Utilisation de la coloration rouge Alizarin pour détecter la perte osseuse induite chimiquement chez les larves de poisson zèbre
Summary
Ici, nous avons utilisé la coloration rouge alizarine pour montrer que l’exposition à l’acétate de plomb provoque un changement de masse osseuse chez les larves de poisson zèbre. Cette méthode de coloration peut être adaptée à l’étude de la perte osseuse chez les larves de poisson zèbre induite par d’autres substances toxiques dangereuses.
Abstract
La perte osseuse induite chimiquement due à l’exposition au plomb (Pb) pourrait déclencher une série d’effets néfastes sur les systèmes squelettiques humains et animaux. Cependant, les effets et les mécanismes spécifiques chez le poisson zèbre restent flous. Le rouge d’alizarine a une forte affinité pour les ions calcium et peut aider à visualiser l’os et illustrer la masse minérale squelettique. Dans cette étude, nous avons cherché à détecter la perte osseuse induite par l’acétate de plomb (PbAc) chez les larves de poisson zèbre en utilisant la coloration rouge alizarine. Les embryons de poisson zèbre ont été traités avec une série de concentrations de PbAc (0, 5, 10, 20 mg / L) entre 2 et 120 h après la fécondation. Une coloration du squelette entier a été effectuée sur les larves 9 jours après la fécondation, et la surface totale colorée a été quantifiée à l’aide du logiciel ImageJ. Les résultats ont indiqué que les tissus minéralisés étaient colorés en rouge et que la zone colorée diminuait considérablement dans le groupe exposé au PbAc, avec un changement dose-dépendant de la minéralisation osseuse. Cet article présente un protocole de coloration pour étudier les changements squelettiques dans les défauts osseux induits par PbAc. La méthode peut également être utilisée chez les larves de poisson zèbre pour la détection de la perte osseuse induite par d’autres produits chimiques.
Introduction
Des études récentes ont confirmé que l’ostéoporose due aux glucocorticoïdes, aux inhibiteurs de l’aromatase et à la consommation excessive d’alcool est courante 1,2. Le plomb (Pb) est un métal toxique présent dans les plantes, le sol et les milieux aquatiques3. Bien que les effets néfastes du plomb sur le corps humain aient attiré beaucoup d’attention, son impact irréversible sur les os doit être étudié plus avant. L’intoxication au plomb provoque un large éventail de changements pathologiques dans le squelette en développement et chez l’adulte, affectant les activités normales de la vie. Des études ont trouvé une association entre l’exposition chronique au plomb et les lésions osseuses4, y compris des structures osseuses altérées5,6, une densité minérale osseuse réduite et même un risque accru d’ostéoporose7.
Les tissus minéralisés sont d’une grande importance pour la solidité osseuse8, et le dépôt de la matrice de minéralisation osseuse est un indice critique de la formation osseuse9. Le rouge d’alizarine a une forte affinité pour les ions calcium, et la coloration au rouge d’alizarine est une procédure standard pour évaluer la formation osseuse10. Selon cette méthode, les tissus minéralisés sont colorés en rouge, tandis que tous les autres tissus restent transparents. La zone colorée est ensuite quantifiée par analyse d’images numériques11.
Le poisson zèbre est un organisme modèle important largement utilisé dans la découverte de médicaments et les modèles de maladies. Des études génétiques chez le poisson zèbre et l’homme ont démontré des similitudes dans les mécanismes sous-jacents de la morphogenèse squelettique au niveau moléculaire12. De plus, le criblage de médicaments ou de biomolécules à haut débit est plus réalisable dans de grandes couvées de poisson-zèbre que dans des modèles murins, ce qui facilite l’étude mécaniste de molécules proostéogènes ou ostéotoxiques13. La coloration différentielle du squelette au total10 est fréquemment utilisée dans l’étude de la dysplasie squelettique chez les petits vertébrés et les fœtus de mammifères. La coloration rouge d’alizarine a été réalisée pour étudier la toxicité pour le développement osseux des produits chimiques dans les larves de poisson zèbre. Ici, nous avons utilisé le plomb comme exemple pour décrire un protocole de détection des défauts osseux induits par l’acétate de plomb chez les larves de poisson zèbre.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le poisson zèbre est un modèle approprié pour étudier les maladies métaboliques osseuses. Comparés aux modèles de rongeurs, les modèles de poisson zèbre sont relativement rapides à établir et la mesure de la gravité de la maladie est plus facile. Chez les larves de poisson-zèbre de type sauvage, la minéralisation du squelette de la tête se produit à 5 dpf et du squelette axial à 7 dpf15. Ainsi, les os crâniens tels que PS, OP, CB et NC sont bien développés à 9 dpf. Une fois le…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81872646; 81811540034; 81573173) et le développement du programme académique prioritaire des établissements d’enseignement supérieur du Jiangsu (PAPD).
Materials
| 1 M Tris-HCl (pH=7.5) | Solarbio,Beijing,China | 21 | for detaining |
| 4% Paraformaldehyde Fix Solution | BBI,Shanghai,China | 14 | fixing tissues |
| 10x PBS buffer | BBI,Shanghai,China | 15 | for fixing |
| 35% H2O2 | Yonghua,Jiangsu,China | 8 | removing pigment |
| 50 mL Centrifuge tube | AKX,Jiangsu,China | 4 | |
| 95% Anhydrous ethanol | Enox,Jiangsu,China | 2 | destaining |
| Alizarin red (Purity 99.5%) | Solarbio,Beijing,China | 1 | staining |
| Biochemical incubator | Yiheng,Shanghai,China | 3 | raising zebrafish embryos |
| Electronic scale | Sartorius,Germany | 5 | weighing the solid raw materials |
| Glycerin (Purity 99.5%) | BBI,Shanghai,China | 7 | storing the stained fish |
| ImageJ (software) | USA | 9 | digital analysis |
| KOH (Purity 99.9%) | Sigma,America | 10 | bleaching solution |
| Lead acetate trihydrate (Purity 99.5%) | Aladdin,Shanghai,China | 11 | |
| MgCl2 (Purity 99.9%) | Aladdin,Shanghai,China | 12 | cleaning solution |
| NIS-Elements F (software) | Nikon, Japan | 13 | observing and taking photos |
| Pipe | AKX, Jiangsu, China | 18 | removal of embryos and solution |
| plates (24-well) | Corning,America | 17 | container for staining embryos |
| plates (6-well) | Corning,America | 16 | container for breeding embryos |
| Shaking table | Beyotime, China | 19 | mixing the solution |
| Stereo microscope | Nikon,Japan | 20 | observing and taking photos |
| Zebrafish | Zebrafish Experiment Center of Soochow University,Suzhou,China | 22 | experimental animal |
References
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