Différenciation robuste des CSPi humaines en une population pure d’adipocytes pour étudier les troubles associés aux adipocytes
Summary
Le protocole permet la génération d’une population adipocytaire pure à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi). L’acide rétinoïque est utilisé pour différencier les CSPi en cellules souches mésenchymateuses (CSM) qui sont utilisées pour produire des adipocytes. Ensuite, une approche de tri basée sur la coloration rouge du Nil est utilisée pour obtenir des adipocytes purs.
Abstract
Les progrès récents de la technologie des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) ont permis la génération de différents types de cellules, y compris les adipocytes. Cependant, les méthodes de différenciation actuelles ont une faible efficacité et ne produisent pas une population homogène d’adipocytes. Ici, nous contournons ce problème en utilisant une méthode entièrement trans basée sur les rétinoïques pour produire des cellules souches mésenchymateuses (CSM) à haut rendement. En régulant les voies régissant la prolifération, la survie et l’adhésion cellulaires, notre stratégie de différenciation permet la génération efficace de corps embryonnaires (EB) qui se différencient en une population pure de CSM multipotentes. Le nombre élevé de CSM générées par cette méthode constitue une source idéale pour la génération d’adipocytes. Cependant, l’hétérogénéité des échantillons résultant de la différenciation des adipocytes reste un défi. Par conséquent, nous avons utilisé une méthode à base de rouge du Nil pour purifier les adipocytes matures lipidiques à l’aide de FACS. Cette stratégie de tri nous a permis d’établir un moyen fiable de modéliser les troubles métaboliques associés aux adipocytes à l’aide d’un pool d’adipocytes avec une hétérogénéité d’échantillon réduite et une fonctionnalité cellulaire améliorée.
Introduction
Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) agissent comme une ressource transitoire efficace pour produire des cellules d’origine mésodermique comme les adipocytes, les ostéocytes et les chondrocytes, qui pourraient être utilisées pour modéliser leurs troubles génétiques respectifs. Cependant, les approches précédentes reposaient sur l’obtention de ces CSM à partir de tissus adultes 1, ce qui imposait le défi de les obtenir en grand nombre auprès des donneurs et la limitation de leur viabilité fonctionnelle dans des conditions de culture in vitro sous-optimales 1,2. Ces obstacles ont produit une grande demande d’avoir un protocole pour générer des CSM in vitro. Les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSPi) peuvent être utilisées comme source précieuse de CSM, présentant les caractéristiquesdes CSM 3,4,5. Les CSM dérivées des CSPi peuvent être utilisées comme option thérapeutique dans plusieurs maladies. En outre, la capacité des CSM dérivées des CSPi à générer des adipocytes en fait un modèle humain in vitro précieux pour étudier l’adipogenèse humaine, l’obésité et les troubles associés aux adipocytes.
Les protocoles actuels de différenciation des adipocytes peuvent être classés en deux groupes, l’un impliquant la différenciation des adipocytes à l’aide de cocktails chimiques ou à base de protéines donnant un rendement résultant de 30%-60%6,7,8,9, tandis que l’autre impliquant une manipulation génétique pour une induction robuste de facteurs de transcription clés régissant le développement des adipocytes pour donner un rendement de 80%-90%10, 11. Cependant, la manipulation génétique ne récapitule pas le processus naturel de différenciation des adipocytes et masque souvent les paradigmes subtils arrivant au cours de l’adipogenèse, ce qui la rend inefficace à des fins de modélisation de la maladie12,13. Par conséquent, nous présentons un moyen de trier les adipocytes matures dérivés chimiquement des adipocytes immatures en marquant par fluorescence les adipocytes lipidiques à l’aide de rouge du Nil.
Nous présentons ici un protocole impliquant l’incubation transitoire de corps embryoïdes (EB) dérivés de CSPi avec de l’acide rétinoïque tout-trans pour produire un grand nombre de CSM à prolifération rapide, qui pourraient être utilisés pour générer des adipocytes14. Nous présentons également un moyen de trier les adipocytes matures dérivés chimiquement du pool de différenciation hétérogène en marquant par fluorescence leurs gouttelettes lipidiques à l’aide d’un colorant lipophile; Nil rouge. Cela permettrait la génération d’une population pure d’adipocytes matures avec une fonctionnalité améliorée pour modéliser avec précision les troubles métaboliques associés aux adipocytes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole revêt une importance primordiale en raison de sa capacité à fournir des CSM à haut rendement et efficacité. Cette production à grande échelle de CSM a été rendue possible par l’incubation transitoire de SE dérivés de CSPi avec 10 μM de RA14,15. Le traitement transitoire avec 10 μM de PR a augmenté le rendement des CSM de 11,2 à 1542 fois14,15, ce protocole étant applicable ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par une subvention du Fonds national de recherche du Qatar (QNRF) (subvention n° NPRP10-1221-160041). Maryam Aghadi a bénéficié d’une bourse GSRA du Fonds national de recherche du Qatar (QNRF).
Materials
| Adiponectin | Abcam | ab22554 | Adipocyte maturation marker |
| anti-CD105 | BD Pharmingen | 560839 | MSC differentiation marker |
| anti-CD14 | BD Pharmingen | 561712 | MSC differentiation marker |
| anti-CD19 | BD Pharmingen | 555415 | MSC differentiation marker |
| anti-CD34 | BD Pharmingen | 555824 | MSC differentiation marker |
| anti-CD44 | abcam | ab93758 | MSC differentiation marker |
| anti-CD45 | BD Pharmingen | 560975 |
MSC differentiation marker |
| anti-CD73 | BD Pharmingen | 550256 | MSC differentiation marker |
| anti-CD90 | BD Pharmingen | 555596 | MSC differentiation marker |
| bFGF | R&D | 233-FP | MSC culture media supplement |
| C/EBPA | Abcam | ab40761 | Adipocyte maturation marker |
| Dexamethasone | Torics | 1126 | Adipocyte differentiation media supplement |
| FABP4 | Abcam | ab93945 | Adipocyte maturation marker |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10082147 | MSC culture media supplement |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050-061 | MSC culture media supplement |
| IBMX | Sigma Aldrich | I5879 | Adipocyte differentiation media supplement |
| Indomethacin | Sigma Aldrich | I7378 | Adipocyte differentiation media supplement |
| Insulin | Sigma Aldrich | 91077C | Adipocyte differentiation media supplement |
| Knockout DMEM | ThermoFisher | 12660012 | Basal media for preparing matrigel |
| Low glucose DMEM | ThermoFisher | 11885084 | MSC culturing media |
| Matrigel | Corning | 354230 | Coating matrix |
| MEM-alpha | ThermoFisher | 12561056 | Adipocyte differentiation media |
| Nilered | Sigma Aldrich | 19123 | Sorting marker for adipocyte |
| Penicillin | ThermoFisher | 15140122 | MSC/Adipocyte media supplement |
| Phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190144 | wash buffer |
| Pierce™ 20X TBS Buffer | Thermo Fisher | 28358 | wash buffer |
| PPARG | Cell Signaling Technology | 2443 | Adipocyte maturation marker |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | Dissociation reagent |
| Retinoic acid | Sigma Aldrich | R2625 | MSC differentiation media supplement |
| Rock inhibitor | Tocris | 1254/10 | hPSC culture media supplement |
| Roziglitazone | Sigma Aldrich | R2408 | Adipocyte differentiation media supplement |
| StemFlex | ThermoFisher | A334901 | hPSC culture media |
| Triton | Thermo Fisher | 28314 | Permebealization reagent |
| Trypsin | ThermoFisher | 25200072 | Dissociation reagent |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7942 | Wash buffer |
References
- Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling: CCS. 9, 12 (2011).
- Wagner, W., et al. Aging and replicative senescence have related effects on human stem and progenitor cells. PLoS One. 4 (6), 5846 (2009).
- Brown, P. T., Squire, M. W., Li, W. J. Characterization and evaluation of mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells and bone marrow. Cell and Tissue Research. 358 (1), 149-164 (2014).
- Trivedi, P., Hematti, P. Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells. Experimental Hematology. 36 (3), 350-359 (2008).
- Barberi, T., Willis, L. M., Socci, N. D., Studer, L. Derivation of multipotent mesenchymal precursors from human embryonic stem cells. PLoS Medicine. 2 (6), 161 (2005).
- Xiong, C., et al. Derivation of adipocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (6), 671-675 (2005).
- Cuaranta-Monroy, I., et al. Highly efficient differentiation of embryonic stem cells into adipocytes by ascorbic acid. Stem Cell Research. 13 (1), 88-97 (2014).
- van Harmelen, V., et al. Differential lipolytic regulation in human embryonic stem cell-derived adipocytes. Obesity (Silver Spring). 15 (4), 846-852 (2007).
- Noguchi, M., et al. In vitro characterization and engraftment of adipocytes derived from human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 22 (21), 2895-2905 (2013).
- Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
- Lee, Y. K., Cowan, C. A. Differentiation of white and brown adipocytes from human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 538, 35-47 (2014).
- Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (6), 2459-2483 (2021).
- Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
- Karam, M., Younis, I., Elareer, N. R., Nasser, S., Abdelalim, E. M. Scalable Generation of mesenchymal stem cells and adipocytes from human pluripotent stem cells. Cells. 9 (3), (2020).
- Karam, M., Abdelalim, E. M. Robust and highly efficient protocol for differentiation of human pluripotent stem cells into mesenchymal stem cells. Methods in Molecular Biology. , (2020).
- Li, L., Bennett, S. A., Wang, L. Role of E-cadherin and other cell adhesion molecules in survival and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Adhesion & Migration. 6 (1), 59-70 (2012).
- Lai, L., Bohnsack, B. L., Niederreither, K., Hirschi, K. K. Retinoic acid regulates endothelial cell proliferation during vasculogenesis. Development. 130 (26), 6465-6474 (2003).
- Chanchevalap, S., Nandan, M. O., Merlin, D., Yang, V. W. All-trans retinoic acid inhibits proliferation of intestinal epithelial cells by inhibiting expression of the gene encoding Kruppel-like factor 5. FEBS Letters. 578 (1-2), 99-105 (2004).
- di Masi, A., et al. Retinoic acid receptors: from molecular mechanisms to cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 41, 1 (2015).
- Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies. FEBS Letters. 584 (14), 3123-3130 (2010).
- De Angelis, M. T., Parrotta, E. I., Santamaria, G., Cuda, G. Short-term retinoic acid treatment sustains pluripotency and suppresses differentiation of human induced pluripotent stem cells. Cell Death & Disease. 9 (1), 6 (2018).
- Li, L., Dong, L., Wang, Y., Zhang, X., Yan, J. Lats1/2-mediated alteration of hippo signaling pathway regulates the fate of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2018, 4387932 (2018).
- Moldes, M., et al. Peroxisome-proliferator-activated receptor gamma suppresses Wnt/beta-catenin signalling during adipogenesis. The Biochemical Journal. 376, 607-613 (2003).
- Ross, S. E., et al. Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science. 289 (5481), 950-953 (2000).
- Wang, Y. K., Chen, C. S. Cell adhesion and mechanical stimulation in the regulation of mesenchymal stem cell differentiation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 823-832 (2013).
- Mohsen-Kanson, T., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells into brown and white adipocytes: role of Pax3. Stem Cells. 32 (6), 1459-1467 (2014).
- Billon, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
- Li, N., Kelsh, R. N., Croucher, P., Roehl, H. H. Regulation of neural crest cell fate by the retinoic acid and Pparg signalling pathways. Development. 137 (3), 389-394 (2010).
- Ussar, S., et al. ASC-1, PAT2, and P2RX5 are cell surface markers for white, beige, and brown adipocytes. Science Translational Medicine. 6 (247), (2014).
- Festy, F., et al. Surface protein expression between human adipose tissue-derived stromal cells and mature adipocytes. Histochemistry and Cell Biology. 124 (2), 113-121 (2005).
- Cai, L., Wang, Z., Ji, A., Meyer, J. M., vander Westhuyzen, D. R. Scavenger receptor CD36 expression contributes to adipose tissue inflammation and cell death in diet-induced obesity. PLoS One. 7 (5), 36785 (2012).
- Mesuret, G., et al. A neuronal role of the Alanine-Serine-Cysteine-1 transporter (SLC7A10, Asc-1) for glycine inhibitory transmission and respiratory pattern. Scientific Reports. 8 (1), 8536 (2018).
- Silverstein, R. L., Febbraio, M. CD36, a scavenger receptor involved in immunity, metabolism, angiogenesis, and behavior. Science Signaling. 2 (72), (2009).
- Brooimans, R. A., van Wieringen, P. A., van Es, L. A., Daha, M. R. Relative roles of decay-accelerating factor, membrane cofactor protein, and CD59 in the protection of human endothelial cells against complement-mediated lysis. European Journal of Immunology. 22 (12), 3135-3140 (1992).
- Davies, A., et al. CD59, an LY-6-like protein expressed in human lymphoid cells, regulates the action of the complement membrane attack complex on homologous cells. The Journal of Experimental Medicine. 170 (3), 637-654 (1989).
- Lapid, K., Graff, J. M. Form(ul)ation of adipocytes by lipids. Adipocyte. 6 (3), 176-186 (2017).
- Aldridge, A., et al. Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells–a direct comparison of four different methods. Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).
- Schaedlich, K., Knelangen, J. M., Navarrete Santos, A., Fischer, B., Navarrete Santos, A. A simple method to sort ESC-derived adipocytes. Cytometry A. 77 (10), 990-995 (2010).
- Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (2), 447-467 (2021).
