImageJ | National Institute of Health | N/A | For image analysis |
| LAS X | Leica | N/A | For image capture with Leica microscope |
| ProgRes Capture Pro | Jenoptik | N/A | For image capture with Olympus microscope |
| VLC media player | VideoLAN Organization | N/A | For analysis of behavioural tests |
References
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