Ex vivo Leberperfusion durch die Portalader in der Maus
Summary
Das Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Resektion einer intakten Mausleber für Stoffwechselstudien durch Pfortaderperfusion.
Abstract
Stoffwechselerkrankungen wie Diabetes, Prädiabetes, nicht-alkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD) und nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH) werden immer häufiger. Ex-vivo-Leberperfusionen ermöglichen eine umfassende Analyse des Leberstoffwechsels unter Verwendung von Kernspinresonanz (NMR) unter Ernährungsbedingungen, die streng kontrolliert werden können. Da In-silico-Simulationen nach wie vor ein primär theoretisches Mittel zur Beurteilung von Hormonwirkungen und den Auswirkungen pharmazeutischer Interventionen sind, bleibt die durchblutete Leber eines der wertvollsten Testumgebungen für das Verständnis des Leberstoffwechsels. Da diese Studien grundlegende Einblicke in die Leberphysiologie geben, müssen die Ergebnisse genau und reproduzierbar sein. Der größte Faktor für die Reproduzierbarkeit der Ex-vivo-Leberperfusion ist die Qualität der Operation. Daher haben wir eine organisierte und optimierte Methode eingeführt, um Ex-vivo-Mausleberperfusionen im Rahmen von In-situ-NMR-Experimenten durchzuführen. Wir beschreiben auch eine einzigartige Anwendung und diskutieren häufige Probleme, die in diesen Studien aufgetreten sind. Der übergeordnete Zweck besteht darin, einen unkomplizierten Leitfaden für eine Technik zu geben, die wir über mehrere Jahre verfeinert haben und die wir als den goldenen Standard für die Erzielung reproduzierbarer Ergebnisse bei Leberresektionen und Perfusionen im Rahmen von In-situ-NMR-Experimenten betrachten. Der Abstand zum Zentrum des Feldes für den Magneten sowie die Unzugänglichkeit des Gewebes für Eingriffe während des NMR-Experiments machen unsere Methoden neuartig.
Introduction
Ex-vivo-Perfusionen sind entscheidend für die Untersuchung des Leberstoffwechsels, und die Perfusion durch die Pfortader ist der Standard für diese Studien. Um den Leberstoffwechsel isoliert zu untersuchen, muss die Leber aus dem Körper heraus reseziert werden, um Komplikationen zu vermeiden, die sich aus dem Stoffwechsel in anderen Organen (d.h. dem Ganzkörperstoffwechsel) ergeben, und um die Hormonverfügbarkeit (Insulin, Glucagon usw.) zu kontrollieren. Dieser Ansatz kann für das Verständnis der Auswirkungen von Krankheiten wie Diabetes, NAFLD und NASH auf den Leberstoffwechsel sowie für Mechanismen der Arzneimittelwirkung unerlässlich sein. Dieser Artikel dient als Leitfaden für die hepatische Resektion und Perfusion. Wir haben ein optimiertes Verfahren entwickelt, um diese metabolischen Leberstudien mit ausreichender Strenge und Reproduzierbarkeit durchzuführen. Wird die Operation nicht korrekt durchgeführt, kommt es zu einer ausgeprägten Variabilität der erhaltenen Stoffwechseldaten. Wir beschreiben eine organisierte Methode zur Durchführung von Portalvenenkatheterisierung und Leberresektion im Rahmen von Stoffwechselstudien in situ in einem Kernspinresonanzspektrometer (NMR), wie in der Literatur 1,2,3,4,5 beschrieben.
Derzeit gibt es keine Literatur, die eine ex vivo hepatische Perfusion unter Verwendung einer Glassäule innerhalb einer NMR beschreibt. Es gibt auch keine Video- oder Textpublikation, die ein klares Beispiel dafür liefert, wie das Verfahren mit der Mausleber durchgeführt wird, insbesondere um zu demonstrieren, wie man die Pfortader katheterisiert, eine Leber reseziert, überträgt und die Leber an eine Glassäule hängt. Da die gentechnisch veränderte Maus allgegenwärtig zur Untersuchung des Leberstoffwechsels eingesetzt wird, ist dies ein wesentliches Verfahren, das eine vollständige Beschreibung verdient. Leberperfusionsoperationen sind nicht neu, aber dieser Artikel ist eine Goldstandardmethode, begleitet von einem Video, das die in diesem Papier beschriebene technische Exzellenz demonstriert, um allen zu helfen, die an diesem Verfahren interessiert sind. Die hier vorgestellte Methode würde am besten auf den Echtzeitstoffwechsel angewendet werden, um die Funktion und den Umsatz von Metaboliten in Krankheitsmodellen nachzuweisen.
Diese Methode verwendet eine 100 cm große, wasserummantelte Glassäule, die es der Leber ermöglicht, am Boden der Kanüle zu hängen, die durch Perfusat in einem NMR-Röhrchen eingekapselt ist. Erhitztes Wasser im Glasmantel wird verwendet, um die perfusatierte Temperatur zu kontrollieren. Ein dünnschichtiger Oxygenator wird zur pH-Kontrolle mit 95%/5% O 2/CO2 unter Druck gesetzt. Durch die Verwendung von drei separaten Pumpen wird die perfusate Säulenhöhe eingestellt, die der Leber einen konstanten Druck verleiht. Durchflussraten werden nicht über die Anwendung von konstantem Druck hinaus gesteuert (Abbildung 1). Um zu bestätigen, dass die Leber richtig funktioniert, werden Sauerstoffmessungen zusammen mit den Durchflussraten durchgeführt. In unseren Händen führt diese Reihe von Voraussetzungen zu hochgradig wiederholbaren NMR-Experimenten zur Beurteilung der Stoffwechselfunktion der Leber.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser chirurgische Eingriff ist eine Herausforderung und erfordert umfangreiche Übungen, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Isofluran und Trägergas sollten bei Bedarf angepasst werden, um die Lebensfähigkeit des Tieres während des chirurgischen Eingriffs so weit wie möglich zu erhalten. Umwelt, Tageszeit, Alter, Gewicht und einige andere Faktoren beeinflussen die Anästhesie. Gewicht, Ernährung, Stamm der Mäuse und Alter könnten die Operation beeinflussen, da der Fettaufbau die Visualisierung der Pfortad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die Finanzierung der National Institutes of Health (R01-DK105346, P41-GM122698, 5U2C-DK119889) unterstützt. Ein Teil dieser Arbeit wurde im McKnight Brain Institute an der Advanced Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy (AMRIS) Facility des National High Magnetic Field Laboratory durchgeführt, die von der National Science Foundation Cooperative Agreement No. DMR-1644779 und der Bundesstaat Florida.
Materials
| 1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| 100 cm Water Jacketed Glass Column | N/A | N/A | Custom Made |
| 2-0 Silk Suture | Braintree Scientific | N/A | |
| 22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety | Terumo | SRFF2225 | |
| 23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26407 | |
| 27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26426 | |
| 4×4 in. Surgical Platform | N/A | N/A | Custom Made |
| 70% Alcohol Wipe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Circulating Water Bath | MS Lauda | N/A | Model no longer manufactured |
| Cotton Tip Applicator | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 " | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Scientific Tools | 11251-35 | |
| Dumont #7 – Fine Forceps | Fine Scientific Tools | 11274-20 | |
| Hemostats | Fine Scientific Tools | 13015-14 | |
| Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL | RX Generics | 71288-0402-02 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 14043-0704-06 | |
| Lidocaine HCl 2% | VEDCO Inc. | 50989-0417-12 | |
| Membrane-Thin-Layer Oxygenator | Radnoti | N/A | |
| Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 " | Roboz | RS-6013 | |
| Oxygen Meter System | Hanstech Instruments Ltd. | N/A | |
| Saline 0.9% Solution | N/A | N/A | Saline is made in lab |
| Scale | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Variable Speed Analog Console Pump Systems | Cole Palmer | N/A | Models are custom per application |
| Weigh boats | N/A | N/A | Non-specific Brand |
References
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