تخليق ماساريميسين ، وهو مثبط جزيء صغير للنمو البكتيري الإيجابي الجرام
Summary
يتم تقديم بروتوكول مفصل لإعداد الدياميد ماساريميسين المضاد للجراثيم ، وهو مسبار جزيء صغير يمنع نمو Bacillus subtilis والمكورات العقدية الرئوية عن طريق استهداف تدهور جدار الخلية. يظهر تطبيقه كمسبار كيميائي في اختبارات التآزر / العداء والدراسات المورفولوجية مع B. subtilis و S. pneumoniae.
Abstract
Peptidoglycan (PG) في جدار الخلية من البكتيريا هو بنية جزيئية كبيرة فريدة من نوعها تمنح الشكل والحماية من البيئة المحيطة. من الأمور الأساسية لفهم نمو الخلايا وانقسامها معرفة كيفية تأثير تدهور PG على التخليق الحيوي وتجميع جدار الخلية. في الآونة الأخيرة ، تم الإبلاغ عن وضع العلامات الأيضية ل PG من خلال إدخال السكريات المعدلة أو الأحماض الأمينية. في حين أن الاستجواب الكيميائي لخطوات التخليق الحيوي مع مثبطات الجزيئات الصغيرة أمر ممكن ، فإن أدوات البيولوجيا الكيميائية لدراسة تدهور PG بواسطة autolysins غير متطورة. ال autolysins البكتيرية هي فئة واسعة من الإنزيمات التي تشارك في التدهور المنسق بإحكام من PG. هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل لإعداد مسبار جزيء صغير ، masarimycin ، وهو مثبط ل N-acetylglucosaminidase LytG في Bacillus subtilis ، واستقلاب جدار الخلية في العقدية الرئوية. يتم توفير إعداد المثبط عن طريق التوليف العضوي بمساعدة الميكروويف والكلاسيكية. يتم تقديم إمكانية تطبيقه كأداة لدراسة فسيولوجيا إيجابية الجرام في الفحوصات البيولوجية.
Introduction
Peptidoglycan (PG) هو بوليمر يشبه الشبكة يحدد شكل الخلية وبنيتها في كل من البكتيريا إيجابية الجرام وسالبة الجرام 1,2. هذا البوليمر المتغاير عبارة عن مصفوفة من السكريات الأمينية المرتبطة بالببتيدات القصيرة3،4،5،6 مع العمود الفقري المكون من بقايا N-acetylglucosamine (GlcNAc) و N-acetylmuramic acid (MurNAc) المرتبطة β (1،4) (الشكل 1)1. تعلق على C-3 لاكتيل moiety من MurNAc هو الببتيد الجذعي. يتضمن استقلاب PG نظاما منسقا بإحكام من الإنزيمات الاصطناعية الحيوية والتحلل لدمج مواد جديدة في جدار الخلية 7,8. يتم تحلل PG بواسطة إنزيمات يشار إليها مجتمعة باسم autolysins9 ويتم تصنيفها بشكل أكبر بناء على خصوصية الرابطة المشقوقة. تشارك Autolysins في العديد من العمليات الخلوية بما في ذلك نمو الخلايا ، وانقسام الخلايا ، والحركة ، ونضج PG ، و chemotaxis ، وإفراز البروتين ، والكفاءة الوراثية ، والتمايز ، والإمراض10,11. يمكن أن يكون الكشف عن الوظائف البيولوجية المحددة ل autolysins الفردية أمرا شاقا ، ويرجع ذلك جزئيا إلى التكرار الوظيفي. ومع ذلك ، قدمت الدراسات الفيزيائية الحيوية الحديثة8،12،13 والدراسات الحسابية12 نظرة ثاقبة جديدة على أدوارها في استقلاب PG. بالإضافة إلى ذلك ، قدمت التقارير الأخيرة مزيدا من التبصر في التوليف 14 وخطوات 15،16،17 بوساطة الغشاء في استقلاب PG. إن الفهم الشامل للعلاقة بين المسارات التحلل والاصطناعية لاستقلاب PG يمكن أن يؤدي إلى أهداف المضادات الحيوية غير المستغلة سابقا.
في حين كان هناك تقدم كبير في منهجية لدراسة علم الأحياء السكرية في حقيقيات النوى ، فإن علم الأحياء السكرية البكتيرية ، وعلى وجه الخصوص ، لم يتقدم استقلاب PG بمعدل مماثل. تشمل الأساليب الكيميائية الحالية لدراسة استقلاب PG المضادات الحيوية ذات العلامات الفلورية18 ، ومجسات الفلورسنت19،20 ، ووضع العلامات الأيضية21،22،23،24. توفر هذه الأساليب الجديدة طرقا جديدة لاستجواب استقلاب جدار الخلية البكتيرية. في حين أن بعض هذه الاستراتيجيات قادرة على وضع علامات PG في الجسم الحي ، إلا أنها يمكن أن تكون19 نوعا خاصا ، أو تعمل فقط في سلالات تفتقر إلى autolysin25 معين. العديد من استراتيجيات وضع العلامات PG مخصصة للاستخدام مع جدران الخلايا المعزولة26 أو مع مسارات التخليق الحيوي PG المعاد تشكيلها في المختبر 20،27،28. يقتصر استخدام المضادات الحيوية ذات العلامات الفلورية حاليا على خطوات التخليق الحيوي و transpeptidation18.
المعرفة الحالية من autolysins البكتيرية ودورها في استقلاب جدار الخلية تأتي من التحليل الكيميائي الحيوي الوراثي وفي المختبر 11،29،30،31،32. في حين أن هذه الأساليب قد وفرت ثروة من المعلومات حول هذه الفئة المهمة من الإنزيمات ، فإن فك رموز دورها البيولوجي يمكن أن يكون تحديا. على سبيل المثال ، بسبب التكرار الوظيفي33 ، لا يؤدي حذف autolysin في معظم الحالات إلى وقف نمو البكتيريا. هذا على الرغم من دورها الضمني في نمو الخلايا وانقسامها 7,12. ومن المضاعفات الأخرى أن الحذف الجيني لل autolysins البكتيرية يمكن أن يؤدي إلى ظهور أنماط ظاهرية ميتا34. تنشأ الأنماط الظاهرية الفوقية من التفاعل المعقد بين المسار المتأثر بالحذف الجيني والمسارات المترابطة الأخرى. على سبيل المثال ، يمكن أن ينشأ النمط الظاهري الفوقي عن طريق تأثير مباشر مثل عدم وجود إنزيم ، أو تأثير غير مباشر مثل تعطيل المنظمين.
حاليا ، لا يوجد سوى عدد قليل من مثبطات الغليكوزيداز autolysins مثل N-acetylglucosaminidases (GlcNAcase) و N-acetylmuramidases ، والتي يمكن استخدامها كمجسات كيميائية لدراسة تدهور PG. لمعالجة هذا ، تم تحديد diamide masarimycin (الذي كان يطلق عليه سابقا باسم fgkc) ووصف35 كمثبط للجراثيم لنمو Bacillus subtilis الذي يستهدف GlcNAcase LytG32 (الشكل 1). LytG هو GlcNAcase36 ذو مفعول خارجي ، وهو عضو في المجموعة 2 ضمن عائلة هيدرولاز غليكوزيل 73 (GH73). وهو GlcNAcase النشط الرئيسي أثناء النمو الخضري32. على حد علمنا ، Masarimycin هو أول مثبط ل GlcNAcase الذي يعمل PG والذي يمنع النمو الخلوي. وجدت دراسات إضافية على ماساريميسين مع العقدية الرئوية أن ماساريميسين من المحتمل أن يمنع استقلاب جدار الخلية في هذا الكائن الحي37. هنا ، يتم الإبلاغ عن إعداد masarimycin للاستخدام كمسبار بيولوجيا كيميائية لدراسة علم وظائف الأعضاء في الكائنات الحية إيجابية الجرام B. subtilis ، و S. pneumoniae. يتم تقديم أمثلة على التحليل المورفولوجي لعلاج التركيز المثبط دون الحد الأدنى باستخدام ماساريميسين ، بالإضافة إلى فحص التآزر / الخصومة. يمكن أن تكون مقايسات التآزر والعداء باستخدام المضادات الحيوية مع طرق عمل محددة جيدا طريقة مفيدة لاستكشاف الروابط بين العمليات الخلوية38،39،40.
Protocol
Representative Results
Discussion
Masarimycin هو مثبط واحد للجراثيم الدقيقة مولار لنمو B. subtilis35 و S. pneumoniae37. في B. subtilis ، ثبت أن masarimycin يثبط GlcNAcase LytG35 ، في حين لم يتم تحديد الهدف الجزيئي الدقيق في جدار الخلية من S. pneumoniae 37. يوفر تخليق ماساريميسين باستخدام إما التوليف ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم البحث من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم تحت رقم المنحة 2009522. تم دعم تحليل NMR ل masarimycin من قبل جائزة برنامج الأجهزة البحثية الرئيسية للمؤسسة الوطنية للعلوم تحت رقم المنحة 1919644. أي آراء أو نتائج أو استنتاجات أو توصيات يتم التعبير عنها في هذه المادة هي آراء المؤلفين ولا تعكس بالضرورة وجهات نظر المؤسسة الوطنية للعلوم.
Materials
| 2-Iodobenzoic acid | SIGMA-ALDRICH | I7675-25G | corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder |
| 2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 109827-4L | flammable, irritant, colorless liquid |
| Acetonitrile | SIGMA-ALDRICH | 34851-4L | flammable, irritant, colorless liquid |
| Aluminum backed silica plates | Sorbtech | 4434126 | silica gel XG F254 on aluminum backed plates |
| chloroform-d | SIGMA-ALDRICH | 151823-50G | solvent for NMR |
| Compact Mass Spectrometer | Advion-Interchim | Advion CMS | compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe |
| Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile | fisher chemical | 07-200-90 | for synergy/antagonism assays |
| cover slips | fisher chemical | 12-547 | for microscopy |
| Cyclohexanecarboxaldehyde | CHEM-IMPEX INT'L INC. | 24451 | flammable, irritant, colorless to pink liquid |
| Cyclohexyl isocyanide | SIGMA-ALDRICH | 133302-5G | irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor |
| Cyclohexylamine | SIGMA-ALDRICH | 240648-100ML | corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated |
| Ethyl acetate | SIGMA-ALDRICH | 537446-4L | flammable, irritant, colorless liquid |
| flash silica cartridge (12g) | Advion-Interchim | PF-50SIHP-F0012 | pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin |
| formaldehyde | SIGMA-ALDRICH | F8775-25ML | fixing agent for microscopy |
| HEPES | SIGMA-ALDRICH | H8651-25G | buffer for microscopy fixing solution |
| Hexane, mixture of isomers | SIGMA-ALDRICH | 178918-4L | environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid |
| High performance compact mass spectrometer | Advion | expression | Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution |
| High Vac | eppendorf | Vacufuge plus | vacuum aided by centrifugal force and temperature |
| Hydrochloric acid | SIGMA-ALDRICH | 258148-2.5L | corrosive, irritant, colorless liquid |
| hydrochloric acid | SIGMA-ALDRICH | 320331-2.5L | strong acid |
| immersion oil | fisher chemical | 12-365-19 | for microscopy |
| Iodine, resublimed crystals | Alfa Aesar | 41955 | environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals |
| Mestre Mnova | MestreLab Research | software for processing NMR spectra | |
| Methanol | SIGMA-ALDRICH | 439193-4L | flammable, toxic, health hazard, colorless liquid |
| methylene blue | SIGMA-ALDRICH | M9140-25G | microscopy stain for staining cell walls |
| meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood | fisher chemical | B21176X | growth media for Streptococcus pneumoniae |
| meuller-hinton broth | fisher chemical | DF0757-17-6 | growth media for Streptococcus pneumoniae |
| microscope slides | fisher chemical | 22-310397 | for microscopy |
| Microwave Synthesis Labstation | MILESTONE | START SYNTH | device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel |
| NMR tubes | SIGMA-ALDRICH | Z562769-5EA | 5mm NMR tubes 600 MHz |
| Nuclear Magnetic Resonance (NMR) | Bruker | Ascend 400 | large superconducting magnet (400MHz) |
| optochin | fisher chemical | AAB21627MC | ethylhydrocupreine hydrochloride |
| petrie plates | Celltreat | 229695 | for preparing agar plates for bacterial growth |
| Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera | Zeiss | for morphology studies | |
| puriFlash | interchim | XS520plus | flash chromatography purification system |
| resazurin | SIGMA-ALDRICH | R7017-1G | for synergy/antagonism assays |
| Rotary Evaporator | Heidolph | Hei-VAP Value "The Collegiate" | solvent evaporator |
| Sodium bicarbonate | SIGMA-ALDRICH | S6014-500G | irritant, white powder |
| Sodium chloride | fisher chemical | S271-1 | crystalline, colorless |
| Sodium chloride | SIGMA-ALDRICH | S5886-500G | for growth of B.subtilis and preparation of LB media |
| Sodium sulfate | SIGMA-ALDRICH | 7985592-500G | anhydrous, granular, white |
| tryptone | fisher chemical | BP1421-500 | for growth of B.subtilis and preparation of LB media |
| Whitney DG250 Workstation | Microbiology International | DG250 | anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen |
| yeast extract | fisher chemical | BP1422-500 | for growth of B.subtilis and preparation of LB media |
| Zen Lite (blue) software | Zeiss | for acquiring micrographs |
References
- Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Review. 32 (2), 149-167 (2008).
- Munita, J. M., Bayer, A. S., Arias, C. A. Evolving resistance among Gram-positive pathogens. Clinical Infectious Diseases. 61, 48-57 (2015).
- Vollmer, W., Bertsche, U. Murein (peptidoglycan) structure, architecture and biosynthesis in Escherichia coli. Biochimica Biophysica Acta. 1778 (9), 1714-1734 (2008).
- Vollmer, W., Höltje, J. -. V. The architecture of the murein (peptidoglycan) in Gram-negative bacteria: vertical scaffold or horizontal layer(s). Journal of Bacteriology. 186 (18), 5978-5987 (2004).
- Clarke, A. J. Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography. Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).
- Kim, S. J., Chang, J., Singh, M. Peptidoglycan architecture of Gram-positive bacteria by solid-state NMR. Biochimica Biophysica Acta. 1848, 350-362 (2014).
- Koch, A. L., Doyle, R. J. Inside-to-outside growth and turnover of the wall of gram-positive rods. Journal of Theoretical Biology. 117 (1), 137-157 (1985).
- Beeby, M., Gumbart, J. C., Roux, B., Jensen, G. J. Architecture and assembly of the Gram-positive cell wall. Molecular Microbiology. 88 (4), 664-672 (2013).
- Shockman, G. D., Daneo-Moore, L., Kariyama, R., Massidda, O. Bacterial walls, peptidoglycan hydrolases, autolysins, and autolysis. Microbial Drug Resistance. 2 (1), 95-98 (1996).
- Dijkstra, A. J., Keck, W. Peptidoglycan as a barrier to transenvelope transport. Journal of Bacteriology. 178 (19), 5555-5562 (1996).
- Blackman, S. A., Smith, T. J., Foster, S. J. The role of autolysins during vegetative growth of Bacillus subtilis 168. Microbiology. 144, 73-82 (1998).
- Misra, G., Rojas, E. R., Gopinathan, A., Huang, K. C. Mechanical consequences of cell-wall turnover in the elongation of a Gram-positive bacterium. Biophysical Journal. 104 (11), 2342-2352 (2013).
- Wheeler, R., et al. Bacterial cell enlargement requires control of cell wall stiffness mediated by peptidoglycan hydrolases. mBio. 6 (4), 00660 (2015).
- Taguchi, A., Kahne, D., Walker, S. Chemical tools to characterize peptidoglycan synthases. Current Opinion in Chemical Biology. 53, 44-50 (2019).
- Welsh, M. A., Schaefer, K., Taguchi, A., Kahne, D., Walker, S. Direction of chain growth and substrate preferences of shape, elongation, division, and sporulation-family peptidoglycan glycosyltransferases. Journal of the American Chemial Society. 141 (33), 12994-12997 (2019).
- Rubino, F. A., et al. Detection of transport intermediates in the peptidoglycan flippase MurJ identifies residues essential for conformational cycling. Journal of the American Chemical Society. 142 (12), 5482-5486 (2020).
- Sjodt, M., et al. Structure of the peptidoglycan polymerase RodA resolved by evolutionary coupling analysis. Nature. 556 (7699), 118-121 (2018).
- Tiyanont, K., et al. Imaging peptidoglycan biosynthesis in Bacillus subtilis with fluorescent antibiotics. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 103 (29), 11033-11038 (2006).
- Lebar, M. D., et al. Reconstitution of peptidoglycan cross-linking leads to improved fluorescent probes of cell wall synthesis. Journal of the American Chemical Society. 136 (31), 10874-10877 (2014).
- Do, T., Page, J. E., Walker, S. Uncovering the activities, biological roles, and regulation of bacterial cell wall hydrolases and tailoring enzymes. Journal of Biological Chemistry. 295 (10), 3347-3361 (2020).
- Liang, H., et al. Metabolic labelling of the carbohydrate core in bacterial peptidoglycan and its applications. Nature Communications. 8, 15015 (2017).
- DeMeester, K. E., et al. Metabolic incorporation of N-acetyl muramic acid probes into bacterial peptidoglycan. Current Protocol in Chemical Biology. 11 (4), 74 (2019).
- Lazor, K. M., et al. Use of Bioorthogonal N-acetylcysteamine (SNAc) analogues and peptidoglycan O-acetyltransferase B (PatB) to label peptidoglycan. The FASEB Journal. 32, 630 (2018).
- Wang, Y., Leimkuhler-Grimes, C. Fluorescent labeling of the carbohydrate backbone of peptidoglycan to track degradation in vivo. The FASEB Journal. 29, (2015).
- Kuru, E., et al. In probing of newly synthesized peptidoglycan in live bacteria with fluorescent D-amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 51 (50), 12519-12523 (2012).
- Zhou, R., Chen, S., Recsei, P. A dye release assay for determination of lysostaphin activity. Analytical Biochemistry. 171 (1), 141-144 (1988).
- Qiao, Y., et al. Lipid II overproduction allows direct assay of transpeptidase inhibition by β-lactams. Nature Chemical Biology. 13 (7), 793-798 (2017).
- Lebar, M. D., et al. Forming cross-linked peptidoglycan from synthetic Gram-negative lipid II. Journal of the American Chemical Society. 135 (12), 4632-4635 (2013).
- Chen, R., Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. Role of the D-dependent autolysins in Bacillus subtilis population heterogeneity. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5775-5784 (2009).
- Yukie, S., Miki, K., Yoshio, N., Kuniaki, T., Yoshihisa, Y. Identification and characterization of an autolysin-encoding gene of Streptococcus mutans. Infection and Immunity. 73 (6), 3512-3520 (2005).
- Domenech, M., García, E., Moscoso, M. In vitro destruction of Streptococcus pneumoniae biofilms with bacterial and phage peptidoglycan hydrolases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (9), 4144-4148 (2011).
- Horsburgh, G. J., Atrih, A., Williamson, M. P., Foster, S. J. LytG of Bacillus subtilis is a novel peptidoglycan hydrolase: the major active glucosaminidase. 生物化学. 42 (2), 257-264 (2003).
- Vermassen, A., et al. Cell wall hydrolases in bacteria: insight on the diversity of cell wall amidases, glycosidases and peptidases toward peptidoglycan. Frontiers in Microbiology. 10, 331 (2019).
- Martin-Galiano, A. J., Yuste, J., Cercenado, M. I., de la Campa, A. G. Inspecting the potential physiological and biomedical value of 44 conserved uncharacterised proteins of Streptococcus pneumoniae. BMC Genomics. 15, 652 (2014).
- Nayyab, S., et al. Diamide inhibitors of the Bacillus subtilis N-acetylglucosaminidase LytG that exhibit antibacterial activity. ACS Infectioius Diseases. 3 (6), 421-427 (2017).
- Lipski, A., et al. Structural and biochemical characterization of the β-N-acetylglucosaminidase from Thermotoga maritima: Toward rationalization of mechanistic knowledge in the GH73 family. Glycobiology. 25 (3), 319-330 (2014).
- Haubrich, B. A., et al. Inhibition of Streptococcus pneumoniae autolysins highlight distinct differences between chemical and genetic inactivation. bioRxiv. , 300541 (2020).
- Farha, M. A., et al. Inhibition of WTA synthesis blocks the cooperative action of PBPs and sensitizes MRSA to β-lactams. ACS Chemical Biology. 8 (1), 226-233 (2013).
- Lehár, J., et al. Chemical combination effects predict connectivity in biological systems. Molecular Systems Biology. 3 (1), 80 (2007).
- Farha, M. A., et al. Antagonism screen for inhibitors of bacterial cell wall biogenesis uncovers an inhibitor of undecaprenyl diphosphate synthase. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (35), 11048-11053 (2015).
- Palomino, J. C., et al. Resazurin microtiter assay plate: simple and inexpensive method for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (8), 2720-2722 (2002).
- Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1 (2003).
- Arrigucci, R., Pozzi, G. Identification of the chain-dispersing peptidoglycan hydrolase LytB of Streptococcus gordonii. PLoS One. 12 (4), 0176117 (2017).
- Bai, X. -. H., et al. Structure of pneumococcal peptidoglycan hydrolase LytB reveals insights into the bacterial cell wall remodeling and pathogenesis. of Biological Chemistry. 289 (34), 23403-23416 (2014).
- Garcia, P., Gonzalez, M. P., Garcia, E., Lopez, R., Garcia, J. L. LytB, a novel pneumococcal murein hydrolase essential for cell separation. Molecular Microbiology. 31 (4), 1275-1281 (1999).
- Giladi, M., Altman-Price, N., Levin, I., Levy, L., Mevarech, M. FolM, a new chromosomally encoded dihydrofolate reductase in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 185 (23), 7015-7018 (2003).
- Chua, P. R., et al. Effective killing of the human pathogen Candida albicans by a specific inhibitor of non-essential mitotic kinesin Kip1p. Molecular Microbiology. 65 (2), 347-362 (2007).
- Rico-Lastres, P., et al. Substrate recognition and catalysis by LytB, a pneumococcal peptidoglycan hydrolase involved in virulence. Scientific Reports. 5, 16198 (2015).
- Vollmer, W., et al. The cell wall of Streptococcus pneumoniae. Microbiology Spectrum. 7 (3), (2019).
- Massidda, O., Nováková, L., Vollmer, W. From models to pathogens: how much have we learned about Streptococcus pneumoniae cell division. Environmental Microbiology. 15 (12), 3133-3157 (2013).
