Spatiotemporale subcellulaire manipulatie van het microtubulecytoskelet in het levende pre-implantatiemuismyo met behulp van photostatinen

De microtubule-architectuur varieert sterk tussen verschillende celtypen om verschillende functies te ondersteunen ^1,2. De dynamische aard van groei en krimp maakt een snelle aanpassing aan extra- en intracellulaire signalen mogelijk en om te reageren op de steeds veranderende behoeften van een cel. Daarom kan het worden beschouwd als de “morfologische vingerafdruk” die een sleutelrol speelt in de cellulaire identiteit.

Farmacologische targeting van het microtubule cytoskelet met behulp van kleine molecuulremmers heeft geleid tot een overvloed aan fundamentele ontdekkingen in ontwikkelingsbiologie, stamcelbiologie, kankerbiologie en neurobiologie 3,4,5,6,7. Deze aanpak, hoewel onmisbaar, brengt verschillende beperkingen met zich mee, zoals toxiciteit en off-target effecten. Een van de meest gebruikte microtubule-targeting middelen, nocodazol, is bijvoorbeeld een krachtig microtubule-depolymeriserend medicijn⁸. Kleine-molecuulremmers zoals nocodazol zijn echter actief vanaf het moment van toepassing en, gezien de essentiële aard van het microtubule cytoskelet voor veel kritieke cellulaire functies, kan wereldwijde depolymerisatie van microtubuli off-target effecten veroorzaken, die mogelijk ongeschikt zijn voor veel toepassingen. Bovendien is de behandeling met nocodazol onomkeerbaar, tenzij monsters vrij van het geneesmiddel worden gewassen, waardoor continue live beeldvorming en dus nauwkeurige tracking van individuele microtubulifilamenten wordt voorkomen.

De ontwikkeling van lichtgeactiveerde verbindingen begon met de creatie van foto-onopgeloste moleculen en heeft een nieuw tijdperk ingeluid in het richten en monitoren van de effecten van microtubuligroeiremming op een nauwkeurige en spatiotemporaal gecontroleerde manier. Een familie van reversibel fotoschakelbare geneesmiddelen, fototatinen (PST’s), werden ontwikkeld door de stilbeencomponent van combretastatine A-4 te vervangen door azobenzeen⁹. PST’s zijn inactief tot verlichting met UV-licht, waarbij de inactieve transconfiguratie wordt omgezet in de actieve cis-configuratie door omkeerbare isomerisatie. Cis-PST’s remmen de polymerisatie van microtubuli door zich te binden aan de colchicine-bindingsplaats van β-tubuline, waardoor de interface met β-tubuline wordt geblokkeerd en dimerisatie wordt voorkomen die nodig is voor de groei van microtubuli¹⁰. Onder een cohort van PST’s is PST-1P naar voren gekomen als een loodverbinding omdat het de hoogste potentie heeft, volledig in water oplosbaar is en een snel begin van bioactiviteit vertoont na verlichting.

De meest effectieve trans– naar cis-isomerisatie van PST’s vindt plaats op golflengten tussen 360-420 nm, wat dubbele opties voor PST-activering mogelijk maakt. Een 405 nm laserlijn op een typische confocale microscoop kan worden toegediend voor een optimale ruimtelijke targeting van microtubuligroeiremming. De mogelijkheid om de locatie en timing van PST-activering te lokaliseren door middel van 405 nm laserverlichting vergemakkelijkt nauwkeurige temporele en ruimtelijke controle, waardoor verstoring van de microtubuledynamica op subcellulair niveau mogelijk is, binnen subseconde respons maal⁹. Als alternatief zorgt een betaalbaar LED UV-licht ervoor dat de verlichting van het hele organisme de microtubule-architectuur in het hele organisme verstoort. Dit kan een kosteneffectief alternatief zijn voor onderzoekers voor wie het nauwkeurig getimede begin van remming, in plaats van ruimtelijke targeting, het doel is. Een ander kenmerk van PST’s is hun on-demand inactivatie door groen licht toe te passen van een golflengte in het bereik van 510-540 nm⁹. Dit maakt het traceren van microtubule filamenten voor, tijdens en na PST-gemedieerde groeiremming mogelijk.

PST’s, hoewel nog steeds een relatief recent ontwerp, zijn gebruikt in tal van in vitro toepassingen op verschillende onderzoeksgebieden¹¹, waaronder onderzoek naar nieuwe mechanismen van celmigratie in amoeboïden¹², in neuronen geïsoleerd uit de hersenen van de pasgeboren muis¹³, en vleugelepitheelontwikkeling in Drosophila melanogaster¹⁴ . Andere lichtreactieve geneesmiddelen hebben bewezen waardevolle hulpmiddelen te zijn bij gerichte verstoring van de cellulaire functie. Een analoog van blebbistatine, azidoblebbistatine, werd bijvoorbeeld gebruikt voor verbeterde myosineremming onder verlichting^15,16. Dit benadrukt het potentieel voor nieuwe ontdekkingen als gevolg van het vermogen tot spatiotemporaal gecontroleerde remming van de cellulaire functie.

Levende 3D-organismen presenteren prachtige maar delicatere systemen om microtubulidynamica te manipuleren op een heel dier,eencellig of subcellulair niveau onder fysiologische omstandigheden. Met name het pre-implantatie muizenembryo biedt uitzonderlijk inzicht in de innerlijke werking van de cel en intercellulaire relaties binnen een organisme¹⁷. Temporeel en ruimtelijk gerichte opeenvolgende cycli van activering en deactivering van PST’s droegen bij aan de karakterisering van de interfasebrug, een post-cytokinetische structuur tussen cellen, als een niet-centrosomaal microtubuliorganiserend centrum in het pre-implantatiemuismyo¹⁶. Een vergelijkbare experimentele opstelling toonde de betrokkenheid van groeiende microtubuli bij de afdichting van het muizenembryo om blastocystvorming¹⁸ mogelijk te maken. Bovendien werden PST’s ook gebruikt in hele zebravisembryo’s om neuronale celmigratie te onderzoeken door de groei van microtubuli in een subset van cellen in de achterhersenen^{te remmen 19}.

Dit protocol beschrijft de experimentele opstelling en het gebruik van PST-1P in het pre-implantatiemuismyo. De instructies die hier worden gepresenteerd, kunnen ook de toepassing van PST’s begeleiden voor een breed scala aan doelstellingen, zoals het bestuderen van chromosoomsegregatie en celdeling, handel in intracellulaire lading en celmorfogenese en migratie. Bovendien zullen dergelijke studies de implementatie van PST’s in organoïde systemen, blastoïden en andere embryomodellen zoals Caenorhabditis elegans en Xenopus laevis helpen, evenals mogelijk het gebruik van PST’s voor in-vitrofertilisatietechnologieën uitbreiden.