Drosophila Passief vermijdingsgedrag als een nieuw paradigma om associatief aversief leren te bestuderen
Summary
Dit werk beschrijft een eenvoudig gedragsparadigma dat de analyse van aversief associatief leren bij volwassen fruitvliegen mogelijk maakt. De methode is gebaseerd op het onderdrukken van het aangeboren negatieve geotaxisgedrag als gevolg van de associatie gevormd tussen een specifieke omgevingscontext en een elektrische schok.
Abstract
Dit protocol beschrijft een nieuw paradigma voor het analyseren van aversief associatief leren bij volwassen vliegen (Drosophila melanogaster). Het paradigma is analoog aan passief vermijdingsgedrag bij laboratoriumknaagdieren waarin dieren leren een compartiment te vermijden waar ze eerder een elektrische schok hebben gekregen. De test maakt gebruik van negatieve geotaxis bij vliegen, wat zich manifesteert als een drang om omhoog te klimmen wanneer ze op een verticaal oppervlak worden geplaatst. De opstelling bestaat uit verticaal georiënteerde bovenste en onderste compartimenten. Bij de eerste proef wordt een vlieg in een lager compartiment geplaatst van waaruit hij meestal binnen 3-15 s naar buiten komt en in het bovenste compartiment stapt waar hij een elektrische schok krijgt. Tijdens de tweede proef, 24 uur later, wordt de latentie aanzienlijk verhoogd. Tegelijkertijd is het aantal schokken afgenomen in vergelijking met de eerste proef, wat aangeeft dat vliegen een langetermijngeheugen vormden over het bovenste compartiment. De opnames van latenties en het aantal schokken kunnen worden uitgevoerd met een telteller en een stopwatch of met een op Arduino gebaseerd eenvoudig apparaat. Om te illustreren hoe de test kan worden gebruikt, werd hier het passieve vermijdingsgedrag van D. melanogaster en D. simulans mannelijk en vrouwelijk gekarakteriseerd. Vergelijking van latenties en aantal schokken onthulde dat zowel D. melanogaster als D. simulans vliegen efficiënt het passieve vermijdingsgedrag leerden. Er werden geen statistische verschillen waargenomen tussen mannelijke en vrouwelijke vliegen. Mannetjes waren echter iets sneller bij het betreden van het bovenste compartiment tijdens de eerste proef, terwijl vrouwtjes een iets hoger aantal schokken kregen in elke retentieproef. Het westerse dieet (WD) verminderde het leren en het geheugen bij mannelijke vliegen aanzienlijk, terwijl vliegoefeningen dit effect compenseerden. Alles bij elkaar biedt het passieve vermijdingsgedrag bij vliegen een eenvoudige en reproduceerbare test die kan worden gebruikt voor het bestuderen van basismechanismen van leren en geheugen.
Introduction
Leren en geheugen is een evolutionair oud aanpassingsmechanisme aan de omgeving, geconserveerd van Drosophila (D.) tot de mens1. De fruitvlieg is een robuust modelorganisme om fundamentele principes van leren en geheugen te bestuderen, omdat het een breed scala aan krachtige genetische hulpmiddelen biedt om intrinsieke moleculaire mechanismen te ontleden2. De baanbrekende genetische screeningstudies, die rutabaga3, amnesiac4 en dunce5-genen identificeerden die cruciaal zijn voor leren en geheugen2, maakten gebruik van olfactorische conditionering omdat de fruitvliegen vertrouwen op hun scherpe reukvermogen om voedsel, potentiële partners te vinden en roofdieren te vermijden6.
Olfactorische conditionering is een populair paradigma geworden om het mechanisme van leren en geheugen te bestuderen, dankzij de introductie van olfactorisch T-doolhof door Tully en Quinn7,8. Vervolgens zijn andere methoden voorgesteld om verschillende soorten leren en geheugen te meten, waaronder visuele conditionering9, baltsconditionering10, aversieve fototaxisonderdrukkingstest11 en wespenblootstellingsconditionering12. De meeste van deze testen hebben echter een complexe opstelling die op maat moet worden gebouwd in een universitaire werkplaats of moet worden gekocht via een leverancier. Het paradigma dat hier wordt beschreven, is gebaseerd op een eenvoudige gedragstest om aversief associatief leren bij vliegen te bestuderen dat gemakkelijk kan worden samengesteld met een paar beschikbare benodigdheden.
Het beschreven paradigma staat gelijk aan passief (of remmend) vermijdingsgedrag bij laboratoriummuizen en ratten waarin dieren leren een compartiment te vermijden waar ze eerder een elektrische voetschok hebben gekregen13. Bij murids is de procedure gebaseerd op hun aangeboren vermijding van fel licht en voorkeur voor donkere gebieden14. Bij de eerste proef wordt het dier in het heldere compartiment geplaatst, van waaruit het dier snel naar buiten gaat en in een donker compartiment stapt, waar een elektrische voetschok wordt afgeleverd. Meestal is een enkele studie voldoende om een solide langetermijngeheugen te vormen, wat resulteert in een aanzienlijk verhoogde latentie 24 uur later. De latentie wordt vervolgens gebruikt als een index van het vermogen van het dier om de associatie tussen de aversieve stimulus en de specifieke omgeving te onthouden15.
Dit werk beschrijft een analoge procedure met behulp van D. als een modelsysteem dat verschillende voordelen biedt ten opzichte van knaagdiermodellen, waaronder kosteneffectiviteit, grotere steekproefomvang, de afwezigheid van regelgevend toezicht en toegang tot krachtige genetische hulpmiddelen16,17. De procedure is gebaseerd op negatief geotaxisgedrag, dat zich manifesteert in de drang van vliegen om omhoog te klimmen wanneer ze op een verticaal oppervlak worden geplaatst18. De opstelling bestaat uit twee verticale kamers. Bij de eerste proef wordt een fruitvlieg in een lager compartiment geplaatst. Van daaruit verlaat het meestal binnen 3-15 s en stapt het in het bovenste compartiment waar het een elektrische schok ontvangt. Tijdens een proef van 1 minuut kunnen sommige vliegen af en toe het bovenste compartiment opnieuw binnendringen, wat resulteert in een extra elektrische schok. Tijdens de testfase, 24 uur later, wordt de latentie aanzienlijk verhoogd. Tegelijkertijd is het aantal schokken verminderd in vergelijking met de eerste dag, wat aangeeft dat vliegen een aversief associatief geheugen vormden over het bovenste compartiment. De latentie, het aantal schokken en de duur en frequentie van verzorgingsaanvallen worden vervolgens gebruikt om het gedrag van dieren en het vermogen om de associatie tussen de aversieve stimulus en de specifieke omgeving te vormen en te onthouden te analyseren. De representatieve resultaten onthullen dat blootstelling aan het westerse dieet (WD) passief vermijdingsgedrag bij mannelijke vliegen aanzienlijk schaadt, wat suggereert dat de WD het gedrag en de cognitie van de vlieg diepgaand beïnvloedt. Omgekeerd verlichtte vliegoefening het negatieve effect van de WD, waardoor passief vermijdingsgedrag werd verbeterd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het vermijden van bedreigende stimuli is een cruciaal kenmerk van adaptief gedrag bij verschillende soorten van C. elegantie tot mens32. Vermijdingsleerprocedures die meestal het ontsnappen van een aversieve gebeurtenis met zich meebrengen, zijn veelgebruikte gedragstaken om leer- en geheugenprocessen bij laboratoriumknaagdieren13 sinds de jaren 197032 te onderzoeken. Bij actieve vermijdingsprocedures wordt een onverschillige stimulus of gec…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door NIH R15ES029673 (AKM).
Materials
| Bloomington Formulation diet | Nutri-Fly | 66-112 | Available from Genesee Scientific Inc., San Diego, CA |
| 1000 µL Blue tip | Fisher | NC9546243 | |
| 17 x 100 mm 14 mL polypropylene culture tube | VWR | 60818-689 | |
| Aduino-based Automatic Kontrol Module | In-house | AKM-007 | This unit is optional. Complete description, schematics, wiring diagram and a code are provided at the ECU Digital Market – https://digitalmarket.ecu.edu/akmmodule |
| Dual-Display 2-Channel Digital Clock/Timer | Digi-Sense | AO-94440-10 | https://www.amazon.com/Cole-Parmer-AO-94440-10-Dual-Display-2-Channel-Jumbo-Digit/dp/B00PR0809G/ref=sr_1_5?dchild=1&keywords=Dual-Display+timer+jumbo&qid=1627660660&sr= 8-5#customerReviews |
| Electronic Finger Counter | N/A | N/A | https://www.amazon.com/gp/product/B01M8IRK6F/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1 |
| Fisherbrand Sparkleen 1 Detergent | Fisher Scientific | 04-320-4 | |
| Fly mouth aspirator | In-house | Prepared as described in reference 19. | |
| Grass S88 stimulator | N/A | N/A | Could be replaced with any stimulator which can provide described parameters |
| Kim-wipes | Fisher Scientific | 06-666 | Kimberly-Clark Professional 34120 |
| Metal block for fly immobilization | In-house | 4 x 13 x 23.5cm aluminum block | |
| Nutiva USDA Certified Organic, non-GMO, Red Palm Oil | Nutiva | N/A | https://www.amazon.com/Nutiva-Certified-Cold-Filtered-Unrefined-Ecuadorian/dp/B00JJ1E83G/ref=sxts_rp_s1_0?cv_ct_cx=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&dchild=1&keywords=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&pd_rd_i=B00JJ1E83G&pd_ rd_r=f35e9d2f-afe4-44b6-afc2-1c9cd705be18&pd_rd_w= R3Zb4&pd_rd_wg=eUv1m&pf_rd_ p=c6bde456-f877-4246-800f-44405f638777&pf _rd_r=M94N11RC7NH333EMJ66Y &psc=1&qid=1627661533&sr=1-1-f0029781-b79b-4b60-9cb0-eeda4dea34d6 |
| Shock tube | CelExplorer | TMA-201 | https://www.celexplorer.com/product_detail.asp?id=217&MainType=110&SubType=8 |
| Stopwatch | Accusplit | A601XLN | https://www.amazon.com/gp/product/B0007ZGZYI/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1 |
| Transparent vinyl tubing (3/4” OD, 5/8” ID) | Lowes | Avaiable from Lowes |
References
- Kandel, E. R., Dudai, Y., Mayford, M. R. The molecular and systems biology of memory. Cell. 157 (1), 163-186 (2014).
- McGuire, S. E., Deshazer, M., Davis, R. L. Thirty years of olfactory learning and memory research in Drosophila melanogaster. Progress in Neurobiology. 76 (5), 328-347 (2005).
- Livingstone, M. S., Sziber, P. P., Quinn, W. G. Loss of calcium/calmodulin responsiveness in adenylate cyclase of rutabaga, a Drosophila learning mutant. Cell. 37 (1), 205-215 (1984).
- Quinn, W. G., Sziber, P. P., Booker, R. The Drosophila memory mutant amnesiac. Nature. 277 (5693), 212-214 (1979).
- Dudai, Y., Jan, Y. N., Byers, D., Quinn, W. G., Benzer, S. dunce, a mutant of Drosophila deficient in learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (5), 1684-1688 (1976).
- Busto, G. U., Cervantes-Sandoval, I., Davis, R. L. Olfactory learning in Drosophila. Physiology. 25 (6), 338-346 (2010).
- Tully, T., Quinn, W. G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology. A: Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 157 (2), 263-277 (1985).
- Wright, N. J. Evolution of the techniques used in studying associative olfactory learning and memory in adult Drosophila in vivo: A historical and technical perspective. Invertebrate Neuroscience. 14 (1), 1-11 (2014).
- Vogt, K., Yarali, A., Tanimoto, H. Reversing stimulus timing in visual conditioning leads to memories with opposite valence in Drosophila. PloS One. 10 (10), 0139797 (2015).
- Koemans, T. S., et al. Drosophila courtship conditioning as a measure of learning and memory. Journal of Visualized Experiments. (124), e55808 (2017).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (49), e2504 (2011).
- Bozler, J., et al. A systems level approach to temporal expression dynamics in Drosophila reveals clusters of long term memory genes. Plos Genetics. 13 (10), 1007054 (2017).
- Atucha, E., Roozendaal, B. The inhibitory avoidance discrimination task to investigate accuracy of memory. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 60 (2015).
- Thiels, E., Hoffman, E. K., Gorin, M. B. A reliable behavioral assay for the assessment of sustained photophobia in mice. Current Eye Research. 33 (5), 483-491 (2008).
- Detrait, E. R., Hanon, E., Dardenne, B., Lamberty, Y. The inhibitory avoidance test optimized for discovery of cognitive enhancers. Behavior Research Methods. 41 (3), 805-811 (2009).
- Piper, M. D. W., Partridge, L. Drosophila as a model for ageing. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1864 (9), 2707-2717 (2018).
- Chalmers, J., et al. A multicomponent screen for feeding behaviour and nutritional status in Drosophila to interrogate mammalian appetite-related genes. Molecular Metabolism. 43, 101127 (2021).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental Gerontology. 40 (5), 386-395 (2005).
- Yang, D. Simple homemade tools to handle fruit flies-Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (149), e59613 (2019).
- Barradale, F., Sinha, K., Lebestky, T. Quantification of Drosophila grooming behavior. Journal of Visualized Experiments. (125), e55231 (2017).
- Denmark, A., et al. The effects of chronic social defeat stress on mouse self-grooming behavior and its patterning. Behavioural Brain Research. 208 (2), 553-559 (2010).
- Kalueff, A. V., et al. Neurobiology of rodent self-grooming and its value for translational neuroscience. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (1), 45-59 (2016).
- Motulsky, H. . Intuitive biostatistics: A nonmathematical guide to statistical thinking. Fourth edition. , (2018).
- Qiao, B., Li, C., Allen, V. W., Shirasu-Hiza, M., Syed, S. Automated analysis of long-term grooming behavior in Drosophila using a k-nearest neighbors classifier. Elife. 7, 34497 (2018).
- Mu, M. D., et al. A limbic circuitry involved in emotional stress-induced grooming. Nature Communications. 11 (1), 2261 (2020).
- Song, C., Berridge, K. C., Kalueff, A. V. Stressing’ rodent self-grooming for neuroscience research. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (9), 591 (2016).
- Wang, C., Chan, J. S., Ren, L., Yan, J. H. Obesity reduces cognitive and motor functions across the lifespan. Neural Plasticity. 2016, 2473081 (2016).
- Lewis, A. R., Singh, S., Youssef, F. F. Cafeteria-diet induced obesity results in impaired cognitive functioning in a rodent model. Heliyon. 5 (3), 01412 (2019).
- Yohn, S. E., Galbraith, J., Calipari, E. S., Conn, P. J. Shared behavioral and neurocircuitry disruptions in drug addiction, obesity, and binge eating disorder: Focus on Group I mGluRs in the mesolimbic dopamine pathway. ACS Chemical Neuroscience. 10 (5), 2125-2143 (2019).
- Lopez-Taboada, I., Gonzalez-Pardo, H., Conejo, N. M. Western Diet: Implications for brain function and behavior. Frontiers in Psychololgy. 11, 564413 (2020).
- Murashov, A. K., et al. Preference and detrimental effects of high fat, sugar, and salt diet in wild-caught Drosophila simulans are reversed by flight exercise. FASEB Bioadvances. 3 (1), 49-64 (2021).
- Krypotos, A. M., Effting, M., Kindt, M., Beckers, T. Avoidance learning: A review of theoretical models and recent developments. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 189 (2015).
- Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. . Encyclopedia of Neuroscience. , 3093 (2009).
- Mery, F., Belay, A. T., So, A. K., Sokolowski, M. B., Kawecki, T. J. Natural polymorphism affecting learning and memory in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (32), 13051-13055 (2007).
- Tan, Y., Yu, D., Pletting, J., Davis, R. L. Gilgamesh is required for rutabaga-independent olfactory learning in Drosophila. Neuron. 67 (5), 810-820 (2010).
- Ögren, S. O., Stiedl, O., Stolerman, I. P. . Encyclopedia of Psychopharmacology. , 960-967 (2010).
