Synthese von Masarimycin, einem niedermolekularen Inhibitor des grampositiven Bakterienwachstums

Peptidoglycan (PG) ist ein netzartiges Polymer, das die Zellform und -struktur sowohl in grampositiven als auch in gramnegativen Bakterien ^1,2 beschreibt. Dieses Heteropolymer ist eine Matrix von Aminozuckern, vernetzt durch kurze Peptide 3,4,5,6 mit einem Rückgrat^, das aus β-(^1,4)-verknüpften alternierenden N-Acetylglucosamin- (GlcNAc) und N-Acetylmuraminsäure (MurNAc)-Resten besteht (Abbildung 1)1. An den C-3-Lactylanteil von MurNAc ist das Stammpeptid gebunden. Der Metabolismus von PG beinhaltet ein eng koordiniertes System von biosynthetischen und abbaubaren Enzymen, um neues Material in die Zellwand einzubauen ^7,8. Der Abbau von PG erfolgt durch Enzyme, die zusammen als Autolysine⁹ bezeichnet und basierend auf der Spezifität der gespaltenen Bindung weiter klassifiziert werden. Autolysine nehmen an vielen zellulären Prozessen teil, einschließlich Zellwachstum, Zellteilung, Motilität, PG-Reifung, Chemotaxis, Proteinsekretion, genetischer Kompetenz, Differenzierung und Pathogenität^10,11. Die Entschlüsselung der spezifischen biologischen Funktionen einzelner Autolysine kann entmutigend sein, was zum Teil auf funktionelle Redundanz zurückzuführen ist. Jüngste biophysikalische 8,12,13 und Computerstudien ¹² haben jedoch neue Einblicke in ihre Rolle im PG-Stoffwechsel geliefert. Darüber hinaus haben jüngste Berichte weitere Einblicke in die Synthese¹⁴ und membranvermittelten 15,16,17 Schritte im PG-Metabolismus gegeben. Ein gründliches Verständnis der Beziehung zwischen abbauenden und synthetischen Signalwegen des PG-Stoffwechsels könnte zu bisher unerschlossenen Antibiotikazielen führen.

Während es signifikante Fortschritte in der Methodik zur Untersuchung der Glykobiologie bei Eukaryoten gegeben hat, ist die bakterielle Glykobiologie und insbesondere der PG-Stoffwechsel nicht mit einer ähnlichen Geschwindigkeit fortgeschritten. Aktuelle chemische Ansätze zur Untersuchung des PG-Stoffwechsels umfassen fluoreszenzmarkierte Antibiotika¹⁸, fluoreszierende Sonden 19,20 und metabolische Markierung 21,22,23,24. Diese neuen Ansätze bieten neue Möglichkeiten, den bakteriellen Zellwandstoffwechsel zu hinterfragen. Während einige dieser Strategien in der Lage sind, PG in vivo zu markieren, können sie artspezifisch¹⁹ sein oder nur in Stämmen funktionieren, denen ein bestimmtes Autolysin²⁵ fehlt. Viele PG-Markierungsstrategien sind für die Verwendung mit isolierten^{Zellwänden 26} oder mit in vitro rekonstituierten PG-Biosynthesewegen^20,27,28 vorgesehen. Der Einsatz fluoreszierend markierter Antibiotika beschränkt sich derzeit auf biosynthetische Schritte und Transpeptidation¹⁸.

Das aktuelle Wissen über bakterielle Autolysine und ihre Rolle im Zellwandstoffwechsel stammt aus genetischen und in vitro biochemischen Analysen 11,29,30,31,32. Während diese Ansätze eine Fülle von Informationen über diese wichtige Klasse von Enzymen geliefert haben, kann die Entschlüsselung ihrer biologischen Rolle eine Herausforderung sein. Zum Beispiel führt die Deletion eines Autolysins aufgrund der funktionellen Redundanz³³ in den meisten Fällen nicht dazu, dass das Bakterienwachstum gestoppt wird. Dies ist trotz ihrer impliziten Rolle beim Zellwachstum und der Zellteilung ^7,12. Eine weitere Komplikation ist, dass die genetische Deletion von bakteriellen Autolysinen zu Meta-Phänotypen³⁴ führen kann. Meta-Phänotypen entstehen aus dem komplexen Zusammenspiel zwischen dem von der genetischen Deletion betroffenen Signalweg und anderen miteinander verbundenen Wegen. Zum Beispiel kann ein Meta-Phänotyp über einen direkten Effekt wie das Fehlen eines Enzyms oder einen indirekten Effekt wie eine Störung der Regulatoren entstehen.

Derzeit gibt es nur wenige Inhibitoren von Glykosidasenautolysinen wie N-Acetylglucosaminidasen (GlcNAcase) und N-Acetylmuramidasen, die als chemische Sonden verwendet werden können, um den Abbau von PG zu untersuchen. Um dies zu beheben, wurde das Diamid-Masarimycin (früher als fgkc bezeichnet)^{identifiziert und 35} als bakteriostatischer Inhibitor des Bacillus subtilis-Wachstums charakterisiert, der auf das GlcNAcase LytG³² abzielt (Abbildung 1). LytG ist ein exo-wirkendes GlcNAcase³⁶, ein Mitglied von Cluster 2 innerhalb der Glykosylhydrolasefamilie 73 (GH73). Es ist das wichtigste aktive GlcNAcase während des vegetativen Wachstums³². Unseres Wissens ist Masarimycin der erste Inhibitor eines PG-wirkenden GlcNAcase, der das Zellwachstum hemmt. Zusätzliche Studien von Masarimycin mit Streptococcus pneumoniae ergaben, dass Masarimycin wahrscheinlich den Zellwandstoffwechsel in diesem Organismus^{hemmt 37}. Hier wird die Herstellung von Masarimycin zur Verwendung als chemisch-biologische Sonde zur Untersuchung der Physiologie in den grampositiven Organismen B. subtilis und S. pneumoniae berichtet. Es werden Beispiele für die morphologische Analyse der Behandlung der inhibitorischen Konzentration unter dem Minimum mit Masarimycin sowie ein Synergie-/Antagonismus-Assay vorgestellt. Synergie- und Antagonismus-Assays mit Antibiotika mit klar definierten Wirkungsweisen können ein nützlicher Weg sein, um Verbindungen zwischen zellulären Prozessen zu erforschen^38,39,40.