Differenziazione di cellule staminali pluripotenti umane in precursori di cellule beta pancreatiche in un sistema di coltura 2D

Il diabete è una malattia metabolica complessa che colpisce milioni di persone in tutto il mondo. L’integrazione di insulina è considerata l’unica opzione di trattamento per il diabete. I casi più avanzati sono trattati con la terapia sostitutiva delle cellule beta, ottenuta attraverso il trapianto di pancreas cadaverico intero o isole ^1,2. Diverse questioni circondano la terapia dei trapianti, come la limitazione della disponibilità e della qualità del tessuto, l’invasività delle procedure di trapianto oltre alla continua necessità di immunosoppressori. Ciò richiede la necessità di scoprire opzioni nuove e alternative per la terapia sostitutiva delle cellule beta ^2,3. Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) sono recentemente emerse come uno strumento promettente per comprendere la biologia del pancreas umano e come fonte non esaustiva e potenzialmente più personalizzata per la terapia dei trapianti 4,5,6,7. Le hPSC, comprese le cellule staminali embrionali umane (hESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo (hiPSC), hanno un’elevata capacità di autorinnovamento e danno origine a qualsiasi tipo di tessuto del corpo umano. Le hESCs sono derivate dalla massa cellulare interna dell’embrione e le hiPSC sono riprogrammate da qualsiasi cellula somatica ^4,8.

I protocolli di differenziazione diretta sono ottimizzati per generare cellule beta pancreatiche da hPSC che dirigono sequenzialmente le hPSC attraverso gli stadi di sviluppo pancreatici in vitro. Questi protocolli generano organoidi di isole derivati da hPSC. Mentre sono notevolmente migliorati nell’aumentare la proporzione di cellule beta pancreatiche al loro interno, l’efficienza dei protocolli è altamente variabile. Non aumenta a più di ~ 40% delle cellule NKX6.1 + / INSULIN + o C-PEPTIDE + 5,9,10,11,12,13. Tuttavia, le cellule beta generate non sono del tutto identiche alle cellule beta umane adulte in termini di profili trascrizionali e metabolici e della loro risposta al glucosio ^4,5,14. Le cellule beta derivate da hPSC mancano di espressione genica di marcatori chiave delle cellule beta come PCSK2, PAX6, UCN3, MAFA, G6PC2 e KCNK3 rispetto alle isole 5 dell’uomo^adulto. Inoltre, le cellule beta derivate da hPSC hanno diminuito la segnalazione del calcio in risposta al glucosio. Sono contaminati dalle cellule poliormonali co-generate che non secernono quantità appropriate di insulina in risposta all’aumento dei livelli di glucosio⁵. D’altra parte, i progenitori pancreatici derivati da hPSC, che sono precursori delle isole, potrebbero essere generati in modo più efficiente in vitro rispetto alle cellule beta e, una volta trapiantati in vivo, potrebbero maturare in cellule beta funzionali che secernono insulina^15,16. Gli studi clinici sono attualmente focalizzati sulla dimostrazione della loro sicurezza ed efficacia dopo il trapianto in soggetti T1D.

In particolare, l’espressione dei fattori di trascrizione PDX1 (Pancreatic and Duodenal Homeobox 1) e NKX6.1 (NKX6 Homeobox 1) all’interno della stessa cellula progenitrice pancreatica è cruciale per l’impegno verso una linea cellulare beta⁵. I progenitori pancreatici che non riescono ad esprimere NKX6.1 danno origine a cellule endocrine poliormonali o cellule beta non funzionali^17,18. Pertanto, un’elevata co-espressione di PDX1 e NKX6.1 nello stadio progenitore pancreatico è essenziale per generare un gran numero di cellule beta funzionali. Gli studi hanno dimostrato che un corpo embrioide o una coltura 3D migliora PDX1 e NKX6.1 nei progenitori pancreatici in cui le cellule differenzianti sono aggregate, variando tra il 40% -80% della popolazione PDX1+/NKX6.1+^12,19. Tuttavia, rispetto alle colture in sospensione, le colture di differenziazione 2D sono più economiche, fattibili e convenienti per l’applicazione su più linee cellulari⁵. Abbiamo recentemente dimostrato che le colture di differenziazione monostrato producono più del 90% di PDX1+/NKX6.1+ co-espressione dei progenitori pancreatici derivati da hPSC^20,21,22. Il metodo riportato ha conferito un’elevata capacità di replicazione ai progenitori pancreatici generati e ha impedito specifiche di destino alternativo come la linea epatica²¹. Pertanto, questo protocollo dimostra un metodo altamente efficiente per la differenziazione delle hPSCs in precursori delle cellule beta pancreatiche che co-esprimono PDX1 e NKX6.1. Questo metodo utilizza la tecnica di dissociazione dell’endoderma derivato da hPSC e manipolazione della densità cellulare, seguita da una segnalazione estesa di FGF e retinoidi, nonché dall’inibizione di Hedgehog per promuovere la co-espressione di PDX1 e NKX6.1 (Figura 1). Questo metodo può facilitare una generazione scalabile di precursori delle cellule beta pancreatiche derivate da hPSC per la terapia dei trapianti e la modellizzazione della malattia.