Visualisatie van cytoskeletafhankelijke handel in lipidenbevattende organellen in drosophila-embryo's
Summary
In het vroege Drosophila-embryo zijn veel organellen beweeglijk. In principe kunnen ze live worden afgebeeld via specifieke fluorescerende sondes, maar de eierschaal voorkomt directe toepassing op het embryo. Dit protocol beschrijft hoe dergelijke sondes via micro-injectie kunnen worden geïntroduceerd en vervolgens bulk organelbeweging kan worden geanalyseerd via deeltjesbeeld velocimetrie.
Abstract
Vroege Drosophila-embryo’s zijn grote cellen die een breed scala aan conventionele en embryo-specifieke organellen bevatten. Tijdens de eerste drie uur van embryogenese ondergaan deze organellen dramatische bewegingen die worden aangedreven door op actine gebaseerde cytoplasmatische streaming en motorische handel langs microtubuli. De ontwikkeling van een groot aantal kleine, organel-specifieke fluorescerende sondes (FP’s) maakt het mogelijk om een breed scala aan verschillende lipidenbevattende structuren in elk genotype te visualiseren, waardoor live beeldvorming mogelijk is zonder dat een genetisch gecodeerde fluorofoor nodig is. Dit protocol laat zien hoe vitale kleurstoffen en moleculaire sondes in Drosophila-embryo’s kunnen worden geïnjecteerd om de handel in specifieke organellen te volgen door middel van live beeldvorming. Deze aanpak wordt gedemonstreerd door lipidedruppels (LD’s) te labelen en hun bulkbeweging te volgen door deeltjesbeeld velocimetrie (PIV). Dit protocol biedt een strategie die vatbaar is voor de studie van andere organellen, waaronder lysosomen, mitochondriën, dooierblaasjes en het ER, en voor het volgen van de beweging van individuele LD’s langs microtubuli. Het gebruik van in de handel verkrijgbare kleurstoffen brengt de voordelen van scheiding in de violet / blauwe en verrode gebieden van het spectrum. Door multiplex co-labeling van organellen en/of cytoskeletelementen via micro-injectie, zijn alle genetische bronnen in Drosophila beschikbaar voor smokkelstudies zonder de noodzaak om fluorescerend gelabelde eiwitten te introduceren. In tegenstelling tot genetisch gecodeerde fluoroforen, die lage kwantumopbrengsten hebben en gemakkelijk bleken, maken veel van de beschikbare kleurstoffen een snelle en gelijktijdige opname van verschillende kanalen met hoge fotonopbrengsten mogelijk.
Introduction
Vitale kleurstoffen en moleculaire sondes zijn krachtige hulpmiddelen om specifieke cellulaire structuren en organellen levend in beeld te brengen. In het Drosophila-embryo vertonen veel verschillende organellen cytoskeletgestuurde lokalisatie 1,2,3,4, maar de toepassing van deze kleine moleculen is een uitdaging omdat de eierschaal voor velen van hen ondoordringbaar is. Dit protocol beschrijft een methode om fluorescerende sondes (FP’s) in levende embryo’s via micro-injectie te gebruiken om grootschalige handel in organellen op te sporen. De procedure omvat de bereiding van de injectieoplossing, het verzamelen van eieren en de bereiding van embryo’s, micro-injectie, beeldvorming en beeldanalyse.
Dramatische ruimtelijke herschikkingen van organellen komen vaak voor in veel dierlijke eicellen, eieren en embryo’s, deels vanwege de grote omvang van deze cellen. In het Drosophila-embryo bewegen lipidedruppeltjes (LD’s) en dooierblaasjes bijvoorbeeld vlak voor de cellisatie naar het embryocentrum5. Deze beweging is afhankelijk van microtubuli en laat een gebied van ~ 40 μm rond de periferie van het embryo uitgeput van de twee organellen. Tijdens eerdere splitsingsfasen worden veel organellen getransporteerd door cytoplasmatische stromen die worden aangedreven door op actine-myosine gebaseerde contracties aan het embryooppervlak6. Hoewel de embryo’s van veel soorten vergelijkbare herschikkingen vertonen, is het Drosophila-embryo bijzonder geschikt voor het volgen van deze processen door beeldvorming omdat het zich extern ontwikkelt bij standaard laboratorium ‘kamertemperatuur’, relatief transparant is, klein genoeg om op de meeste microscoopstellingen te passen en kan worden gemanipuleerd met behulp van krachtige genetische hulpmiddelen.
Voor sommige organellen zijn fluorescerend gelabelde eiwitten beschikbaar die specifiek deze structuren labelen. LSD-2 (ook bekend als dPLIN2) is bijvoorbeeld een eiwit dat zich in embryo’s specifiek richt op LDs7. Er zijn vliegenlijnen beschikbaar die ofwel induceerbare transgenen dragen die coderen voor een fusie tussen Green Fluorescent Protein (GFP) en LSD-28 of een genenval waarin geel fluorescerend eiwit (YFP) wordt ingebracht in het coderende gebied van het endogene LSD-2 gen 9,10. Deze aanpak heeft echter beperkingen, waaronder dat deze fusie-eiwitten lage kwantumopbrengsten hebben en de neiging hebben om gemakkelijk te bleken. Bovendien kan het labelen van meerdere verschillende structuren tegelijkertijd een uitdaging zijn: voor veel organellen is momenteel slechts één type fluorescerende tag (vaak GFP of mCherry) beschikbaar, dus het afbeelden van twee organellen tegelijkertijd kan nieuwe transgenen of inserties vereisen; zelfs als er compatibele tags beschikbaar zijn, kan het introduceren ervan in een enkele soort tijdrovende kruisingen vereisen. Het maakt het gebruik van de vele krachtige genetische bronnen ook minder handig, bijvoorbeeld als twee organelmarkers, een Gal4-driver en een induceerbare RNAi-constructie allemaal in dezelfde moeder aanwezig moeten zijn.
In principe kunnen deze beperkingen worden overwonnen met het gebruik van FP’s, waaronder vitale kleurstoffen (bijv. LysoTracker om lysosomen te markeren), moleculaire sondes (bijv. SiR-tubuline om microtubuli te labelen) en fluorescerend gelabelde biologische moleculen (bijv. C12 BODIPY om vetzuurmetabolisme te onderzoeken11). Van gebruik in gekweekte cellen zijn ze meestal goed gevalideerd als krachtige hulpmiddelen voor het onderzoeken van cellulaire biologie. FP’s zijn veelzijdig, hebben superieure foto-eigenschappen en zijn compatibel met fluorescerende eiwitten. Meerdere kleurstoffen kunnen tegelijkertijd worden gemengd en aangebracht, vaak met de voordelen van scheiding in de violet / blauwe en verrode gebieden van het spectrum en kleine Stokes-verschuivingen, waardoor kanaaldoorbloeding wordt voorkomen. Kleine Stokes-verschuivingen maken gelijktijdige opname van meerdere beeldkanalen mogelijk, waardoor meerdere organellen tegelijk kunnen worden gevolgd. Ten slotte kunnen ze ook worden toegepast op het labelen van organellen in de embryo’s van andere Drosophila-soorten of zelfs andere insecten waar geen fluorescerend getagde eiwitten beschikbaar kunnen zijn.
De meeste van deze FP’s kunnen echter de uitgebreide eierschaal van het Drosophila-embryo niet doorkruisen. Het bestaat uit vijf lagen: drie buitenste chorionlagen (chorion) die mechanische schade voorkomen plus een wasachtige laag rond het vitellinemembraan die een chemische barrière creëert12. Voor de eenvoud wordt de combinatie van de wasachtige laag en het vitelline-membraan hieronder het “vitelline-membraan” genoemd. Om de eierschaal te omzeilen, past dit protocol een gevestigde embryomicro-injectiebenadering aan om FP’s in het Drosophila-embryo te introduceren. Het protocol beschrijft hoe de cytoplasmatische stroom van LD’s in embryo’s in het splitsingsstadium kan worden gecontroleerd. Het omvat de bereiding van injectienaalden en kooien voor het verzamelen van eieren, het proces van het verzamelen van eieren en het mechanisch verwijderen van het chorion. Het gaat over het micro-injecteren en in beeld brengen van de embryo’s en hoe de bulkstroom van LD’s te analyseren met behulp van deeltjesbeeld velocimetrie (PIV, aangepast van6). Het biedt advies over het oplossen van problemen om de overleving van embryo’s te garanderen en het beste systeem voor beeldvorming te creëren. Ook wordt besproken hoe het protocol kan worden gewijzigd om tegelijkertijd LD’s en microtubuli in beeld te brengen of toe te passen op de studie van andere organellen, waaronder lysosomen, mitochondriën, dooierblaasjes en het endoplasmatisch reticulum (ER).
Protocol
Representative Results
Discussion
Het Drosophila-embryo is een krachtig en handig model om fundamentele vragen in cellulaire en organismale biologie te bestuderen. De relatieve eenvoud, krachtige genetica en kleine omvang maken het een uitstekend systeem voor het in beeld brengen van zowel cellulaire processen als ontwikkeling. Hier wordt een standaard micro-injectieprotocol aangepast om FP-gebruik in embryo’s mogelijk te maken. Deze aanpak maakt fluorescerende beeldvorming van specifieke cellulaire structuren mogelijk zonder de noodzaak van genetisch gecodeerde fluoroforen, waardoor veel genetische achtergronden voor beeldvorming worden geopend. Het combineren van meerdere kleurstoffen plus strategisch gekozen fluorescerend gelabelde eiwitten kan meerkanaals live beeldvorming openen die het hele spectrum van zichtbaar licht overspant.
Kritieke stappen in het protocol:
Dit protocol gebruikt BODIPY 493/503 om LD’s te labelen. Deze aanpak kan gemakkelijk worden aangepast om andere cellulaire structuren te markeren. Voor latere beeldanalyse is een van de belangrijkste factoren de signaal-ruisverhouding, d.w.z. de helderheid van de kleurstof in vergelijking met het achtergrondsignaal. Lysosomen zijn met succes in beeld gebracht (LysoTracker Red, 1 mM), evenals mitochondriën (Mitoview 633, 200 μM), de ER (ER tracker Green, 10 μM) en microtubuli (SiR tubuline, 200 nM in DMSO), zoals weergegeven in figuur 2, figuur 3, figuur 4, figuur 5. Bovendien zijn dooierblaasjes autofluorescent en geven ze blauw licht af bij UV-excitatie (afbeelding met 405 nm als excitatiegolflengte (figuur 6)). Streef er voor andere kleurstoffen naar dat de kleurstofconcentratie 100-1.000x is van wat nodig zou zijn voor het kleuren van gekweekte cellen; dit is vergelijkbaar met de concentratie van een stamoplossing die zou worden verdund tot celkweekmedia. Aangezien dit protocol een injectie van 100 fL vereist en het Drosophila-embryo ongeveer 9 nL is in volume18, zullen deze kleurstofconcentraties gemiddeld uitkomen op een interne embryonale concentratie van minder dan 1/100e van wat aanwezig is in de celkweekmedia. Tijdelijk zal de lokale concentratie hoger zijn op de injectieplaats, wat het meest relevant is voor FP’s die niet goed diffunderen (d.w.z. mitochondriale kleurstoffen en SiR-tubuline). Begin voor deze FP’s bij de aanbevolen hoge concentraties; als onverwachte dood wordt waargenomen, verdun dan achtereenvolgens tweevoudig totdat een aanvaardbaar compromis tussen overleving en signaalsterkte is bereikt.
Bij het co-injecteren van meerdere kleurstoffen moeten beide kleurstoffen in hetzelfde oplosmiddel zitten, of zowel de oplosmiddelen als de kleurstoffen moeten compatibel zijn met het mengsel (alcoholconcentraties van meer dan ~ 10% worden niet aanbevolen).
De kwaliteit van de naalden is essentieel voor het succes van deze procedure, omdat de punt zo goed mogelijk moet zijn. Anders kan schade door de injectiewond de verdere ontwikkeling van het embryo in gevaar brengen. Omdat commerciële naaldtrekkers verschillen, is het belangrijk om de suggesties van de fabrikant te volgen en meerdere trekparameters uit te proberen totdat de gewenste vorm is bereikt. Het is van cruciaal belang om de kwaliteitscontrole stap 1.1.3 uit te voeren, omdat het werken met een gebarsten, gekartelde of grote boring naaldpunt de succesvolle injectie moeilijker of zelfs onmogelijk zal maken.
Het embryo moet gedeeltelijk worden uitgedroogd, zodat tijdens de injectie extra hoeveelheden vloeistof kunnen worden toegevoegd. Als het embryo onvoldoende is uitgedroogd, zal de naald niet gemakkelijk binnendringen en zal cytoplasma eruit spuiten als de naald binnendringt of als de oplossing wordt geïnjecteerd. Als het embryo te veel uitgedroogd is, zal het er leeggelopen uitzien en zich niet goed ontwikkelen. De exacte droogtijd is afhankelijk van de lokale omstandigheden, bijvoorbeeld de luchtvochtigheid, en kan van dag tot dag veranderen. Het moet empirisch worden bepaald voor elke sessie.
Het vermogen van het embryo om te overleven na micro-injectie hangt kritisch af van de kwaliteit van de naald, de juiste uitdroging en het beperken van het injectievolume tot minder dan 1 pL (idealiter 100 fL). Zolang deze parameters zijn geoptimaliseerd, is er geen significante toxiciteit zichtbaar wanneer de beschreven kleurstoffen in de aanbevolen concentraties worden geïnjecteerd. Als embryo’s de uitdrogings- en injectiestappen overleven, ontwikkelen ze zich meestal met succes goed tot kiembanduitbreiding, met uitzondering van de microtubuli- en ER-sondes die cellularisatiedefecten op hoge niveaus veroorzaakten (100 fL injectie van de stamconcentratie van elk). Testen vonden geen duidelijke ontwikkelingsdefecten wanneer DMSO, water en mengsels van de twee werden geïnjecteerd met de aanbevolen volumes, met een embryooverlevingspercentage door kiembanduitbreiding van ~ 75% of meer. Injectievolumes van meer dan 1 pL veroorzaakten defecten en embryo’s geïnjecteerd met ~ 4 pL volumes ontwikkeld gedurende minder dan 1 uur. Daarom moeten de injectievolumes laag worden gehouden, wat betekent dat de kleurstofconcentraties hoog moeten zijn.
Over het algemeen worden injecties langs de zijrand van het embryo aanbevolen omdat die resulteren in de minste schade. Het kan echter nodig zijn de injectieplaats aan te passen, afhankelijk van de diffusieve eigenschappen van de gebruikte FP’s. BODIPY 493/503 en LysoTracker diffunderen sneller over het hele embryo dan Lipid Spot 610 (een andere kleurstof om LD’s te markeren), terwijl SiR-Tubulin en Mitoview 633 nooit volledig over het embryo diffunderen (beeldvorming tot 7 uur na de injectie). Injectie in of nabij de plaats van belang kan dus noodzakelijk zijn. Bij het injecteren in de voorste of achterste regio’s wordt een bijzonder fijne naald aanbevolen.
Beeldverwerving is afhankelijk van confocale microscopie om kleine organellen en alle cytoskeletcomponenten optisch te sectieren en op te lossen. Technieken die analyse van veel beelden vereisen (bijv. STORM of PALM) zullen niet werken omdat de embryonale inhoud in beweging is en de fluoroforen niet zijn geoptimaliseerd voor fotoschakeling. Epifluorescentiemicroscopie mist de laterale en axiale resolutie om de meeste organellen en kleinere cellulaire structuren te onderscheiden. Om deze redenen wordt het sterk aanbevolen om een confocale microscoop te gebruiken of lichtplaattechnologie te gebruiken.
De reproduceerbaarheid van de beeldanalyse is sterk afhankelijk van consistente beeldgegevens. Voor de grootste kans op succes is optimalisatie van de injectietechniek en beeldverwerving nodig. Het vaststellen en oefenen van een techniek waarbij de kleurstof (en) van belang, de plaats van injectie, de leeftijd van het embryo, het injectievolume en de acquisitie-instelling allemaal consistent zijn, zal de meest robuuste gegevens voor beeldanalyse genereren.
Wijzigingen en probleemoplossing van de methode
Dit protocol demonstreert een methode voor het analyseren van de bulkstroom van LD’s in embryo’s in het splitsingsstadium met behulp van deeltjesbeeld velocimetrie. Dezelfde aanpak kan worden gebruikt voor andere organellen, andere ontwikkelingsstadia en andere analysemethoden. Figuur 2 toont bijvoorbeeld analyse van LD’s en zure organellen die stromen in de syncytiele stadia van embryogenese, gevisualiseerd door het co-injecteren van BODIPY 493/503 en LysoTracker Red. Verdere succesvolle beeldvorming van LD-beweging in embryo’s tot 7 uur na de bevruchting is bereikt; deze embryo’s behouden wel de injectiewond maar kunnen zich enkele uren ontwikkelen.
Gegevens verzameld met behulp van dit protocol zijn gebruikt voor deeltjesbeeld velocimetrie, maar er zijn veel andere analysetechnieken beschikbaar. Deeltjesvolgprogramma’s zoals die in ImageJ, Imaris of handmatige tracking kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om snelheden en directionaliteiten van bewegende structuren te verkrijgen. Merk op dat de meeste van dergelijke trackingsoftware zijn gebouwd om te werken met gegevens van planaire celkweeksystemen en zich niet altijd goed aanpassen aan 3D-structuren zoals het Drosophila-embryo . Verder zouden voor het genereren van de beste kwaliteit deeltjesvolggegevens meerdere Z-vlakken in beeld moeten worden gebracht; dit zou haalbaar moeten zijn als de acquisitietijden van de afbeeldingsstapel minder dan ~ 2 s zijn. Deze benchmark moet bereikbaar zijn op ronddraaiende schijf confocale, roosterlichtplaat en recente laserscanning confocale systemen. De haalbaarheid van deeltjestracking voor overvloedige organellen zoals LD’s, mitochondriën en lysosomen is echter laag omdat de hoeveelheid positief signaal in een gezichtsveld te hoog is voor de huidige trackingmethoden. Het volgen van minder overvloedige structuren zoals kernen of dooierblaasjes kan mogelijk zijn. PIV voor stromingsanalyse werkt goed voor LD’s en zure organellen in splitsingsfasen omdat beide organellen vrij bewegen. Organellen zoals kernen, ER en mitochondriën zijn vastgebonden aan andere cellulaire structuren en bewegen dus niet vrij en zijn niet geschikt voor software-analyse die uitgaat van vrije beweging. De onderzoeker moet de technieken kiezen die het meest geschikt zijn voor het organel van belang.
Tijdens de syncytiele en cellulaire blastodermstadia bewegen LD’s (evenals enkele andere organellen) langs radiaal georiënteerde microtubuli5. Het is daarom mogelijk om dwarsdoorsnedebeelden te vinden (zoals in figuur 5) waar enkele microtubuli gedurende lange afstanden scherp zijn, waardoor deeltjes in 2D kunnen worden gevolgd. Omdat deze optische vlakken zich diep in het embryo bevinden, neemt de totale signaalsterkte af en wordt de signaal-ruisverhouding verminderd.
Voor trackinganalyse kan beeldvorming zo snel mogelijk cruciale details van de beweging en dus van de beweeglijke machinerie onthullen. Lipidedruppelbeweging is bijvoorbeeld een mengsel van twee beweeglijke toestanden, slow-short motion (~ 200 nm / s; gemiddelde reisafstand ~ 100 nm) en snel-lange beweging (~ 450 nm / s; gemiddelde reisafstand ~ 1.000 nm)19; dus als er elke seconde of zelfs minder vaak foto’s worden gemaakt, wordt de langzaam-korte toestand niet detecteerbaar. Frequente beeldvorming induceert echter ook fluorofoorbleking en fototoxiciteit. Beeldvormingsomstandigheden moeten daarom worden aangepast afhankelijk van de exacte vraag die moet worden behandeld.
Beperkingen van de methode
Afhankelijk van de gewenste kleurstof kan de methode worden beperkt door de compatibiliteit tussen de oplosbaarheid van de kleurstof en de toxiciteit van de injectieoplossing. Alcoholen zoals isopropanol en ethanol zijn moeilijk te hanteren in een naald vanwege hun lagere viscositeit en lijken cellulaire componenten te beschadigen en het embryo te doden.
De methode is ook niet goed geschikt voor het visualiseren van de vroegste stappen in embryogenese, omdat het 30+ minuten duurt om de embryo’s voor te bereiden op injectie. Bij kamertemperatuur zijn de eerste celcycli van het embryo elk slechts ~ 10 minuten lang; dus zelfs als men in stap 5.2.3 een nieuw bevruchte eicel zou kiezen, zouden de eerste paar celcycli al voltooid zijn tegen de tijd dat het embryo klaar is voor beeldvorming.
Verlichting met licht in het UV/blauwe bereik is aanzienlijk fototoxischer dan bij langere golflengten. Onder dergelijke omstandigheden (bijv. om autofluorescente dooierblaasjes te volgen; Figuur 6), moet men de beeldtijd beperken (wat leidt tot kortere tijdreeksen) of een lager laservermogen gebruiken (wat resulteert in een verminderde signaal-ruisverhouding).
Na cellularisatie hebben kleurstoffen die op een specifieke locatie worden geïnjecteerd de neiging om slecht te diffunderen, omdat ze veel celmembranen moeten doorkruisen. Dit beperkt het waarnemingsgebied in latere ontwikkelingsstadia.
De betekenis van de methode ten opzichte van bestaande/alternatieve methoden
De beweging van LD’s en andere lipidebevattende organellen in vroege embryo’s kan worden gevisualiseerd met genetisch gecodeerde fluoroforen, labelvrije technieken en door de introductie van FP’s. Dit laatste kan worden bereikt door permeabilisatie van het vitellinemembraan12 of de hier besproken micro-injectiebenadering.
Genetisch gecodeerde fluoroforen zijn veelzijdige markers waarvan de niveaus meestal zeer reproduceerbaar zijn van embryo tot embryo. Ze hebben echter lagere kwantumopbrengsten en bleken gemakkelijker dan FP’s. Meestal zijn ze alleen beschikbaar in een of twee gelabelde versie (s) (bijv. GFP of mCherry), waardoor de keuze van welke structuren tegelijkertijd kunnen worden afgebeeld, wordt beperkt. FP’s daarentegen bestaan vaak in een grote verscheidenheid; er zijn bijvoorbeeld verschillende lipidedruppelspecifieke kleurstoffen beschikbaar met emissiespectra van Autodot in het UV/blauwe spectrum tot Lipidtox en LipidSpot 610 in het verrode spectrum. FP’s kunnen ook direct worden toegepast op elke stam van belang en vereisen dus geen spanningsconstructie om bijvoorbeeld de gewenste organelmarker in een mutante stam van belang te introduceren. Dit voordeel is vooral uitgesproken wanneer meerdere structuren tegelijkertijd moeten worden gelabeld; in plaats van tijdrovende kruisingen over meerdere generaties, kan dit in één dag worden bereikt door de relevante kleurstoffen te mengen en tegelijkertijd te introduceren. Ten slotte, als cellulaire processen moeten worden onderzocht met farmacologische remming, kunnen geneesmiddelen en kleurstoffen samen worden geïntroduceerd.
Labelvrije methoden zijn zeer krachtige benaderingen voor het detecteren van specifieke cellulaire structuren. Ld’s kunnen bijvoorbeeld specifiek worden gedetecteerd in vroege embryo’s door microscopie van de derde harmonische generatie20 of door femtoseconde gestimuleerde Raman-verliesmicroscopie21. Net als FP’s kunnen deze benaderingen op elke genetische achtergrond worden toegepast en omdat ze geen bleken veroorzaken, zorgen ze mogelijk voor snellere beeldverwerving. Ze zijn echter meestal beperkt tot specifieke organellen en ondersteunen dus op zichzelf geen multiplexbeeldvorming; ze vereisen ook gespecialiseerde microscopen.
Er zijn twee algemene strategieën voor het introduceren van kleine moleculen in embryo’s. Een daarvan is de micro-injectiebenadering die hier wordt gebruikt; de andere is een chemische (terpeen) behandeling om het vitellinemembraan te permeabiliseren. De laatste benadering12 is minder betrokken dan micro-injectie, maar ook meer variabel van embryo tot embryo. Bovendien wordt na permeabilisatie de bescherming van het vitellinemembraan aangetast en is het eigenlijke embryo toegankelijk voor het externe medium, waardoor het moeilijker wordt om het in leven te houden. Micro-injectie heeft veel minder kans om de embryonale ontwikkeling te laten ontsporen dan permeabilisatie. Permeabilisatie wordt echter aanbevolen als veel embryo’s tegelijkertijd moeten worden gecontroleerd, bijvoorbeeld voor screeningsdoeleinden voor geneesmiddelen. Om de beweging van cellulaire structuren te volgen en reproduceerbare beeldreeksen te verkrijgen die geschikt zijn voor beeldanalyse, is micro-injectie de methode bij uitstek.
Belang en mogelijke toepassingen van de methode in specifieke onderzoeksgebieden
Het Drosophila embryo is een belangrijk modelsysteem voor het bestuderen van vele celbiologische en ontwikkelingsprocessen 1,5,6. Het taggen van organellen met fluorescerende eiwitten heeft belangrijke bijdragen geleverd aan het begrip van hoe het vroege embryo zich ontwikkelt, hoe verschillende organellen worden verhandeld en hoe dergelijke handel ontwikkelings- en genetisch wordt gemoduleerd. Hun neiging om te bleken en de uitdagingen van het genereren van stammen waarin meerdere organellen met verschillende kleuren zijn gelabeld, beperken echter de toepassing van deze aanpak. Het gebruik van FP’s geïntroduceerd door micro-injectie lost veel van deze uitdagingen op en kan zelfs worden gecombineerd met fluorescerend getagde eiwitten. Deze techniek maakt het mogelijk om meerdere organellen, celstructuren en cytoskeletcomponenten in elke genetische achtergrond in beeld te brengen. Hierdoor kunnen verschillende genotypen via live imaging worden vergeleken, waardoor het mogelijk is om het effect van mutaties op de handel in meerdere organellen te bepalen.
Dit protocol demonstreert de FP-injectiebenadering voor embryo’s van Drosophila melanogaster, maar in principe is deze benadering van toepassing op alle insecteneieren waarvoor micro-injectietechnieken zijn vastgesteld, inclusief andere soorten Drosophila, krekels22 en bladluizen23.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken Pakinee Phromsiri, Brian Jencik, Jinghong (James) Tang en Roger White voor hun commentaar op het manuscript. We bedanken Patrick Oakes, Stefano Di Talia en Victoria Deneke voor het delen van hun expertise over het uitvoeren van PIV-analyse. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health-subsidies F31 HD100127 (aan M. D. K.) en R01 GM102155 (aan M. A. W).
Materials
| AUTODO | abcepta | SM1000a | Stains lipid droplets in violet/blue |
| BODIPY 493/503 | ThermoFisher | D3922 | Stains lipid droplets in green |
| Desiccant Beads –Desiccant-Anhydrous Indicating Drierite | W.A. Hammond Drierite Company | 21001 | |
| Dissecting microscope SteREO DiscoveryV20 with transillumination base | Zeiss | 4350030000000000 | |
| Double sided tape-Permanent Double-Sided Tape | Scotch (3M) | – | Sold by many vendors |
| ER-Tracker Green (BODIPY FL Glibenclamide) | ThermoFisher | E34251 | Stains the ER/nuclear envelope |
| Femptotip II | Eppendorf | H129354N | Ready to use |
| Glass capillaries -Glass Thinw w/fil 1.0mm 4in | World Precision Instruments | TW100F-4 | Must be pulled |
| Glass coverslip | – | – | Buy the appropriate refractive index for your objective lens |
| Glass slides -Double Frosted Microscope Slides precleaned | FisherBrand | 12-550-343 | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | |
| Heptane greener alternative anhydrous, 99% |
Sigma-Aldrich | 246654-1L | Heptane is considered toxic by the USA's OSHA |
| Confocal microscope | Leica | Sp5 | Many different types of confocal microscopes will work. |
| LipidSpot 610 | Biotium | #70069 | Stains lipid droplets in far red |
| LysoTracker Red | ThermoFisher | L7528 | Stains lysosomes in red |
| MitoView 633 | Biotium | #70055 | Stains mitochondria |
| Needle loading pipette tips – 20uL microloader tips | Eppendorf | # 5242956.003 | |
| P-1000, Next Generation Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | The settings used are heat-470, pull-70, velocity-60, delay-90, pressure-200, ramp-479 at 1×1. They refer to the intensity and length of the heating, the timing of pulling force and whether the force is applied linearly. Using these conditions, one capillary generates two usable needles with fine openings at the tip. |
| SiR-Tubulin | Cytosketon Inc | CY-SC014 | Made by Spirochrome; Cytoskeleton Inc. is the North American distributor. Stains microtubules in far red |
| TransferMan | Eppendorf | 5178 NK | |
| ViaFluor 405 | Biotium | #70064 | Stains microtubules in violet/blue |
References
- Chowdhary, S., Tomer, D., Dubal, D., Sambre, D., Rikhy, R. Analysis of mitochondrial organization and function in the Drosophila blastoderm embryo. Scientific Reports. 7 (1), 5502 (2017).
- Mavor, L. M., et al. Rab8 directs furrow ingression and membrane addition during epithelial formation in Drosophila melanogaster. Development. 143 (5), 892-903 (2016).
- Riggs, B., et al. Actin cytoskeleton remodeling during early Drosophila furrow formation requires recycling endosomal components Nuclear-fallout and Rab11. Journal of Cell Biology. 163 (1), 143-154 (2003).
- Welte, M. A., Gross, S. P., Postner, M., Block, S. M., Wieschaus, E. F. Developmental regulation of vesicle transport in Drosophila embryos: forces and kinetics. Cell. 92 (4), 547-557 (1998).
- Welte, M. A. As the fat flies: The dynamic lipid droplets of Drosophila embryos. Biochimica et Biophysica Acta. 1851 (9), 1156-1185 (2015).
- Deneke, V. E., et al. Self-organized nuclear positioning synchronizes the cell cycle in Drosophila embryos. Cell. 177 (4), 925-941 (2019).
- Welte, M. A., et al. Regulation of lipid-droplet transport by the perilipin homolog LSD2. Current Biology. 15 (14), 1266-1275 (2005).
- Bailey, A. P., et al. Antioxidant role for lipid droplets in a stem cell niche of Drosophila. Cell. 163 (2), 340-353 (2015).
- Johnson, M. R., et al. H2Av buffering via dynamic sequestration to lipid droplets in Drosophila embryos. Elife. 7, 36021 (2018).
- Lowe, N., et al. Analysis of the expression patterns, subcellular localisations and interaction partners of Drosophila proteins using a pigP protein trap library. Development. 141 (20), 3994-4005 (2014).
- Rambold, A. S., Cohen, S., Lippincott-Schwartz, J. Fatty acid trafficking in starved cells: regulation by lipid droplet lipolysis, autophagy, and mitochondrial fusion dynamics. Developmental Cell. 32 (6), 678-692 (2015).
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 40 (11), 792-804 (2010).
- Tran, S. L., Welte, M. A. In-vivo centrifugation of Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (40), (2010).
- Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila embryo collection. CSH Protocols. 2007, (2007).
- Wieschaus, E., Nüsslein-Volhard, C., Roberts, D. B. . Drosophila: A Practical Approach. , 179-214 (1998).
- . The Interactive Fly: Stages of Development and Mitotic Domains Available from: https://www.sdbonline.org/sites/fly/aimain/2stages.htm (1999)
- Liberzon, A., et al. . OpenPIV/openpiv-python: OpenPIV – Python (v0.22.2) with a new extended search PIV grid option. , (2020).
- Markow, T. A., Beall, S., Matzkin, L. M. Egg size, embryonic development time and ovoviviparity in Drosophila species. Journal of Evolutionary Biology. 22 (2), 430-434 (2009).
- Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. Dynein-mediated cargo transport in vivo. A switch controls travel distance. Journal of Cell Biology. 148 (5), 945-956 (2000).
- Debarre, D., et al. Imaging lipid bodies in cells and tissues using third-harmonic generation microscopy. Nature Methods. 3 (1), 47-53 (2006).
- Dou, W., Zhang, D., Jung, Y., Cheng, J. X., Umulis, D. M. Label-free imaging of lipid-droplet intracellular motion in early Drosophila embryos using femtosecond-stimulated Raman loss microscopy. Biophysical Journal. 102 (7), 1666-1675 (2012).
- Barry, S. K., et al. Injecting Gryllus bimaculatus Eggs. Journal of Visualized Experiments. (150), (2019).
- Le Trionnaire, G., et al. An integrated protocol for targeted mutagenesis with CRISPR-Cas9 system in the pea aphid. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 110, 34-44 (2019).
