Melanogaster drosophila Protocolo de injeção de larvas
Summary
As moscas adultas de Drosophila melanogaster têm sido amplamente utilizadas como organismos modelo para investigar os mecanismos moleculares subjacentes às respostas imunes inatas antimicrobianas e estratégias de infecção microbiana. Para promover o estágio da larva D. melanogaster como um sistema modelo adicional ou alternativo, uma técnica de injeção larval é descrita.
Abstract
O uso de modelos não convencionais para estudar imunidade inata e virulência patógena fornece uma alternativa valiosa aos modelos mamíferos, que podem ser caros e levantar questões éticas. Modelos não convencionais são notoriamente baratos, fáceis de manusear e cultura, e não tomam muito espaço. Eles são geneticamente favoráveis e possuem sequências completas de genoma, e seu uso não apresenta considerações éticas. A mosca-das-frutas Drosophila melanogaster, por exemplo, forneceu grandes insights sobre uma variedade de pesquisas de comportamento, desenvolvimento, metabolismo e imunidade. Mais especificamente, d. melanogaster moscas adultas e larvas possuem várias reações de defesa inatas que são compartilhadas com animais vertebrados. Os mecanismos que regulam as respostas imunológicas têm sido revelados principalmente através de estudos genéticos e moleculares no modelo D. melanogaster . Aqui é fornecida uma nova técnica de injeção larval, que promoverá ainda mais investigações de processos imunológicos inatos em larvas de D. melanogaster e explorará a patogênese de uma ampla gama de infecções microbianas.
Introduction
O melanogaster de Drosophila tem sido imensamente utilizado em pesquisas biológicas e biomédicas por várias décadas, uma vez que o sofisticado conjunto de ferramentas genéticas e moleculares tem evoluído constantemente para análise de uma ampla gama de estudos1,2,3,4. Os aspectos evolutivamente conservados do desenvolvimento, da homeostase e da imunidade inata em D. melanogaster tornaram-no um valioso organismo modelo para estudar várias doenças humanas e insetos5,6. Notavelmente, o papel fundamental do modelo D. melanogaster para estudar imunidade tem sido em grande parte exemplificado em estudos de moscas adultas. No entanto, estudos de larvas de D. melanogaster também contribuíram para o conhecimento atual e exploraram principalmente as respostas imunes celulares, especificamente para infecções por vespas e nematoides que ocorrem através da cutícula de inseto7,8, 9,10. As larvas de melanogaster de Drosophila possuem três tipos diferentes de células sanguíneas, coletivamente chamadas de hemócitos: plasmatócitos, células cristalinas e lamellocitos11,12,13. Essas células podem montar uma série de respostas imunes quando as larvas de D. melanogaster são infectadas com patógenos como bactérias, fungos, vírus e parasitas14,15,16. As respostas imunes celulares incluem o engolamento direto (fagocitose) de pequenas moléculas ou bactérias, melanização, encapsulamento de patógenos maiores, como ovos parasitoides, e produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e sintetizadores de óxido nítrico (NOS)17,18,19.
Em contraste, menos estudos foram publicados sobre o uso do modelo larval D. melanogaster para analisar respostas imunes humorais. Isso se deve principalmente à aplicação de ensaios alimentares para infecção oral de larvas D. melanogaster e vários desafios associados a larvas de microinjeção, incluindo o manuseio preciso de larvas e o uso adequado do microacle, especialmente durante a penetração20,21. Assim, o conhecimento limitado da infecção larval e das dificuldades técnicas (ou seja, alta mortalidade) têm dificultado o uso do modelo larval de D. melanogaster. Um modelo larval terá o potencial de identificar novos mecanismos moleculares que fornecerão mais insights sobre as interações hospedeiro-patógeno e a indução de respostas imunes inatas específicas de hospedeiro contra infecções patogênicas.
Aqui um protocolo simples e eficiente que pode ser usado para injetar larvas D. melanogaster com vários patógenos, como bactérias, é descrito em detalhes. Em particular, as larvas de D. melanogaster são usadas para injeções com o patógeno humano Photorhabdus asymbiotica e as bactérias não patogênicas Escherichia coli. Este método pode ser usado para a manipulação e análise das respostas imunes de D. melanogaster a várias infecções microbianas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Drosophila melanogaster está entre os modelos mais valiosos e experimentalmente manipulados usados para investigações de imunidade inata e patogênese de várias infecções microbianas. Isso se deve ao seu ciclo de vida simples e rápido, simples manutenção em um laboratório, genética evolutiva bem estabelecida e diversa caixa de ferramentas genéticas. Métodos anteriores de injeções de larvas D. melanogaster, como o uso de um dispositivo microfluido híbrido ou um micromanipulador narishige,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos aos membros do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade George Washington (GWU) pela leitura crítica do manuscrito. GT foi apoiado através de uma bolsa de verão Harlan da GWU. Todas as figuras gráficas foram feitas usando BioRender.
Materials
| Fly Food B (Bloomington Recipe) | LabExpress | 7001-NV | Food B, in narrow vials, 100 vials/tray |
| 100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable | VWR | 25384-342 | Diameter 100 x 15 mm |
| 60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable | VWR | 25384-092 | Diameter 60 x 15 mm |
| Glass capillaries | VWR | 53440-186 | |
| Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle | VWR | 28450-150 | Diameter 150 mm |
| Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet | ESCO | LA2-4A2-E | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Mineral oil | Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific | 31911-A1 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| Narrow Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-109 | |
| Needles, hypodermic | VWR | 89219-316 | 22 G, 25 mm |
| Next Generation Micropipette Puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200tab |
| Prism | GraphPad | Version 8 | |
| Syringes – plastic, disposable | VWR | 76124-652 | 20 mL |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 |
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