Reinigung von endogenen Drosophila-Transientenrezeptor-Potentialkanälen
Summary
Basierend auf dem Montagemechanismus des INAD-Proteinkomplexes wurde in diesem Protokoll eine modifizierte Affinitätsreinigung plus Wettbewerbsstrategie entwickelt, um den endogenen Drosophila TRP-Kanal zu reinigen.
Abstract
Die Drosophila-Phototransduktion ist einer der schnellsten bekannten G-Protein-gekoppelten Signalwege. Um die Spezifität und Effizienz dieser Kaskade zu gewährleisten, bindet der Calcium (Ca2+)-permeable Kationenkanal, das transiente Rezeptorpotential (TRP), fest an das Gerüstprotein Inactivation-No-after-potential D (INAD) und bildet einen großen Signalproteinkomplex mit augenspezifischer Proteinkinase C (ePKC) und Phospholipase Cβ/No Rezeptorpotential A (PLCβ/NORPA). Die biochemischen Eigenschaften des Drosophila TRP-Kanals bleiben jedoch unklar. Basierend auf dem Montagemechanismus des INAD-Proteinkomplexes wurde eine modifizierte Affinitätsreinigung plus Wettbewerbsstrategie entwickelt, um den endogenen TRP-Kanal zu reinigen. Zuerst wurde das gereinigte Histidin (His)-markierte NORPA 863-1095-Fragment an Ni-Perlen gebunden und als Köder verwendet, um den endogenen INAD-Proteinkomplex aus Drosophila-Kopfhomogenaten abzuziehen. Dann wurde den Ni-Perlen ein übermäßig gereinigtes Glutathion-S-Transferase (GST)-markiertes TRP 1261-1275-Fragment hinzugefügt, um mit dem TRP-Kanal zu konkurrieren. Schließlich wurde der TRP-Kanal im Überstand durch Größenausschlusschromatographie vom übermäßigen TRP 1261-1275-Peptid getrennt. Diese Methode ermöglicht es, den Gating-Mechanismus des Drosophila TRP-Kanals sowohl aus biochemischer als auch aus struktureller Sicht zu untersuchen. Die elektrophysiologischen Eigenschaften von gereinigten Drosophila TRP-Kanälen können auch in Zukunft gemessen werden.
Introduction
Phototransduktion ist ein Prozess, bei dem absorbierte Photonen in elektrische Codes von Neuronen umgewandelt werden. Es leitet ausschließlich Opsine und die folgende G-Protein-gekoppelte Signalkaskade sowohl bei Wirbeltieren als auch bei Wirbellosen weiter. In Drosophila organisiert das Gerüstprotein Inactivation-No-after-potential D (INAD) unter Verwendung seiner fünf PDZ-Domänen einen supramolekularen Signalkomplex, der aus einem transienten Rezeptorpotential (TRP)-Kanal, Phospholipase Cβ/No-Rezeptorpotential A (PLCβ/NORPA) und einer augenspezifischen Proteinkinase C (ePKC)1 besteht. Die Bildung dieses supramolekularen Signalkomplexes garantiert die korrekte subzelluläre Lokalisation, hohe Effizienz und Spezifität der Drosophila-Phototransduktionsmaschinerie. In diesem komplexen Komplex wirken lichtempfindliche TRP-Kanäle als nachgeschaltete Effektoren von NORPA und vermitteln den Kalziumeinstrom und die Depolarisation von Photorezeptoren. Frühere Studien zeigten, dass die Öffnung des Drosophila TRP-Kanals durch Protonen, Störung der lokalen Lipidumgebung oder mechanische Kraft 2,3,4 vermittelt wird. Der Drosophila TRP-Kanal interagiert auch mit Calmodulin5 und wird durch Calcium sowohl durch positive als auch durch negative Rückkopplung 6,7,8 moduliert.
Bisher basierten elektrophysiologische Studien über den Gating-Mechanismus von Drosophila TRP und TRP-ähnlichen (TRPL) Kanälen auf ausgeschnittenen Membranpflastern, Ganzzellaufzeichnungen von dissoziierten Wildtyp-Drosophila-Photorezeptoren und heteroexprimierten Kanälen in S2-, SF9- oder HEK-Zellen 2,9,10,11,12,13, aber nicht auf gereinigten Kanälen. Die Strukturinformationen des Drosophila-TRP-Kanals in voller Länge bleiben ebenfalls unklar. Um die elektrophysiologischen Eigenschaften von gereinigtem Protein in einer rekonstituierten Membranumgebung zu untersuchen und strukturelle Informationen des Drosophila-TRP-Kanals in voller Länge zu gewinnen, ist die Gewinnung gereinigter TRP-Kanäle in voller Länge der notwendige erste Schritt, ähnlich den Methoden, die in den TRP-Kanalstudien von Säugetieren verwendet werden 14,15,16,17.
Kürzlich wurde auf der Grundlage des Montagemechanismus des INAD-Proteinkomplexes18,19,20 erstmals eine Affinitätsreinigungs- und Wettbewerbsstrategie entwickelt, um den TRP-Kanal von Drosophila-Kopfhomogenaten durch Streptavidin-Perlen5 zu reinigen. In Anbetracht der geringen Kapazität und der teuren Kosten von Streptavidin-Perlen wird hier ein verbessertes Reinigungsprotokoll eingeführt, das His-getaggtes Köderprotein und entsprechende kostengünstige Ni-Perlen mit viel höherer Kapazität verwendet. Die vorgeschlagene Methode wird dazu beitragen, den Gating-Mechanismus des TRP-Kanals aus strukturellen Winkeln zu untersuchen und die elektrophysiologischen Eigenschaften des TRP-Kanals mit gereinigten Proteinen zu messen.
Protocol
Representative Results
Discussion
INAD, das fünf PDZ-Domänen enthält, ist der Hauptorganisator der Drosophila-Fototransduktionsmaschinerie. Frühere Studien zeigten, dass INAD PDZ3 mit exquisiter Spezifität (KD = 0,3 μM) an den TRP-Kanal C-Terminal Tail bindet18. Das INAD PDZ45 Tandem interagiert mit NORPA 863-1095 Fragment mit extrem hoher Bindungsaffinität (KD = 30 nM). Diese Ergebnisse liefern eine solide biochemische Grundlage für die Entwicklung der Affinitätsreinigungs- und Wettbewerbss…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 31870746), Shenzhen Basic Research Grants (JCYJ20200109140414636) und der Natural Science Foundation of Guangdong Province, China (Nr. 2021A1515010796) an W. L. unterstützt. Wir danken LetPub (www.letpub.com) für die sprachliche Unterstützung bei der Erstellung dieses Manuskripts.
Materials
| Bacterial strains | |||
| BL21(DE3) Competent Cells | Novagen | 69450 | Protein overexpression |
| Experiment models | |||
| D.melanogaster: W1118 strain | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC:3605 | Drosophila head preparation |
| Material | |||
| 20/30/40 mesh stainless steel sieves | Jiufeng metal mesh company | GB/T6003.1 | Drosophila head preparation |
| 30% Acrylamide-N,N′-Methylenebisacrylamide(29:1) | Lablead | A3291 | SDS-PAGE gel preparation |
| Ammonium Persulfate | Invitrogen | HC2005 | SDS-PAGE gel preparation |
| Cocktail protease inhibitor | Roche | 05892953001 | Protease inhibitor |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech | A100472-0025 | SDS-PAGE gel staining |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sangon Biotech | A620058-0100 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) | Sangon Biotech | A500838-0500 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Glycine | Sangon Biotech | A610235-0005 | SDS-PAGE buffer preparation |
| Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads | Cytiva | 17513202 | Affinity chromatography |
| Imidazole | Sangon Biotech | A500529-0001 | Elution buffer preparation for Ni-column |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sangon Biotech | A600168-0025 | Induction of protein overexpression |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002-0250 | E.coli. cell culture |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma-aldrich | G4251-100G | Elution buffer preparation for Glutathione beads |
| Ni-Sepharose excel beads | Cytiva | 17371202 | Affinity chromatography |
| N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM) | Sangon Biotech | A610424-001 | Detergent for protein purification |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-aldrich | T9281-100ML | SDS-PAGE gel preparation |
| PBS | Sangon Biotech | E607008-0500 | Homogenization buffer for E.coli. cell |
| PMSF | Lablead | P0754-25G | Protease inhibitor |
| Prestained protein marker | Thermo Scientific | 26619/26616 | Prestained protein ladder |
| Size exclusion column (preparation grade) | Cytiva | 28989336 | HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column |
| Size exclusion column (analytical grade) | Cytiva | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL column |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218-0001 | Protein purification buffer preparation |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sangon Biotech | A500228-0001 | SDS-PAGE gel/buffer preparation |
| Tris base | Sigma-aldrich | T1503-10KG | Protein purification buffer preparation |
| Ultrafiltration spin column | Millipore | UFC901096/801096 | Protein concentration |
| Equipment | |||
| Analytical Balance | DENVER | APX-60 | Metage of Drosophila head |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes | Eppendorf | 5810R | Protein concentration |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes | Eppendorf | 5417R | Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm) | Bio-Rad | 738-0015 | TRP protein purification |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm) | Bio-Rad | 738-0017 | Bait and competitor protein purification from E.coli. |
| Gel Documentation System | Bio-Rad | Universal Hood II Gel Doc XR System | SDS-PAGE imaging |
| High-speed refrigerated centrifuge | Beckman coulter | Avanti J-26 XP | Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate |
| High pressure homogenizer | UNION-BIOTECH | UH-05 | Homogenization of E.coli. cells |
| Liquid nitrogen tank | Taylor-Wharton | CX-100 | Drosophila head preparation |
| Protein purification system | Cytiva | AKTA purifier | Protein purification |
| Refrigerator (-80°C) | Thermo | 900GP | Drosophila head preparation |
| Spectrophotometer | MAPADA | UV-1200 | OD600 measurement of E.coli. cells |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000c | Determination of protein concentration |
| Ultracentrifuge | Beckman coulter | Optima XPN-100 Ultracentrifuge | Ultracentrifugation |
References
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