CD-spectroscopie om DNA-eiwitinteracties te bestuderen

Circulair dichroïsme (CD) is een spectroscopische techniek die vertrouwt op de inherente chiraliteit van biologische macromoleculen die leidt tot differentiële absorptie van rechtshandig en linkshandig circulair gepolariseerd licht. Deze differentiële absorptie staat bekend als circulair dichroïsme. De techniek kan daarom worden gebruikt om de conformatie van biologische macromoleculen, zoals eiwitten en DNA, die beide chirale ^{centra bevatten1,2} af te bakenen.

Elektromagnetische golven bevatten zowel elektrische als magnetische componenten. Zowel het elektrische als het magnetisch veld oscilleren loodrecht op de richting van de golfvoortplanting. In het geval van ongepolariseerd licht oscilleren deze velden in vele richtingen. Wanneer het licht circulair gepolariseerd is, worden twee elektromagnetische velden verkregen met een faseverschil van 90° ten opzichte van elkaar. Chirale moleculen vertonen een cirkelvormige optische rotatie (birefringence) zodanig dat ze het rechtshandige circulair gepolariseerde licht en het linkshandige circulair gepolariseerde licht in verschillende mate zullen ^absorberen3. Het resulterende elektrische veld zal worden getraceerd als een ellips, een functie van de golflengte. Het CD-spectrum wordt dus geregistreerd als ellipticiteit (q) en de gegevens worden gepresenteerd als Mean Residue Ellipticity als functie van golflengte.

In het geval van eiwitten is de Cα van aminozuren (behalve glycine) chiraal, en dit wordt benut door CD-spectroscopie om de secundaire structuur van dit macromolecuul4 te bepalen. De CD-spectra van eiwitmoleculen worden meestal geregistreerd in het Verre UV-bereik. α-spiraalvormige eiwitten hebben twee negatieve banden bij 222 nm en 208 nm en één positieve piek bij 193 ^nm4. Eiwitten met anti-parallelle β-sheet secundaire structuur vertonen een negatieve piek bij 218 nm en een positieve piek bij 195 ^nm4. Eiwitten met ongeordende structuren vertonen een lage ellipticiteit in de buurt van 210 nm en een negatieve piek bij 195 ^nm4. De goed gedefinieerde piek/banden voor verschillende secundaire structuren maken CD dus een handig hulpmiddel om de conformatieveranderingen op te helderen die optreden in de secundaire structuur van de eiwitten tijdens denaturatie en ligandbinding.

Nucleïnezuren hebben drie bronnen van chiraliteit: het suikermolecuul, de heliciteit van de secundaire structuur en de tertiaire ordening van DNA op lange afstand in de ^omgeving5,6. De CD-spectra van nucleïnezuren worden meestal geregistreerd in het bereik van 190 tot 300 ^nm5,6. Elke conformatie van DNA geeft, net als eiwitten, een karakteristiek spectrum, hoewel de pieken / banden met enige mate kunnen variëren als gevolg van oplosmiddelomstandigheden en verschillen in DNA-sequenties7. B-DNA, de meest voorkomende vorm, wordt gekenmerkt door een positieve piek rond 260-280 nm en een negatieve piek rond 245 ^nm6. De pieken/banden van B-vorm DNA zijn over het algemeen klein omdat de basenparen loodrecht staan op de dubbele helix, waardoor het molecuul zwakke chiraliteit krijgt. A-DNA geeft een dominante positieve piek bij 260 nm en een negatieve piek rond 210 ^nm6. Z-DNA, de linkshandige helix, geeft een negatieve band bij 290 nm en een positieve piek rond 260 ^nm6. Dit DNA geeft ook een extreem negatieve piek bij 205 ^nm6.

Naast deze conformaties kan DNA ook triplexen, quadruplexen en haarspeldbochten vormen, die allemaal kunnen worden onderscheiden door CD-spectroscopie. De parallelle G-quadruplex geeft een dominante positieve band bij 260 nm, terwijl de anti-parallelle G-quadruplex een negatieve band geeft bij 260 nm en een positieve piek bij 290 nm, waardoor het gemakkelijk is om onderscheid te maken tussen de twee vormen van quadruplexstructuren6. Triplexen geven geen karakteristiek ^spectrum8. De spectra van een 36 nucleotide-lang DNA met de potentie om een intramoleculaire triple helix te vormen met G.G.C en T.A.T basenparen in aanwezigheid van Na⁺ vertonen bijvoorbeeld een sterke negatieve band bij 240 nm en een brede positieve piek. De brede positieve piek toont bijdragen op 266, 273 en 286 nm. Hetzelfde oligonucleotide in aanwezigheid van Na⁺ en Zn⁺ vertoont vier negatieve banden (213, 238, 266 en 282 nm) en een positieve piek bij 258 nm. De spectra van triplex-DNA kunnen dus variëren afhankelijk van de zoutcondities8.

Naast deze conformaties hebben CD-spectra de identificatie van een andere vorm van DNA mogelijk gemaakt, X-DNA genaamd. X-DNA wordt gevormd wanneer de DNA-sequentie alternatieve adenine- en thymineresiduen bevat. De CD-spectra van X-DNA bevatten twee negatieve pieken bij 250 en 280 nm. Er is zeer weinig informatie beschikbaar over X-DNA, hoewel er is gespeculeerd dat het functioneert als een gootsteen voor positieve supercoiling6,9. Veranderingen in CD-spectra kunnen ook details onthullen over ligand-eiwitinteracties en zijn daarom toegevoegd aan het arsenaal aan moleculaire methoden voor het detecteren van geneesmiddel-eiwitinteracties10,11,12,13,14. CD-spectra zijn ook gebruikt om de veranderingen in de secundaire structuur van eiwitten tijdens het vouwproces te ^volgen15. Op dezelfde manier kunnen CD-spectra ook worden gebruikt voor het onderzoeken van ligand-DNA-interacties16,17.

CD-spectroscopie is dus een eenvoudige, goedkope methode om onderscheid te maken tussen de verschillende vormen van DNA-conformatie, op voorwaarde dat er toegang is tot niet-zo-goedkope apparatuur en software. De methode is buitengewoon gevoelig en snel. Het vereist slechts een kleine hoeveelheid DNA, waardoor het een voorsprong heeft op de alternatieve techniek van nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie. Titraties met liganden en substraten zijn ook gemakkelijk uit te voeren. De belangrijkste beperking is dat het DNA zeer zuiver moet zijn. Het is raadzaam om polyacrylamide gel elektroforese (PAGE) -gezuiverd DNA te gebruiken.

De informatie verkregen door CD-spectra is voornamelijk gebruikt om eiwitstructurele kenmerken af te leiden en om verschillende DNA-conformers te identificeren. In deze studie zijn CD-spectra gebruikt om de resultaten van een in vivo Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) experiment te integreren om af te bakenen of het eiwit van belang / voorspelde transcriptiefactor een conformatieverandering kan teweegbrengen in het promotorgebied van zijn effectorgenen. Deze samenwerking helpt bij de voortgang van traditionele CD-spectroscopische technieken door het mechanisme van transcriptieregulatie te voorspellen door de voorspelde transcriptiefactor op en rond de transcriptiestartplaats (TSS) van een promotor.

Chromatineremodellering is een goed gedefinieerd mechanisme waarvan bekend is dat het DNA-metabolische processen reguleert door het dicht opeengepakte chromatine toegankelijk te maken voor verschillende regulerende factoren zoals transcriptiefactoren, componenten van DNA-replicatie of schadehersteleiwitten. De ATP-afhankelijke chromatine-remodelers, ook bekend als de SWI / SNF-familie van eiwitten, zijn belangrijke remodeler-eiwitten die aanwezig zijn in eukaryote ^cellen18,19. Fylogenetische clustering heeft de SWI/SNF-familie van eiwitten ingedeeld in 6 ^subgroepen20: Snf2-like, Swr1-like, SSO1653-like, Rad54-like, Rad5/16-like en distant. SMARCAL1, het eiwit van belang in deze studie, behoort tot de verre ^subgroep20. Dit eiwit is gebruikt om de manier van transcriptionele regulatie te onderzoeken met behulp van CD-spectroscopie.

Van de meeste leden van de ATP-afhankelijke chromatineremodelleringseiwitten is aangetoond dat ze nucleosomen herpositioneren of uitzetten of histonvariantuitwisseling op een ATP-afhankelijke manier ^{bemiddelen21,22}. Van sommige leden van deze familie is echter niet aangetoond dat ze nucleosomen hermodelleren, bijvoorbeeld SMARCAL1. Hoewel studies hebben aangetoond dat SMARCAL1 associeert met polyteenchromosomen, ontbreekt experimenteel bewijs met betrekking tot het vermogen om nucleosomen te ^{hermodelleren23}. Daarom werd gepostuleerd dat SMARCAL1 transcriptie kan reguleren door de conformatie van ^DNA24 te veranderen. CD-spectroscopie bood een eenvoudige en toegankelijke methode om deze hypothese te valideren.

SMARCAL1 is een ATP-afhankelijk chromatineremodelleringseiwit dat voornamelijk functioneert als een gloeiende helicase25,26,27. Het is gepostuleerd om transcriptie te moduleren door de DNA-conformatie te ^{hermodelleren24}. Om deze hypothese te testen, werd de rol van SMARCAL1 bij het reguleren van gentranscriptie tijdens doxorubicine-geïnduceerde DNA-schade bestudeerd. In deze studies werd SMARCAL1 gebruikt voor in vivo analyse en ADAAD voor in vitro assays28,29. Eerdere studies hebben aangetoond dat ADAAD DNA kan herkennen op een structuurafhankelijke maar sequentie-onafhankelijke ^manier30,31. Het eiwit bindt optimaal aan DNA-moleculen met dubbelstrengs naar enkelstrengs overgangsgebieden, vergelijkbaar met stamlus-DNA, en hydrolyseert ATP ^30,31.

In vivo experimenten toonden aan dat SMARCAL1 de expressie van MYC, DROSHA, DGCR8 en DICER reguleert door zich te binden aan de promotorregio’s28,29. Het interactiegebied werd geïdentificeerd door ChIP-experimenten28,29. De ChIP-techniek wordt gebruikt om de interactie van een eiwit met zijn verwante DNA in de cel te analyseren. Het doel is om te bepalen of specifieke eiwitten, zoals transcriptiefactoren op promotors of andere DNA-bindingsplaatsen, gebonden zijn aan specifieke genomische gebieden. Het eiwit gebonden aan DNA wordt eerst verknoopt met behulp van formaldehyde. Dit wordt gevolgd door isolatie van het chromatine. Het geïsoleerde chromatine wordt afgeschoren tot 500 bp-fragmenten door ultrasoonapparaat of nucleasevertering, en het eiwit gebonden aan DNA wordt immunoprecipiteerd met behulp van antilichamen die specifiek zijn voor het eiwit. De cross-linking wordt omgekeerd en het DNA wordt geanalyseerd met behulp van polymerasekettingreactie (PCR) of kwantitatieve real-time PCR.

De ChIP-resultaten leidden tot de hypothese dat SMARCAL1 mogelijk transcriptionele regulatie bemiddelt door een conformatieverandering in de promotorregio’s van deze genen te induceren. QGRS mapper en Mfold software werden gebruikt om het potentieel van deze promotorregio’s te identificeren om secundaire structuren te ^vormen28,29. QGRS mapper wordt gebruikt voor het voorspellen van G-quadruplexes32, terwijl ^Mfold33 het vermogen van een sequentie analyseert om secundaire structuren zoals stamlussen te vormen.

Na secundaire structuuranalyse werden verdere in vitro experimenten uitgevoerd met recombinant 6X His-tagged Active DNA-dependent ATPase A Domain (ADAAD), de runderhomologe van SMARCAL1, gezuiverd van Escherichia ^coli34. ATPase-testen werden uitgevoerd met behulp van ADAAD om vast te stellen dat de geïdentificeerde DNA-sequenties als effectoren konden ^{fungeren28,29}. Ten slotte werd CD-spectroscopie uitgevoerd om de conformatieveranderingen te volgen die door ^ADAAD28,29 in het DNA-molecuul werden geïnduceerd.

Om te bewijzen dat de ATPase-activiteit van het eiwit essentieel was voor het induceren van een conformatieverandering in het DNA-molecuul, werd ofwel ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) toegevoegd aan chelaat Mg ⁺² of Active DNA-afhankelijk ATPase A Domain Inhibitor Neomycin (ADAADiN), een specifieke remmer van het SWI / SNF-eiwit, werd ^{toegevoegd35,36} . Deze CD-spectroscopische techniek kan worden gebruikt met elk gezuiverd eiwit dat is aangetoond door ChIP of een andere relevante test om te binden aan een voorspeld genomisch gebied van een promotor.