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生物化学

그람 양성 박테리아 성장의 소분자 억제제 인 Masarimycin의 합성

Published: January 07, 2022
doi:
10.3791/63191
, ,
1Department of Science and Technology,Bryant University, 2Center for Health and Behavioral Sciences,Bryant University

Summary

세포벽 분해를 표적화함으로써 바실러스 서브틸 리스 및 스트렙토코커스 폐렴 의 성장을 억제하는 소분자 프로브인 정균성 디아미드 마사리마이신을 제조하기 위한 상세한 프로토콜이 제시된다. 화학 프로브로서의 그것의 적용은 B. subtilis 및 S. pneumoniae를 사용한 시너지 효과 / 길항작용 분석 및 형태 학적 연구에서 입증됩니다.

Abstract

박테리아의 세포벽에있는 펩티도글리칸 (PG)은 모양과 주변 환경으로부터의 보호를 부여하는 독특한 거대 분자 구조입니다. 세포 성장과 분열을 이해하는 핵심은 PG 분해가 생합성 및 세포벽 조립에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 지식입니다. 최근에, 변형된 당 또는 아미노산의 도입을 통한 PG의 대사 표지가 보고되고 있다. 소분자 억제제를 사용한 생합성 단계의 화학적 심문이 가능하지만, autolysins에 의한 PG 분해를 연구하기위한 화학 생물학 도구는 저개발되어 있습니다. 박테리아 autolysins는 PG의 긴밀하게 배위된 분해에 관여하는 효소의 광범위한 부류이다. 여기에서, 바실러스 서브틸리스 에서 N-아세틸글루코사미니다제 LytG의 억제제인 소분자 프로브인 마사리마이신, 및 폐렴구균에서 세포벽 대사를 제조하기 위한 상세한 프로토콜이 제시된다. 마이크로파 보조 및 고전적 유기 합성을 통한 억제제의 제조가 제공된다. 생물학적 분석에서 그람 양성 생리학을 연구하는 도구로서의 적용 가능성이 제시됩니다.

Introduction

펩티도글리칸(PG)은 그람 양성균과 그람 음성 박테리아 1,2 모두에서 세포 모양과 구조를 묘사하는 메쉬형 폴리머이다. 이러한 헤테로폴리머는 짧은 펩티드3,4,5,6에 의해 가교결합된 아미노 당류의 매트릭스이며, β-(1,4)-연결된 교대 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 N-아세틸무람산(MurNAc) 잔기로 구성된 백본을 갖는다(도 1)1. MurNAc의 C-3 락틸 모이어티에 부착된 것은 줄기 펩티드이다. PG의 신진 대사는 세포벽 7,8에 새로운 물질을 통합하기 위해 생합성 및 분해 효소의 밀접하게 조정 된 시스템을 포함한다. PG의 분해는 자율분해신9로 총칭되는 효소에 의해 수행되고, 절단된 결합의 특이성에 기초하여 추가로 분류된다. 오토리신은 세포 성장, 세포 분열, 운동성, PG 성숙, 화학주성, 단백질 분비, 유전 능력, 분화 및 병원성10,11을 포함한 많은 세포 과정에 참여한다. 개별 autolysins의 특정 생물학적 기능을 푸는 것은 부분적으로 기능적 중복성으로 인해 어려울 수 있습니다. 그러나, 최근의 생물물리학적 8,12,13 및 전산 연구(12)는 PG 대사에서의 그들의 역할에 대한 새로운 통찰력을 제공하였다. 또한, 최근의 보고들은 PG 대사에서 합성14 및 막 매개 15,16,17 단계에 대한 추가적인 통찰을 제공하였다. PG 신진 대사의 분해 경로와 합성 경로 사이의 관계에 대한 철저한 이해는 이전에 미개척 된 항생제 표적을 야기 할 수 있습니다.

진핵생물에서 당생물학을 연구하기 위한 방법론의 상당한 발전이 있었지만, 박테리아 당생물학 및 특히 PG 대사는 유사한 속도로 진행되지 않았다. PG 대사를 연구하기 위한 현재의 화학적 접근법에는 형광 표지된 항생제18, 형광 프로브19,20 및 대사 표지21,22,23,24가 포함된다. 이러한 새로운 접근법은 박테리아 세포벽 신진 대사를 조사하는 새로운 방법을 제공하고 있습니다. 이들 전략 중 일부는 생체내에서 PG를 표지할 수 있지만, 이들은 종-특이적19일 수 있거나, 또는 특정 자가분해신(25)이 결여된 균주에서만 작용할 수 있다. 많은 PG 표지 전략은 단리된 세포벽(26) 또는 시험관내 재구성된 PG 생합성 경로(20,27,28)와 함께 사용하기 위한 것이다. 형광 표지된 항생제의 사용은 현재 생합성 단계 및 형질소화(transpeptidation)18로 제한된다.

박테리아 autolysins에 대한 현재의 지식과 세포벽 대사에서의 그들의 역할은 유전 및 시험관 내 생화학 분석 11,29,30,31,32에서 비롯됩니다. 이러한 접근법은이 중요한 종류의 효소에 대한 풍부한 정보를 제공했지만 생물학적 역할을 해독하는 것은 어려울 수 있습니다. 예를 들어, 기능적 중복성(33)으로 인해, 대부분의 경우 자가분해신의 결실은 박테리아 성장을 정지시키는 결과를 초래하지 않는다. 이것은 세포 성장 및 분열에서 그들의 묵시적 역할에도 불구하고 7,12. 또 다른 합병증은 박테리아 autolysin의 유전 적 결실이 메타 표현형34를 일으킬 수 있다는 것입니다. 메타 표현형은 유전 적 결실에 의해 영향을받는 경로와 다른 상호 연결된 경로 사이의 복잡한 상호 작용에서 발생합니다. 예를 들어, 메타 표현형은 효소의 부족과 같은 직접적인 효과 또는 조절자의 파괴와 같은 간접적 인 효과를 통해 발생할 수 있습니다.

현재, PG의 분해를 연구하기 위한 화학 프로브로 사용될 수 있는 N-아세틸글루코사미니다제(GlcNAcase) 및 N-아세틸무라미다제와 같은 글리코시다제 autolysins의 억제제는 단지 몇 가지 밖에 없다. 이를 해결하기 위해, 디아미드 마사리마이신 (이전에 fgkc로 불림)은 GlcNAcase LytG32를 표적으로 하는 바실러스 서브틸리스 성장의 정균 억제제로서 확인되고 특성화되었다 (도 1). LytG는 엑소-작용 GlcNAcase36이며, 글리코실 가수분해효소 패밀리 73 (GH73) 내의 클러스터 2의 구성원이다. 그것은 식물 성장 동안 주요 활성 GlcNAcase입니다32. 우리의 지식에 따르면, 마사리 마이신은 세포 성장을 억제하는 PG 작용 GlcNAcase의 첫 번째 억제제입니다. 스트렙토코커스 폐렴을 이용한 마사리마이신에 대한 추가 연구에 따르면 마사리마이신은 이 유기체에서 세포벽 대사를 억제할 가능성이 높다는 것을 발견했다37. 여기서, 마사리마이신의 제제는 그람 양성 유기체 B. subtilis 및 S. pneumoniae에서 생리학을 연구하기 위한 화학 생물학 프로브로서 사용하기 위한 것으로 보고되어 있다. 마사리마이신을 사용한 서브 최소 억제 농도 처리의 형태학적 분석의 예, 뿐만 아니라 상승작용/길항작용 분석이 제시된다. 잘 정의된 작용 모드를 갖는 항생제를 사용하는 시너지 및 길항작용 분석은 세포 과정38,39,40 사이의 연관성을 탐구하는 유용한 방법이 될 수 있다.

Protocol

1. 일반적인 방법 참고: 모든 화합물은 표준 공급업체로부터 구입하여 추가 정제 없이 사용했습니다. 실리카 겔 XG F254로 예비코팅된 알루미늄 플레이트에 박층 크로마토그래피(TLC)를 수행하십시오. UV 램프 아래, p-anisaldehyde 얼룩에 침지하거나 I2 증기에 노출시켜 반점을 감지합니다. 모든 핵 자기 공명(NMR) 스펙트럼을 400MHz 분광계에 ?…

Representative Results

마사리마이신은 B. subtilis 및 S. pneumoniae의 소분자 정균 억제제이며, B. subtilis35,37에서 엑소액 작용 GlcNAcase LytG를 억제하고 S. pneumoniae 37에서 세포벽을 표적으로 하는 것으로 나타났다. Masarimycin은 55 % -70 % 범위의 수율로 고전적 또는 전자 레인지 보조 유기 합성에 의해 효율적으로 제조 될 수 있습니다. 마이크?…

Discussion

마사리마이신은 B. subtilis35 및 S. pneumoniae37 성장의 단일 마이크로몰 정균 억제제이다. B. subtilis에서, 마사리마이신은 GlcNAcase LytG 35를 억제하는 것으로 나타났지만, S. pneumoniae의 세포벽에서 정확한 분자 표적은 확인되지 않았다37. 고전적인 유기 합성 또는 마이크로파 절차를 사용하여 마사리 마이신의 합성…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

연구는 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 보조금 번호 2009522에 의해 지원되었습니다. 마사리마이신에 대한 NMR 분석은 국립 과학 재단의 주요 연구 계측 프로그램 어워드에 의해 보조금 번호 1919644에 의해 지원되었다. 이 자료에 표현 된 의견, 결과 및 결론 또는 권장 사항은 저자의 의견이며 반드시 국립 과학 재단의 견해를 반영하지는 않습니다.

Materials

2-Iodobenzoic acid SIGMA-ALDRICH I7675-25G corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder
2-Propanol SIGMA-ALDRICH 109827-4L flammable, irritant, colorless liquid
Acetonitrile SIGMA-ALDRICH 34851-4L flammable, irritant, colorless liquid
Aluminum backed silica plates Sorbtech 4434126 silica gel XG F254 on aluminum backed plates
chloroform-d SIGMA-ALDRICH 151823-50G solvent for NMR
Compact Mass Spectrometer Advion-Interchim Advion CMS compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe
Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile fisher chemical 07-200-90 for synergy/antagonism assays
cover slips fisher chemical 12-547 for microscopy
Cyclohexanecarboxaldehyde CHEM-IMPEX INT'L INC. 24451 flammable, irritant, colorless to pink liquid
Cyclohexyl isocyanide SIGMA-ALDRICH 133302-5G irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor
Cyclohexylamine SIGMA-ALDRICH 240648-100ML corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated
Ethyl acetate SIGMA-ALDRICH 537446-4L flammable, irritant, colorless liquid
flash silica cartridge (12g) Advion-Interchim PF-50SIHP-F0012 pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin
formaldehyde SIGMA-ALDRICH F8775-25ML fixing agent for microscopy
HEPES SIGMA-ALDRICH H8651-25G buffer for microscopy fixing solution
Hexane, mixture of isomers SIGMA-ALDRICH 178918-4L environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid
High performance compact mass spectrometer Advion expression Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution
High Vac eppendorf Vacufuge plus vacuum aided by centrifugal force and temperature
Hydrochloric acid SIGMA-ALDRICH 258148-2.5L corrosive, irritant, colorless liquid
hydrochloric acid SIGMA-ALDRICH 320331-2.5L strong acid
immersion oil fisher chemical 12-365-19 for microscopy
Iodine, resublimed crystals Alfa Aesar 41955 environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals
Mestre Mnova MestreLab Research software for processing NMR spectra
Methanol SIGMA-ALDRICH 439193-4L flammable, toxic, health hazard, colorless liquid
methylene blue SIGMA-ALDRICH M9140-25G microscopy stain for staining cell walls
meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood fisher chemical B21176X growth media for Streptococcus pneumoniae
meuller-hinton broth fisher chemical DF0757-17-6 growth media for Streptococcus pneumoniae
microscope slides fisher chemical 22-310397 for microscopy
Microwave Synthesis Labstation MILESTONE START SYNTH device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel
NMR tubes SIGMA-ALDRICH Z562769-5EA 5mm NMR tubes 600 MHz
Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Bruker Ascend 400 large superconducting magnet (400MHz)
optochin fisher chemical AAB21627MC ethylhydrocupreine hydrochloride
petrie plates Celltreat 229695 for preparing agar plates for bacterial growth
Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera Zeiss for morphology studies
puriFlash interchim XS520plus flash chromatography purification system
resazurin SIGMA-ALDRICH R7017-1G for synergy/antagonism assays
Rotary Evaporator Heidolph Hei-VAP Value "The Collegiate" solvent evaporator
Sodium bicarbonate SIGMA-ALDRICH S6014-500G irritant, white powder
Sodium chloride fisher chemical S271-1 crystalline, colorless
Sodium chloride SIGMA-ALDRICH S5886-500G for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Sodium sulfate SIGMA-ALDRICH 7985592-500G anhydrous, granular, white
tryptone fisher chemical BP1421-500 for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Whitney DG250 Workstation Microbiology International DG250 anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen
yeast extract fisher chemical BP1422-500 for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Zen Lite (blue) software Zeiss for acquiring micrographs
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References

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Gallati, M., Point, B., Reid, C. W. Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth. J. Vis. Exp. (179), e63191, doi:10.3791/63191 (2022).
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