استخدام تلطيخ أليزارين الأحمر للكشف عن فقدان العظام المستحث كيميائيا في يرقات الزرد
Summary
هنا ، استخدمنا تلطيخ أليزارين الأحمر لإظهار أن التعرض لأسيتات الرصاص يسبب تغيرا في كتلة العظام في يرقات الزرد. يمكن تكييف طريقة التلوين هذه للتحقيق في فقدان العظام في فقدان يرقات الزرد الناجم عن المواد السامة الخطرة الأخرى.
Abstract
يمكن أن يؤدي فقدان العظام المستحث كيميائيا بسبب التعرض للرصاص (Pb) إلى مجموعة من الآثار الضارة على كل من أنظمة الهيكل العظمي البشري والحيواني. ومع ذلك ، فإن الآثار والآليات المحددة في الزرد لا تزال غير واضحة. يحتوي Alizarin red على تقارب كبير لأيونات الكالسيوم ويمكن أن يساعد في تصور العظام وتوضيح الكتلة المعدنية للهيكل العظمي. في هذه الدراسة ، كنا نهدف إلى الكشف عن فقدان العظام الناجم عن أسيتات الرصاص (PbAc) في يرقات الزرد باستخدام تلطيخ أليزارين الأحمر. وعولجت أجنة أسماك الزرد بسلسلة من تركيزات PbAc (0، 5، 10، 20 ملغم/لتر) بين 2 و120 ساعة بعد الإخصاب. تم إجراء تلطيخ الهيكل العظمي بالكامل على اليرقات في 9 أيام بعد الإخصاب ، وتم تحديد إجمالي المساحة الملطخة باستخدام برنامج ImageJ. أشارت النتائج إلى أن الأنسجة المعدنية كانت ملطخة باللون الأحمر ، وانخفضت المنطقة الملطخة بشكل ملحوظ في مجموعة التعرض ل PbAc ، مع تغير يعتمد على الجرعة في تمعدن العظام. تقدم هذه الورقة بروتوكول تلطيخ للتحقيق في التغيرات الهيكلية في عيوب العظام التي يسببها PbAc. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة في يرقات الزرد للكشف عن فقدان العظام الناجم عن المواد الكيميائية الأخرى.
Introduction
أكدت الدراسات الحديثة أن هشاشة العظام بسبب الجلوكوكورتيكويد ومثبطات الأروماتاز والاستهلاك المفرط للكحول أمر شائع 1,2. الرصاص (Pb) هو معدن سام موجود في النباتات والتربة والبيئات المائية3. على الرغم من أن الآثار الضارة للرصاص على جسم الإنسان قد جذبت الكثير من الاهتمام ، إلا أن تأثيره الذي لا رجعة فيه على العظام يحتاج إلى مزيد من التحقيق. يسبب التسمم بالرصاص مجموعة متنوعة من التغيرات المرضية في كل من الهيكل العظمي النامي والبالغ ، مما يؤثر على أنشطة الحياة الطبيعية. وجدت الدراسات ارتباطا بين التعرض المزمن ل Pb وتلف العظام4 ، بما في ذلك ضعف هياكل العظام 5,6 ، وانخفاض كثافة المعادن في العظام ، وحتى زيادة خطر الإصابة بهشاشة العظام7.
الأنسجة المعدنية لها أهمية كبيرة لقوة العظام8 ، وترسب مصفوفة تمعدن العظام هو مؤشر حاسم لتكوين العظام9. يحتوي Alizarin red على تقارب كبير لأيونات الكالسيوم ، وتلوين Alizarin الأحمر هو إجراء قياسي لتقييم تكوين العظام10. وفقا لهذه الطريقة ، تكون الأنسجة المعدنية ملطخة باللون الأحمر ، بينما تظل جميع الأنسجة الأخرى شفافة. ثم يتم تحديد المنطقة الملطخة عن طريق تحليل الصور الرقمية11.
الزرد هو كائن نموذجي مهم يستخدم على نطاق واسع في اكتشاف الأدوية ونماذج الأمراض. أظهرت الدراسات الجينية في الزرد والبشر أوجه تشابه في الآليات الأساسية لتكوين الهيكل العظمي على المستوىالجزيئي 12. علاوة على ذلك ، فإن فحص الأدوية أو الجزيئات الحيوية عالي الإنتاجية أكثر جدوى في براثن الزرد الكبيرة من نماذج الفئران ، مما يسهل الدراسة الميكانيكية للجزيئات proosteogenic أو السامة للعظام13. كثيرا ما يستخدم التلوين التفاضلي للهيكل العظمي في توتو10 في دراسة خلل التنسج الهيكلي في الفقاريات الصغيرة والأجنة الثديية. تم إجراء تلطيخ أحمر Alizarin للتحقيق في السمية التنموية للعظام للمواد الكيميائية في يرقات الزرد. هنا ، استخدمنا الرصاص كمثال لوصف بروتوكول للكشف عن عيوب العظام التي تسببها أسيتات الرصاص في يرقات الزرد.
Protocol
Representative Results
Discussion
الزرد هو نموذج مناسب لدراسة أمراض التمثيل الغذائي للعظام. بالمقارنة مع نماذج القوارض ، فإن نماذج الزرد سريعة نسبيا في التأسيس ، وقياس شدة المرض أسهل. في يرقات الزرد من النوع البري ، يحدث تمعدن الهيكل العظمي للرأس عند 5 dpf والهيكل العظمي المحوري عند 7 dpf15. وبالتالي ، تم تطوير عظام…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81872646 ؛ 81811540034 ؛ 81573173) وتطوير البرنامج الأكاديمي ذي الأولوية لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو (PAPD).
Materials
| 1 M Tris-HCl (pH=7.5) | Solarbio,Beijing,China | 21 | for detaining |
| 4% Paraformaldehyde Fix Solution | BBI,Shanghai,China | 14 | fixing tissues |
| 10x PBS buffer | BBI,Shanghai,China | 15 | for fixing |
| 35% H2O2 | Yonghua,Jiangsu,China | 8 | removing pigment |
| 50 mL Centrifuge tube | AKX,Jiangsu,China | 4 | |
| 95% Anhydrous ethanol | Enox,Jiangsu,China | 2 | destaining |
| Alizarin red (Purity 99.5%) | Solarbio,Beijing,China | 1 | staining |
| Biochemical incubator | Yiheng,Shanghai,China | 3 | raising zebrafish embryos |
| Electronic scale | Sartorius,Germany | 5 | weighing the solid raw materials |
| Glycerin (Purity 99.5%) | BBI,Shanghai,China | 7 | storing the stained fish |
| ImageJ (software) | USA | 9 | digital analysis |
| KOH (Purity 99.9%) | Sigma,America | 10 | bleaching solution |
| Lead acetate trihydrate (Purity 99.5%) | Aladdin,Shanghai,China | 11 | |
| MgCl2 (Purity 99.9%) | Aladdin,Shanghai,China | 12 | cleaning solution |
| NIS-Elements F (software) | Nikon, Japan | 13 | observing and taking photos |
| Pipe | AKX, Jiangsu, China | 18 | removal of embryos and solution |
| plates (24-well) | Corning,America | 17 | container for staining embryos |
| plates (6-well) | Corning,America | 16 | container for breeding embryos |
| Shaking table | Beyotime, China | 19 | mixing the solution |
| Stereo microscope | Nikon,Japan | 20 | observing and taking photos |
| Zebrafish | Zebrafish Experiment Center of Soochow University,Suzhou,China | 22 | experimental animal |
References
- Compston, J., et al. Recommendations for the registration of agents for prevention and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis: an update from the Group for the Respect of Ethics and Excellence in Science. Osteoporosis International. 19 (9), 1247-1250 (2008).
- Rachner, T. D., Gobel, A., Jaschke, N. P., Hofbauer, L. C. Challenges in preventing bone loss induced by aromatase inhibitors. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (10), (2020).
- Kataba, A., et al. Acute exposure to environmentally relevant lead levels induces oxidative stress and neurobehavioral alterations in larval zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 227, 105607 (2020).
- Morin, S. N., et al. Differences in fracture prevalence and in bone mineral density between Chinese and White Canadians: the Canadian Multicentre Osteoporosis Study (CaMos). Archives of Osteoporosis. 15 (1), 147 (2020).
- Lee, C. M., et al. Chronic lead poisoning magnifies bone detrimental effects in an ovariectomized rat model of postmenopausal osteoporosis. Experimental Toxicologic Pathology. 68 (1), 47-53 (2016).
- Theppeang, K., et al. Associations of bone mineral density and lead levels in blood, tibia, and patella in urban-dwelling women. Environmental Health Perspectives. 116 (6), 784-790 (2008).
- Sun, Y., et al. Osteoporosis in a Chinese population due to occupational exposure to lead. American Journal Industrial Medicine. 51 (6), 436-442 (2008).
- Guadalupe-Grau, A., Fuentes, T., Guerra, B., Calbet, J. A. L. Exercise and bone mass in adults. Sports Medicine. 39 (6), 439-468 (2009).
- Ottani, V., Raspanti, M., Ruggeri, A. Collagen structure and functional implications. Micron. 32 (3), 251-260 (2001).
- Kelly, W. L., Bryden, M. M. A modified differential stain for cartilage and bone in whole mount preparations of mammalian fetuses and small vertebrates. Stain Technology. 58 (3), 131-134 (1983).
- Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Fernandez, I., Gavaia, P. J., Laize, V., Cancela, M. L. Fish as a model to assess chemical toxicity in bone. Aquatic Toxicology. 194, 208-226 (2018).
- Wang, L., et al. Role of GH/IGF axis in arsenite-induced developmental toxicity in zebrafish embryos. Ecotoxicology Environmental Safety. 201, 110820 (2020).
- Bergen, D. J. M., Kague, E., Hammond, C. L. Zebrafish as an emerging model for osteoporosis: a primary testing platform for screening new osteo-active compounds. Frontiers in Endocrinology. 10, 6 (2019).
- Charles, J. F., et al. Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis. Bone. 101, 162-171 (2017).
- Hammond, C. L., Moro, E. Using transgenic reporters to visualize bone and cartilage signaling during development in vivo. Frontiers in Endocrinology. 3, 91 (2012).
- Bensimon-Brito, A., et al. Revisiting in vivo staining with alizarin red S–a valuable approach to analyse zebrafish skeletal mineralization during development and regeneration. BMC Developmental Biology. 16, 2 (2016).
